Os resultados obtidos confirmam estudos prévios (Monteiro et al., 2004; Almeida et al., 2008) sobre a aplicabilidade de dados de sequências do Cit B para análise sobre a genética populacional em triatomíneos, que obtiveram resultados satisfatórios e que
64 mostraram a validade desse gene. As sequencias do fragmento do gene mitocondrial Cit B permitiu analisar a estrutura genética das populações de T. sherlocki.
Monteiro et al. (2004) apresentaram um estudo filogeográfico de T. brasiliensis, utilizando o mesmo fragmento aqui utilizado, onde foi demonstrado alta freqüência de sítios homoplásicos, que esses autores consideraram como sítios hipervariáveis (hot spots), devido ao reconhecimento de mutações independentes para os mesmos sítios.
No presente estudo foram obtidas 439 sequências do fragmento do gene mitocondrial Cit B de populações das espécies T. juazeirensis, T. melanica e T. sherlocki. Nove localidades (Encantado 1, Encantado 2, Santo Inácio 1, Santo Inácio 2, Gentio do Ouro 1, Gentio do Ouro 2, Gentio do Ouro 3, Gentio do Ouro 4 e Gentio do Ouro 5) foram amostradas para T. sherlocki perfazendo um total de 292 amostras. T. juazeirensis foi coletado em quatro localidades (Central, Itaguaçu, Ibipeba e Localidade tipo) perfazendo um total de 100 amostras, enquanto que T. melanica, um total de 47 amostras foram obtidas de três localidades (Olho d’Água, Pesqueiro e Urandi).
Foram encontrados 63 haplótipos nas nove populações de T. sherlocki e uma diversidade haplotípica (Hd) de 0.774. A população que apresentou a maior Hd foi Gentio do Ouro 2 (0.820) e a menor foi Gentio do Ouro 4 (0.602). As populações que ocorrem em localidades sob influência antrópica: Encantado 1 e Santo Inácio 1, apresentaram um valor Hd de 0.819 e 0.665, respectivamente. A população Encantado 1 apresentou maior número de haplótipos, 22, enquanto que na população de Santo Inácio 2 apenas quatro haplótipos foram encontrados. Almeida et al. (2008) encontraram altos valores de diversidade haplotípica para populações silvestres, ruderais, peridomiciliares e domiciliares de T. brasiliensis, 0.93, 0.92, 0.93 e 0.78, respectivamente. Uma alta variabilidade genética tem sido associada com a maior dificuldade para o controle de vetores (Peres de Rojas et al., 2007).
As populações de T. juazeirensis apresentaram baixa diversidade haplotípica e baixo número de haplótipos. A população de Itaguaçu apresentou apenas um haplótipo, mesmo com uma população (número amostral) de nove exemplares. A mais alta diversidade haplotípica foi encontrada para a localidade de Ibipeba (0.665). Mesmo com um número amostral considerável, 34 exemplares, a espécie apresentou baixo número de haplótipos, para todas as populações. A população que apresentou maior número de haplótipos foi a da
65 localidade de Central. Waleckx et al. (2011) mesmo analisando uma população com apenas 10 exemplares encontrou quatro haplótipos e uma Hd de 0.800 para população de T. infestans em La Paz.
Apenas três populações de T. melanica foram analisadas e o maior número de haplótipos encontrado foi na população de Olho d’Água, quatro haplótipos e uma diversidade haplotípica de 0.636.
5.3. Neutralidade e demografia
De acordo com a teoria neutra de mutações, a variação dentro e entre populações ocorre primariamente devido a mutações neutras (Li, 1997). Essa teoria prediz que a maioria das substituições de bases que se tornam fixadas em uma população é neutra sem relação direta com o sucesso reprodutivo (Kimura, 1968; 1983).
O teste de neutralidade seletiva D de Tajima, por exemplo, se baseia no modelo dos sítios infinitos sem recombinação (Kimura, 1968), apropriado para sequências curtas de DNA. O modelo dos sítios infinitos assume que os sítios ao longo de uma sequência de DNA sofrem mutações independentes e irregulares e que a probabilidade de um mesmo sítio sofrer mutações duas vezes é pequena (Epperson, 2003). Esse teste determina se a frequência alélica ajusta-se à expectativa de um modelo neutro, comparando basicamente a relação entre sítios segregantes e diversidade nucleotídica. Assim, a média obtida para o D de Tajima deve se aproximar do zero. Quando os alelos raros contribuem mais para o número de sítios segregantes do que o número de diferenças par-a-par, os valores D de Tajima tornam-se significantes tanto para a positividade (D>0), quanto para a negatividade (D<0). Valores negativos, altos e significantes geralmente estão associados a um alto número de polimorfismos pouco freqüentes (Tajima, 1989).
