A proteína TcExp02H03 apresenta em sua estrutura 3 vezes a assinatura do domínio DUF1126 (Domain of Unknown Function), consistindo especificamente em 35 aminoácidos repetitivos (Figura 5.15). Proteínas que possuem este domínio estão presentes somente em eucariotos. O domínio DUF1126 ainda não possui associação com nenhuma função celular.
Figura 5.15. Resultado da análise da proteína TcExp02H03 pelo banco de famílias protéicas PFAM. Description: descrição do domínio; Entry type: tipo de domínio encontrado; Sequence: tamanho das seqüências, HMM; região modelo usado peelo programa, Bits score e E-valeu: valores estatísticos que demonstram a chance do alinhamento ter ocorrido ao acaso.
O padrão de expressão diferencial observado na figura 5.16 indica que o gene H03 possui uma expressão diferencial entre o estádio epimastigota e tripomastigota sangüínea. A proteína H03 especificamente apresenta cada um dos três domínios com conservações parecidas, que pode ser visualizado na figura 5.35, através do E- value de cada um deles. O alinhamento com as seqüências de tripanosomatídeos mostra que a proteína possui um grau de conservação elevado (figura 5.17).
49
Figura 5.16. Gráfico apresentando os valores em logaritmo (base 2) da expressão do mRNA do gene TcExp02H03 em ensaios por microarranjo. O experimento utilizou dados de quatro experimentos independentes. Epi1 a Epi4: epimastigota; Met1 a Met4: tripomastigota metacíclico; Trp1 a Trp4: tripomastigota sangüínea de cultura; Ama1 a Ama14: amastigota. Os valores de expressão partem do valor zero, representado pela média dos sinais de expressão. Ns: valores de teste t não significativos. Valor do teste F indicado no canto superior direito da figura.
Com intuito de se reconhecer outras proteínas ortólogas de H03, foi realizada uma busca em bancos de dados não redundantes, utilizando os algoritmos BLAST e PSI-BLAST (NCBI). As seqüências protéicas não identificadas como proteína hipotética, são referentes a proteínas ligadoras de cálcio do tipo ef-hand, como a proteína rib74 de Strongylocentrotus purpuratus (figura 5.18), cuja localização predita é no flagelo celular. Esta proteína de relativa baixa identidade com H03 (29%), possui em sua estrutura 3 domínios DUF1126 e um domínio ef-hand e na região C – terminal. Outra proteína de interessante semelhança, a EFCH1 de Homo sapiens (Figura 5.19), de 32% de identidade com a H03, também possui a mesma organização estrutural de rib74. É possível observar no pareamento da figura 5.19 uma segunda região menor de similaridade entre as proteínas. Este pareamento ocorre em regiões livres de domínios, entre a região C–terminal de EFCH1 com a região N–terminal de TcExp02H03.
50
Figura 5.17. Demonstração do alinhamento múltiplo realizado pelo ClustalW com seqüências de tripanossomatídeos próximos ao T.cruzi. Em vermelho: aminoácidos básicos; em roxo: aminoácidos ácidos; em amarelo: prolina; em azul: demais aminoácidos não polares; em laranja: glicina, em abóbora: cisteína; em verde: demais aminoácidos polares não carregados.
51
O alinhamento entre as proteínas rib74, EFCH1 e H03, somado à grande semelhança da organização estrutural entre as proteínas pode indicar uma entre duas hipóteses; a primeira interpretação aponta a proteína H03 como uma ortóloga distante das proteínas rib74 e EFCH1 que, ao se distanciar evolutivamente, acumulou diversas mutações no seu domínio ef-hand ao ponto de que o domínio deixou de existir como uma entidade estrutural e funcional. A outra hipótese nos leva a interpretar a região de identidade (domínio EF-hand) como um possível domínio diferenciado, não sendo reconhecido pelos programas de busca de domínios. Seja qual for a hipótese, é necessário o estudo funcional desta proteína para o entendimento do por que da existência de tal similaridade entre as proteínas em questão e qual é realmente a função do domínio DUF1126. Entretanto indícios da possível funcionalidade deste domínio já podem ser encontrados, uma vez que a proteína ortóloga de H03 fora detectada no proteoma do flagelo de T. brucei por Ralston & Hill (2008).
