Foram considerados como ecótopos intradomiciliares os ambientes de unidades domiciliares fechados por portas, compreendendo casas ou anexos, onde principalmente humanos circulam. Nesses ambientes os triatomíneos foram usualmente encontrados refugiados em fendas nas casas de barro, sob camas ou atrás de objetos encostados nas paredes.
Os ecótopos peridomiciliares investigados encontraram-se usualmente dentro de um raio de 50 m das casas, onde animais domesticados dormem ou são criados. Entretanto, não foram capturados insetos no peridomicílio. Momentos antes das coletas houve um trabalho intenso de borrifação domiciliar realizado pelas secretarias de saúde do Estado da Bahia.
No ambiente silvestre nenhum domicílio pôde ser avistado em um raio de aproximadamente 200 m. Animais silvestres foram os mais comumente avistados nos ecótopos onde triatomíneos foram coletados. Um roedor filogeneticamente relacionado com o preá
28
(Lacher, 1981), conhecido vulgarmente como mocó (Kerodon rupestris), foi o animal homeotérmico mais observados entre as rochas.
As investigaçõeos domiciliares foram efetuadas durante o dia, usando desalojantes (neopinamina a 0,2%), quando necessário. Durante o mesmo período e com o mesmo grupo de trabalho da Funasa foram efetuadas capturas noturnas e manuais nas áreas não habitadas.
Os triatomíneos coletados em estádios imaturos foram levados ao laboratório, mantidos em condições controladas de temperatura e umidade (27±2ºC e 60±3% umidade relativa) e alimentados semanalmente em camundongos até a muda imaginal. Os espécimes adultos foram, então, identificados de acordo com as características taxonômicas propostas por Lent & Wygodzinsky (1979), Galvão (1956), Papa et al. (2002), Costa et al. (2006) e Costa & Felix (2007).
Coletas por exaustão nos ambientes inspecionados não resultaram na captura de nenhum exemplar de T. lenti ou T. petrochii, visto que ambos apresentam como área de ocorrência o Estado da Bahia (Galvão et al., 2003). Uma colônia de T. sordida (n=23 exemplares) foi coletada no peridomicílio no município de Central. Além, o número amostral (n<30) e a presença de somente essa população foi insuficiente para qualquer estudo de genética populacional para essa espécie nessa localidade.
As populações de T. sherlocki foram coletadas nas localidades de Encantado e Santo Inácio, município de Gentio do Ouro. As coletas das populações de T. juazeirensis foram efetuadas nos municípios de Itaguaçu, Ibipeba e Central (municípios no entorno da área de distribuição de T. sherlocki), e na Localidade tipo, no município de Juazeiro. T. melanica foi coletada em ambiente silvestre nas localidades de Pesqueiro, Olho d’Água e Urandi. Detalhes das localidades de coletas das populações de T. juazeirensis, T. melanica e T. sherlocki estão ilustradas na Figura 6.
29
As localizações geográficas dos pontos de coleta (Tabela 2) foram obtidas com o uso do programa GPS Trackmaker (Junior, 2007).
Tabela 2. Coordenadas geográficas dos pontos de coleta das populações de T. juazeirensis, T. melanica e T. sherlocki. Latitude Longitude T. sherlocki Encantado 1 -11.186447 -42.764106 Encantado 2 -11.171544 -42.760094 Santo Inácio 1 -11.073122 -42.703490 Santo Inácio 2 -11.049226 -42.718920 Gentio do Ouro 1 -11.026060 -42.718220 Gentio do Ouro 2 -11.092427 -42.707679 Gentio do Ouro 3 -11.123510 -42.664480 Gentio do Ouro 4 -11.137466 -42.731207 Gentio do Ouro 5 -11.081694 -42.764019
30 T. juazeirensis Central -11.133270 -42.133255 Ibipeba -11.640530 -42.017212 Itaguaçu -11.011944 -42.398889 Localidade tipo -9.416656 -40.499897 T. melanica Urandi -14.766665 -42.633305
As populações de T. sherlocki foram coletadas em nove localidades na região de Encantado e Santo Inácio, município de Gentio do Ouro (Figura 7).