Os altos valores negativos e significantes para as populações de Santo Inácio 1 e 2 e Gentio do Ouro 3, 4 e 5 revelam um possível desvio da neutralidade. Eventos como expansão populacional, efeito “gargalo de garrafa” ou heterogeneidade nas taxas de mutação podem também gerar tais valores significativos (Tajima, 1993).
66 Outra estimativa desenvolvida para testar a neutralidade muito utilizada é o FS de Fu
(Fu, 1997), também baseado no modelo dos sítios infinitos sem recombinação. Esse modelo é aplicável principalmente quando há excesso de mutações jovens (mutações que ocorreram recentemente, com baixa freqüência e que geram excesso de alelos raros). Fu (1997) notificou que a estatística FS tende a apresentar valores negativos quando existe um excesso
de alelos raros, fornecendo evidências contra a neutralidade de mutações. Entretanto, tal modelo tem sido utilizado como indicador de eventos demográficos (Almeida et al., 2008) para diversos grupos animais, incluindo os triatomíneos.
O teste FS de Fu foi significativo para as populações de Encantado 1 e Gentio do
Ouro 1, 3 e 4, indicando desvio da neutralidade ou eventos de expansão para populações silvestres, o que também foi reportado por Almeida et al. (2008).
Sob o modelo de alelos infinitos, o teste de Chakraborty (1990) aponta se o número de alelos em uma amostragem (possivelmente) heterogênea (resultante de combinações de populações previamente isoladas) é maior do que o número de alelos esperados em amostragem neutra homogênea. O teste de Chakraborty revelou que para todas as populações o número de haplótipos foi maior que o número de haplótipos esperados, apontando para a heterogeneidade nas populações de T. sherlocki.
Para as populações de T. juazeirensis e T. melanica, nenhum valor significativo foi encontrado para os testes D de Tajima, FS de Fu e o teste de Chakraborty. Tal teoria neutra
propõe o equilíbrio entre mutação e deriva.
Piccinali et al. (2009) encontraram valores negativos e significativos para populações de T. infestans provenientes de províncias da Argentina que ilustra perfis distintos de variabilidade genética e história evolutiva para essa espécie.
5.4. Estrutura genética
A combinação de distintos padrões de estruturação genética em escala geográfica, espacial e ecológica representa um cenário complexo nos estudos de genética populacional. Esse perfil já foi sugerido para diversas espécies, entre as quais T. dimidiata, um triatomíneo autóctone no México (Dumonteil et al., 2002; 2004; 2007; Zeledon & Rojas,
67 2006), T. brasiliensis (Almeida et al., 2008) e T. infestans (Picinalli et al.,2009; Waleckx et al., 2011).
No presente estudo foram apresentados dados que revelam a alta diversidade genética de nove populações de T. sherlocki, que apresentaram 63 haplótipos, cujas estruturas populacionais não estavam ligadas a fatores paisagísticos e que revelaram estruturação genética espacial para as populações. Os testes de neutralidade indicam que T. sherlocki encontra-se possivelmente em expansão demográfica, em vista dos valores significativos encontrados. As populações de Encantado 1 e 2 apresentam mais altos coeficientes de diferenciação genética das demais populações de T. sherlocki.
O mtDNA é um marcador sensível a subdivisões populacionais devido ao padrão de herança materna. Se uma população apresenta alguma estruturação espacial ou ecológica, as mensurações de variabilidade genética são, em geral, facilmente detectáveis com o uso desse marcador (Wilson et al., 1985).
Waleckx et al. (2011) utilizaram fragmento do gene mitocondrial Cit B para avaliar a estrutura genética entre populações silvestres de T. infestans, e mostraram ser um marcador altamente polimórfico e útil para estudos de genética populacional em triatomíneos.
As nove populações de T. sherlocki amostradas neste trabalho distam no máximo 18 km uma da outra. Dos nove pontos em que foram coletados os exemplares de T. sherlocki, duas localidades apresentaram insetos no ecótopo domiciliar, Encantado 1 e Santo Inácio 1. A capacidade de dispersão ativa de T. sherlocki é possivelmente limitada devido a presença de asas curtas, que não ultrapassam o sétimo urotergito (Papa et al., 2002). Esse fato pode auxiliar na explicação da deriva geográfica entre populações dessa espécie. Entretanto, Almeida et al. (2012) evidenciaram que T. sherocki apresenta patas significantemente mais longas, o que possivelmente pode compensar a dispersão ambulatória. Entretanto, Almeida et al. (2009) chama a atenção para a existencia de arbustos entre as conexoes rochosas, o que pode funcionar como fator limitante do fluxo génico para este triatomíneo rupestre.