Figura 5.18. Detalhes sobre a proteína rib74. A: Organização dos domínios da proteína, em verde os domínios DUF1226 e em vermelho o domínio EF-hand. B: Resultado da análise pelo PFAM demonstrando a conservação dos domínios encontrados. C: Alinhamento entre as proteínas TcExp02H03 e rib74 demonstrando a semelhança entre ambas. Imagem adaptada de http://www.ncbi.nlm.nih.gov
52
Figura 5.19. Detalhes sobre a proteína EFCH1. A: Organização dos domínios da proteína, em verde os domínios DUF1226 e em vermelho o domínio ef-hand. B: Resultado da análise pelo PFAM demonstrando a conservação dos domínios encontrados. C: Alinhamento entre as proteínas TcExp02H03 e EFCH1 demonstrando a semelhança entre ambas. Imagem adaptada de http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Apesar de o clone H03 ter passado pelos métodos de seleção, um erro provavelmente ocorreu no isolamento de um dos clones para a expressão. Observando a figura 5.20, a proteína H03 aparentemente está sendo expressa e migra, em gel de poliacrilamida, na altura correta (fração insolúvel, altura esperada: 93 kDa). Porém o Western blot da proteína recombinante purificada, utilizando soro anti-histidina, revela uma marcação com tamanho muito diferente do esperado. Outra dúvida sobre a seleção do clone correto surge ao analisarmos o seqüenciamento do vetor, cuja seqüência obtida não pôde ser montada pelos programas de alinhamento, mesmo sequenciando novamente os clones. Por causa deste possível erro ao selecionar o clone correto para expressão, foi decidido não prosseguir com a análise da possível expressão da proteína H03 nos extratos da metaciclogênese. Resta-nos agora, repetir as clonagens e seleções dos clones corretos, para ser possível gerar um antissoro de confiança.
53
Figura 5.20. Processo de expressão e confirmação da produção de TcExp02H03. M: marcador de tamanho Benchmark; FS: fração contendo proteínas solúveis; FI: fração contendo proteínas insolúveis; W: Western blot utilizando anti histidina contra a fração insolúvel. Tamanho predito para H03: 93,1 kDa.
54
TcExp02H04 – Provável Proteína Promotora de Polimerização de Tubulina
A proteína TcExp02H04 possui domínio p25α mais conhecido como TPPP (tubulin polymerization promoting protein). Esta proteína muito estudada foi identificada pela primeira vez em 1991 em frações purificadas de extratos de cérebro humano, bovino e murino, como uma proteína fosforilada presente em frações específicas de proteína kinase tau (Takahashi et al, 1991). Os estudos sobre sua funcionalidade indicam uma atuação sobre a polimerização de tubulina em células neuronais, estando também interagindo com a mielina de células do sistema nervoso central e com a proteína α-sinucleína, presente nos terminais nervosos (Song et al, 2007). O principal motivo que a leva a ser muito estudada é a sua participação em importantes patologias neurodegenerativas classificadas como α- sinucleinopatias, como a doença de Alzheimer (Attems, 2007), doença de Gaucher (Sidransky, 2004) e atrofia múltipla sistêmica (Dickson, 1999). Apesar dos estudos sobre a funcionalidade o gene H04 foi anotado no genoma de T.cruzi como proteína hipotética.Figura 5.21. Resultado da análise da proteína TcExp02H04 pelo banco de famílias protéicas PFAM. Description: descrição do domínio; Entry type: tipo de domínio encontrado; Sequence: tamanho das seqüências, HMM; região modelo usado peelo programa, Bits score e E-valeu: valores estatísticos que demonstram a chance do alinhamento ter ocorrido ao acaso.
Esta pequena proteína de 16,4 kDa possui o domínio p25α ocupando praticamente toda sua estrutura (Figura 5.21). Observando os resultados do microarranjo, pode-se observar que o gene de H04 aparenta sofrer regulação durante o ciclo de vida passando a ser mais expresso em nível de RNA nos estádios infectivos ao mamífero (embora não seja estatisticamente significante na comparação metacíclico/tripomastigota de cultura celular), tornando este gene um interessante candidato nos estudos de diferenciação celular que ocorrem durante a metaciclogênese (Figura 5.22). Nota-se também que a proteína H04 fora encontrada no proteoma de T.cruzi por Atwood et al. em 2005 (Figura 5.23). A visível discrepância entre a expressão do mRNA e da proteína podem ser um real reflexo da natureza regulatória do tripanosoma, uma vez que elementos pós transcricionais,
55
como a proteína em si, sofrem diferentes formas de regulação, como por exemplo modificações que alterem sua estabilidade na célula. Não se exclui também uma segunda hipótese onde a observação divergente ocorre por motivos técnicos. Os experimentos avaliaram moléculas diferentes, utilizando técnicas diferentes e, portanto, possuem vieses diferentes.
Figura 5.22. Gráfico apresentando os valores em logaritmo (base 2) da expressão do mRNA do gene TcExp02H04 em ensaios por microarranjo. O experimento utilizou dados de quatro experimentos independentes. Epi1 a Epi4: epimastigota; Met1 a Met4: tripomastigota metacíclico; Trp1 a Trp4: tripomastigota sangüínea de cultura; Ama1 a Ama14: amastigota. Os valores de expressão partem do valor zero, representado pela média dos sinais de expressão. Ns: valores de teste t não significativos. Valor do teste F indicado no canto superior direito da figura.