Em duas localidades foram encontrados exemplares de T. sherlocki no interior dos domicílios, “Encantado 1” e “Santo Inácio 1”, que correspondem à localidades antropizadas. No entanto, insetos intradomiciliares não foram utilizados para esta análise porque o número de exemplares que chegou vivo ao laboratório foi insuficiente para se formar uma população (n < 10). Além disso, eles foram prontamente encaminhados para outros estudos de prioridade epidemiológica, como estudo da fonte alimentar por meio de ELISA (para verificar se eles se alimentaram de sangue humano) e análise da infecção natural por T. cruzi. Somente na localidade
Encantado 1 Encantado 2 Santo Inácio 1 Santo Inácio 2 Gentio do Ouro 1 Gentio do Ouro 2 Gentio do Ouro 3 Gentio do Ouro 4 Gentio do Ouro 2 -11° 05’ -11° 10’ -42° 45’ -42° 40’ Gentio do Ouro 5
Figura 7. Localidades de coleta das populações de T. sherlocki nomunicípio de Gentio do Ouro, Bahia.
31
de “Encantado 1” são encontrados adultos e ninfas no intradomicílo, o que indica um possível processo de domiciliação da espécie nessa área. Em Santo Inácio 1 foram encontrados apenas exemplares adultos no intradomicílio e segundo a Secretaria de Saúde de Gentio do Ouro, invasões esporádicas por esse vetor são frequentes nessa área (Almeida et al., 2009).
As demais localidades em que capturou-se T. sherlocki foram amostragens estritamente silvestres: “Encantado 2”, “Santo Inácio 2”, “Gentio do Ouro 1”, “Gentio do Ouro 2”, “Gentio do Ouro 3”, “Gentio do Ouro 4” e “Gentio do Ouro 5”, visto que as buscas no intradomicílio foram negativas para o encontro desse vetor nessas localidades.
De acordo com as coordenadas de cada ponto de coleta calculou-se as distâncias geográficas entre as localidades das populações de T. sherlocki (Tabela 3).
Tabela 3. Distâncias geográficas das localidades amostradas das populações de T. sherlocki.
Encantado 1 Encantado 2 Santo In. 1 Santo In. 2 GO 1 GO 2 GO 3 GO 4 Encantado 1 - Encantado 2 1.7 km - Santo In. 1 14.1 km 12.5 km - Santo In. 2 15.9 km 14.2 km 3.1 km - GO 1 18.4 km 16.7 km 5.4 km 2.5 km - GO 2 12.0 km 10.4 km 2.1 km 4.9 km 7.4 km - GO 3 12.9 km 11.7 km 7.0 km 10.1 km 12.2 km 5.8 km - GO 4 6.5 km 4.9 km 7.7 km 9.8 km 12.4 km 5.6 km 7.4 km - GO 5 11.5 km 9.9 km 6.6 km 6.0 km 7.9 km 6.2 km 11.8 km 7.1 km GO: Gentio do Ouro; Santo In.: Santo Inácio.
A localidade de Encantado (Figura 8) caracteriza-se pelo baixo número de habitações, todas construídas de madeira, pedras e folhas de palmeiras. Nessa localidade foram encontradas populações de T. sherlocki em possível processo de domiciliação, uma vez que foram coletadas ninfas e adultos no intradomicílio (Almeida et al., 2009).
32
Nalocalidade de Encantado, município de Gentio do Ouro, Bahia, foi coletado exemplar adulto de T. sherlocki no intradomícílio repleto de sangue (Figura 9).
Figura 8. Ambiente rural da localidade de Encantado na área de coleta de T. sherlocki, com casas construídas de barro e madeira. Foto: Carlos Eduardo Almeida (2009).
33
A localidade de Santo Inácio é um distrito bem estruturado e urbanizado, com a maioria dos domicílios construídos em alvenaria, entretanto, oito casas de taipa (construídas com barro) também são observadas nessa localidade (comunicação pessoal: Carlos Eduardo Almeida, 2009). Em Santo Inácio os exemplares foram coletados em dois pontos: Santo Inácio 1, onde foram registrados pelas Secretarias de Saúde exemplares adultos invadindo o intradomicílio, e Santo Inácio 2, em que foram encontrados exemplares apenas no ambiente silvestre (Figura 10).
Figura 9. Triatoma sherlocki no intradomicílio na localidade de Encantado, município de Gentio do Ouro, Bahia. Foto: Carlos Eduardo Almeida (2009).
34
Segundo a Secretaria de Saúde de Gentio do Ouro, invasões esporádicas por T. sherlocki são frequentes nessa localidade (Almeida et al., 2009), mas colônias intradomiciliares nunca foram registradas, mesmo nas casas de taipa.
Triatoma juazeirensis e T. melanica foram capturadas exclusivamente no ambiente silvestre e rochoso.