As análises dos valores de FST revelaram valores significativos para a maioria das
populações, mostrando grande diferenciação genética. As populações de Encantado 1 e 2 não mostraram diferenciação significante (FST = -0.00484), ilustrando que nessa localidade
68 encontrados. As duas populações da localidade de Encantado possivelmente apresentam-se isoladas reprodutivamente das demais, por fatores geopaisagísticos, visto que apresentam diferenciação genética significante em todas as populações e haplótipos exclusivos. A maior diferenciação das populações de Encantado é entre a população de Gentio do Ouro 5 (FST = 0.20459), cuja população também apresenta diferenciação significante em todas as
demais populações.
Quando comparada a população de Encantado 1 com a população de Santo Inácio 1, onde as duas apresentam insetos no ecótopo domiciliar, o valor de FST foi significante (FST
= 0.08294). Tal dado indica um possível evento de deriva genética entre essas duas populações, apesar de em ambas as localidades apresentarem exemplares intradomiciliares, que ilustra não haver relação estreita entre essas duas populações. Todos os triatomineos são capazes de invadir o domicilio, entretanto poucos formam colônias intradomiciares. Sob este ponto de vista, o comportamento das populaçãoes de T. sherlocki de ambos os ambientes antropizados é diferente, pois em um ponto (Encantado 1) observa-se um possível processo de domiciliação em curso, ao passo que no segundo (Santo Inácio 1) somente invasões domiciliares são notificadas. Os dados aqui obtidos sugerem que o fator genético possa estar envolvido no processo de domiciliação de T. sherlocki em Encantado 1.
A partir da matriz com os valores de FST construiu-se uma árvore de similaridade
neighbor-joining utilizando parâmetros de distâncias lineares par-a-par que permitiu agrupar as populações de T. sherlocki em três grupos formados pelos conjuntos: Encantado 1 + Encantado 2; Santo Inácio 1 + Gentio do Ouro 3 + Gentio do Ouro 4; e Santo Inácio 2 + Gentio do Ouro 1 + Gentio do Ouro 2 + Gentio do Ouro 5. A incapacidade de dispersão de T. sherlocki, por meio do voo (Almeida et al., 2012) talvez explique a diferenciação genética de acordo com as distâncias geográficas. Entretanto, populações mais distantes geograficamente, como Gentio do Ouro 1 e 2, apresentaram baixa diferenciação genética (FST = 0.05557), o que sugere que as pernas significantemente maiores possam compensar
parcialmente a incapacidade de voo. Desta forma, estes resultados suscitam estudos detalhados de genética de paisagem, como o desenvolvido por (Setiadi et al., 2009) para outros táxons (répteis).
69 Foi realizada uma análise baseada em fatores ecológicos ou paisagísticos onde se agrupou as populações de Encantado 1 e Santo Inácio 1, localidades que apresentaram insetos em áreas antropizadas, para verificar se há alguma relação genética entre as populacões dessas duas localidades no processo de domiciliação de T. sherlocki, e constatou-se que esse agrupamento não apresentou estruturação genética, descartando a hipótese de dispersão passiva.
A análise de variância molecular (AMOVA) confirmou os resultados, mostrando que quando as populações são agrupadas de acordo com as localizações geográficas, o percentual de variação dentro dos grupos (2,83%; Φ SC = 0,03182) foi menor do que
quando agrupadas levando em consideração agrupamentos ecológicos (13,39%; Φ SC =
0,02384Vb), o que ilustra haver estruturação genética espacial entre as populações mostrando não haver identidade genética marcante entre as populações de Encantado 1 e Santo Inácio 1.
A diferenciação genética para a população de Encantado de T. sherlocki, em ambos os sítios, sugere que o fator genético possa estar envolvido no processo de domiciliação, visto pelo fato que em 21% das moradias humanas na comunidade de garimpo foram encontrados ninfas e adultos no intradomicílio, indicando que nessa localidade está ocorrendo um processo de domiciliação de T. sherlocki. O local em que T. sherlocki está inserido causa preocupação no cenário eco-epidemiológico, pois trata-se de um assentamento humano negligenciado em uma comunidade artesã de mineradores de pedras (Almeida et al., 2008; 2012).