56
Figura 5.23. Gráfico apresentando a presença da proteína TcExp02H04 nos resultados da proteômica realizada por Atwood et al. No eixo Y encontra-se a quantidade de peptídeos encontrados, no eixo X os estádios de vida. Epi: epimastigota, Met: tripomastigota metacíclica, Ama: amastigota, Trip: tripomastigota sangüínea. Adaptado de Atwood et al, 2005
Como pode ser visto pelo alinhamento múltiplo entre a proteína de T. cruzi com a de outros tripanossomatídeos, a conservação é muito alta entre as proteínas deste grupo (Figura 5.24). Esta observação é mais um indício da conservação da função da proteína entre espécies próximas.
Figura 5.24. Demonstração do alinhamento múltiplo realizado pelo ClustalW com seqüências de tripanossomatídeos próximos ao T.cruzi. Em vermelho: aminoácidos básicos; em roxo: aminoácidos ácidos; em amarelo: prolina; em azul: demais aminoácidos não polares; em laranja: glicina, em abóbora: cisteína; em verde: demais aminoácidos polares não carregados.
A proteína expressa é visível, em gel de acrilamida, possuindo tamanho aproximado de 25 kDa. A proteína foi purificada por cromatografia e por eletroeluição (Figura 5.25).
57
Figura 5.25. Processo de expressão e confirmação da produção de TcExp02H04. Esquerda: Processo de expressão e confirmação por Western blot utilizando soro anti histidina contra a fração isolúvel. Direita: Gel de acrilamida demonstrando a purificação da proteína H04 por cromatografia de Níquel. M: marcador de tamanho Benchmark; NI: não induzido; FT: fração total do lisado celular; FI: fração contendo proteínas insolúveis; FS: fração contendo proteínas solúveis; FL: fração de lavagem contendo proteínas não ligadas à resina de Níquel.
Analisando o Western blot dos extratos da metaciclogênese observa-se primeiramente a baixa reatividade do antissoro à proteína. Isto pode ser causado pela baixa quantidade de proteína sendo expressa pelo parasita durante seus estádios celulares, estando presente em maiores quantidades no extrato de tripomastigota metacíclicos (Figura 5.26). Outro fator agravante é a qualidade do antissoro gerado, uma vez que os antissoros empregados no trabalho são purificados por um processo conhecido por reduzir a reatividade.
Figura 5.26. Padrão de expressão da proteína TcExp02H04 durante a metaciclogênese utilizando o soro anti-H04. E3: epimastigotas em 3 dias de cultura; E5: epimastigotas em 5 dias de cultura; S: células sob estresse nutritivo; A3h, A6h, A12h, A18h e A24h: células aderidas após 3, 6, 12, 18 e 24 horas de diferenciação, respectivamente; M: tripomastigotas metacíclicas. Gel carregado com 5 µg de cada extrato protéico (Figura 4.7). Tamanho predito para H04: 16,4 kDa.
58
A imunolocalização da proteína H04 indica alguns grânulos pelo citoplasma, sendo que na maioria das células uma marcação mais forte apresenta-se na região entre o flagelo e o cinetoplasto (Figura 5.27).
Figura 5.27. Padrão de Imunolocalização da proteína TcExp02H04 em epimastigotas. Esquerda: Imagem de campo claro; Direita: Imagem de microscopia ótica de fluorescência. A marcação em verde representa proteínas reconhecidas pelo soro produzido contra proteína TcExp02H04; Marcação em azul demonstra a presença de DNA.
Assim como a imunofluorescência, ensaios preliminares de microscopia eletrônica (Figura 5.28) indicam a presença da proteína H04 no corpo basal da célula, estrutura morfológica e funcionalmente análoga ao centríolo de células mamíferas, exibindo ainda, os mesmos padrões de herança e maturação (Dawe et al, 2007).
59
Figura 5.28: Microscopia eletrônica de transmissão realizada em epimastigotas utilizando o soro anti proteína TcExp02H04. As flechas brancas indicam a presença da proteína no corpo basal da célula, região entre o flagelo e o cinetoplasto. N: núcleo celular; K: cinetoplasto. Aumento de 80.000X.
Os estudos com a proteína H04 indicam que seja possivelmente uma das proteínas envolvidas com a biologia do corpo basal e possivelmente, do flagelo. Melhores indícios da sua função podem ser inferidos através dos ensaios de interação protéica. A análise das reações de imunoprecipitações poderá fornecer novas informações sobre as funções de H04. É importante também investigar os motivos que fazem ser uma proteína mais expressa na fase infectiva ao mamífero em comparação à epimastigotas, e quais as atribuições a sua presença realizam na célula.
60