Três pontos de coletas foram amostrados para a espécie T. melanica no município de Urandi, localizado no extremo Sul do Estado da Bahia, próximo à divisa com o Estado de Minas Gerais (Figura 5). Duas populações foram obtidas em pontos distantes do centro urbano, denominadas: “Olho d’Água” e “Pesqueiro”, e a terceira (“Urandi” sensu strictu), mais próxima ao centro da cidade. O mapa abaixo ilustra a região de coleta da espécie T. melanica (Figura 11). Figura 10. Ambiente silvestre característico para a presença de T. sherlocki na localidade de Santo Inácio, Bahia. Foto: Carlos Eduardo Almeida (2009).
35
As coletas de T. melanica foram realizadas exclusivamente no ambiente silvestre e rochoso (Figura 12). T. melanica T. juazeirensis entorno Urandi T. sherlocki -44° 00’ -43° 00’ -42° 00’ -11° 00’ -12° 00’ -13° 00’ -14° 00’
Figura 11. Região de coleta das populações de T. melanica no município de Urandi, Bahia com referência aos locais de coletas de T. sherlocki e T. juazeirensis.
-15° 00’ -45° 00’
36
Tritoma juazeirensis foi coletada em diversos municípios; os primeiros situaram-se no entorno da área de ocorrênia de T. sherlocki, correspondentes às populações de Itaguaçu, Central e Ibipeba, e os demais exemplares foram coletados na Localidade tipo, no município de Juazeiro, nas localidades de Salitre, Curral do Meio e Lagoa Seca (Figura 13).
Embora de procedências distintas, os insetos oriundos do município de Juazeiro são aqui considerados como provenientes da Localidade tipo dessa espécie, devido as distâncias entre os pontos de coleta serem próximos.
Figura 12. Local de coleta de T. melanica realizada no ambiente silvestre no município de Urandi, Bahia. Foto: Elaine Folly Ramos (2009).
37
As coletas para as populações de T. juazeirensis foram realizadas extritamente no ambiente silvestre e rochoso tanto na Localidade tipo, Juazeiro, quanto nas localidades de entorno da espécie T. sherlocki, na região dos municípios de Itaguaçu, Central e Ibipeba (Figura 14).
Localidade tipo Itaguaçu Central Ibipeba T. sherlocki -09° 30’ -10° 00’ -10° 30’ -11° 00’ -11° 30’ -43° 00’ -42° 30’ -42° 00’ -41° 30’ -41° 00’ -40° 30’
Figura 13. Localidades de coleta de populações de T. juazeirensis no entorno da área de ocorrência de T. sherlocki, nos municípios de Itaguaçu, Ibipeba, Central e Juazeiro, Bahia.
38 3.3. Extração e sequenciamento
Até o início do processo de extração do gDNA total dos insetos coletados, os mesmos foram mantidos a -20ºC imersos em álcool absoluto dentro de microtubos 1,5mL (eppendorf), para sua conservação. Cada exemplar foi processado separadamente e teve todas as pernas excisadas e rapidamente congeladas em nitrogênio líquido para individual maceração em um microtubo 1,5mL (eppendorf), com o auxílio de um pilão plástico esterilizado. A extração do gDNA foi processada utilizando Wizard Genomic Purification Kit (Promega, Madison, WI) e seguiu o protocolo indicado para a extração a partir de tecidos animais.
O gene mitocondrial do Cit B foi amplificado utilizando os primers Forward: 5’ – gga caa ata tca ttt tga gga gca aca g – 3’ e Reverse: 5’ – att act cct cct agc tta tta gga att g – 3’ (Lyman et al., 1999; Monteiro et al., 2003; 2004). As reações foram conduzidas em um Eppendorf Master Figura 14. Ambiente silvestre e rochoso no município de Central, Bahia, local de coleta de T. juazeirensis. Foto: Elaine Folly Ramos (2009).
39
Gradient Thermocycler (Brinkman Instruments, Westbury, NY). As condições aplicadas para a amplificação do gene foram as seguintes: desnaturação a 94ºC por 5 minutos, em seguida 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento à 47ºC por 30 segundos, e extensão à 72ºC por um minuto; seguido de uma extensão final a 72ºC por dez minutos e finalizando em temperatura de espera (4ºC) indefinidamente. Os produtos amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1,5% com brometo de etídeo.
Os produtos amplificados foram purificados utilizando “GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit” (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) seguindo o protocolo de acordo com recomendações do fabricante.
Após a purificação do produto amplificado seguiu-se a PCR de sequencimento do fragmento do gene mitocondrial Cit B utilizando o BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com instruções presentes no protocolo do kit em um seqüenciador automatizado Applied Biosystem Model 3100.
Os produtos purificados foram sequenciados diretamente em ambas as direções. As sequências consenso foram editadas utilizando o programa BioEdit (Hall, 1999) e o alinhamento por meio do programa Clustal W Multiple alignment viabilizado pelo próprio BioEdit.