As populações de T. juazeirensis foram coletadas em quatro municípios, Central, Ibipeba e Itaguaçu (situadas ao entorno da área de ocorrência de T. sherlocki) e na Localidade tipo para a espécie, correspondente ao município de Juazeiro, nas localidades de Salitre, Curral do Meio e Lagoa Seca. Os valores de FST foram significantes para todas as
localidades de ocorrência de T. juazeirensis. A Localidade tipo apresentou haplótipos exclusivos e mais altos coeficientes de diferenciação com as demais populações de T. juazeirensis, em especial com a população de Itaguaçu (FST = 0.85). Segundo Wright
(1978), valores de FST acima de 0.50 já indicam diferenciação no sentido da especiação.
Portanto, sugere-se aqui que T. juazeirensis possa ser composto por mais de uma unidade evolutiva, ou por unidades em processo de especiação. Ressalta-se que os exemplares
70 foram cuidadosamente checados quanto às suas características taxonômicas e nenhuma variação morfológica foi evidenciada entre os exemplares da região Noroeste Central da Bahia e as populações do município de Juazeiro. A genealogia de T. juazeirensis ilustra consistência na estrutura genética com as populações analisadas revelando haplótipos exclusivos para as populações da Localidade tipo quando comparadas às da região central- noroeste do Estado da Bahia. Apesar do alto coeficiente de diferenciação entre as populações da Localidade tipo e da região Noroeste Central, apenas dois passos mutacionais foram encontrados, o que sugere que o alto FST possa se tratar somente do
isolamento por distância (IBD) (Slatkim, 1985, 1993, 1995).
As populações de T. melanica apresentaram significância nos valores de FST em
todas as populações, com exceção da população de Urandi, que não apresentou significância com as populações de Olho d’Água e Pesqueiro (FST = 0.0565 e 0.0555,
respectivamente). O valor de diferenciação genética entre as populações de Olho d’Água e Pesqueiro foi FST = 0.1782. Todos estes valores estão compatíveis com a variação
intraespecífica definida por Wright (1978) e com o estreito distanciamento físico entre elas (max = 2,5 km).
Seis haplótipos foram encontrados nas populações de T. melanica e a análise da rede genealógica dos haplótipos revelou uma estrutura com sete passos mutacionais. O haplótipo quatro, proveniente da localidade de Olho d’Água, não se relaciona com nenhum outro, fato esse comprovado pela inferência bayesiana, em que tal haplótipo aparece distante dos demais quando os parâmetros de parcimônia são avaliados em 95% (by default). Este achado requer o resequenciamento deste exemplar e a utilização de outros marcadores para confirmação da diversidade.
A inferência bayesiana revelou um agrupamento entre os haplótipos que ocorrem na localidade tipo (haplótipos 7 a 12 e 51) e outro agrupamento entre os haplótipos das localidades de Central, Ibipeba e Itaguaçu (haplótipos 46 a 50). A árvore construída pelos parâmetros de neighbor-joining revelou que as populações de Itaguaçu e Ibipeba são mais próximas do que a população do município de Central.
71 6. Conclusões
• O marcador utilizado (Cit B) foi confirmado com uma resolução satisfatória para estudos de genética de populações para T. juazeirensis, T. melanica e T. sherlocki;
• Sugere-se que a alta diversidade genética e expansão demográfica de T. sherlocki estejam envolvidas no possível processo de adaptação ao ecótopo domiciliar;
• A estruturação genética baseada nas distâncias geográficas mostrou consistência para T. sherlocki;
• As populações de Encantado 1 e Santo Inácio 1 não apresentaram estruturação genética na análise paisagística, sugerindo que as invasões e colonizações domiciliares em Encantado 1 ocorrerem a partir de focos silvestres;
• Visto que o processo de domiciliação ocorre apenas na população Encantado 1, associado ao maior distanciamento genético em relação às demais populações, a possibilidade do fator genético estar envolvido na colonização dos domicílios em Encantado deve ser considerada;
• Os valores dos testes de neutralidade indicam que as populações silvestres de T. juazeirensis e T. melanica encontram-se em equilíbrio, não tendo sido detectado qualquer indício de pressão seletiva, expansão populacional ou efeito gargalo de garrafa;
• Os coeficientes de diferenciação para T. sherlocki e T. melanica foram compatíveis com o esperado entre populações da mesma espécie. Entretanto, para as populações geográficas de T. juazeirensis a divergência genética sugere a possibilidade da existência de espécies crípticas, ou isolamento por distância.
72 7. Referências
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