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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
Programa de Pós-Graduação em Parasitologia
Vagner José Mendonça
Estrutura genética de três membros do complexo Triatoma brasiliensis que
ocorrem no Estado da Bahia, com enfoque principal para Triatoma sherlocki
Papa et al., 2002 (Hemiptera, Heteroptera, Reduviidae, Triatominae)
Tese apresentada ao Instituto de Biologia para a obtenção do título de Doutor em Parasitologia.
Orientador: Prof. Dr. João Aristeu da Rosa Co-orientador: Dr. Carlos Eduardo Almeida
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iii Campinas, 03 de novembro de 2011
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. João Aristeu da Rosa (Orientador)
Profa. Dra. Jane Margaret Costa Von Sidow
Profa. Dra. Mara Cristina Pinto
Profa. Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira
Prof. Dr. Reinaldo Otávio Alvarenga Alves de Brito
Prof. Dr. Cléber Galvão
Prof. Dr. Sérgio de Albuquerque
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“Hoje levantei pensando no que tenho a fazer antes que o relógio marque meia-noite. É minha função escolher que tipo de dia terei hoje. Posso reclamar que está chovendo ou agradecer as águas por levarem a poluição. Posso ficar triste por não ter dinheiro ou me sentir encorajado para administrar minhas finanças, evitando o desperdício. Posso reclamar sobre minha saúde ou dar graças por estar vivo. Posso me queixar dos meus pais por não terem me dado o que eu queria ou posso ser grato por ter nascido. Posso reclamar por ter que ir trabalhar ou agradecer por ter trabalho. Posso sentir tédio com o trabalho doméstico ou agradecer a Deus por ter um teto para morar. Posso lamentar decepções com amigos ou me entusiasmar com a possibilidade de fazer novas amizades. Se as coisas não saírem como planejei, posso ficar feliz por ter hoje para recomeçar. O dia está na minha frente, esperando para ser o que eu quiser. E aqui estou eu, o escultor que pode dar a forma. Tudo depende de mim”.
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É com grande amor e satisfação que dedico esta tese à minha esposa Tarsia, pela cumplicidade, paciência e por não medir esforços para me auxiliar no que fosse possível durante a elaboração deste trabalho.
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Agradeço especialmente a meu orientador, Prof. Dr. João Aristeu da Rosa, primeiramente por ter aceitado me orientar e desenvolver comigo este trabalho, em seguida por sua orientação segura e dedicada e, sobretudo por seu exemplo de probidade, profissionalismo e dedicação à pesquisa.
Às Secretarias de Saúde do Estado da Bahia, em especial ao Dr. Jorge Mendonça e Dr. Cristóvão por gentilmente auxiliar na organização de todo o trabalho de campo; aos Drs. Reinilson Nunes da Gama e Edvaldo Ribeiro dos Santos (ambos de Irecê) por providenciar todos os dados precedentes de captura de triatomíneos na região Noroeste Central da Bahia e, em especial, aos agentes da Funasa, pelo auxílio nos trabalhos em campo que tornaram possível o desenvolvimento desta tese.
À Profa. Dra. Jane Costa por fornecer irrestritamente todo o suporte necessário aos trabalhos de campo, participando ativamente e com extrema maestria do direcionamento deste trabalho desde os seus primeiros passos.
À Profa. Dra. Christina Romaña, por aceitar supervisionar o projeto que deu origem a esta tese e pelas suas valiosas sugestões sobre a ecologia dos vetores em questão.
Ao co-orientador Dr. Carlos Eduardo Almeida, por idealizar este projeto, efetuar as coletas e extração de DNA, fornecendo todo o material biológico, além de acompanhar e compartilhar seus saberes sempre pautados no rigor científico.
À Profa. Nathalia Correia, Dra. Lynnette Dornak, Dra. Elaine Folly Ramos e Profa. Vanessa Lima-Neiva pela coleta dos exemplares utilizados nesta tese. Ressalto o apoio da Profa. Vanessa também no sequenciamento de DNA.
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À Profa. Dra. Ana Jansen, por disponibilizar seu laboratório e permitir a elaboração de grande parte dos experimentos realizados neste trabalho.
À Dra. Myriam Harry por permitir a execução de parte deste trabalho em seu laboratório. Agradeço pela sua competência e pelas proveitosas discussões, além do grande apoio dispensado a mim.
Ao Dr. Peter Waniek e à Dra. Catarina de Araújo, pela disponibilidade irrestrita, forma crítica e criativa de arguir as idéias apresentadas, facilitando o alcance dos objetivos deste trabalho.
Aos Membros da Banca Examinadora, pela disponibilidade e competência na análise deste trabalho, enriquecendo-o com suas críticas e sugestões.
À Profa. Dra. Regina Maura Bueno Franco pela dedicação e competência com que trabalha pelo nosso curso.
À Profa. Dra. Mara Cristina Pinto e Profa. Dra. Silmara Marques Allegretti, pelo carinho com o qual me atenderam, sempre de forma atenciosa e solícita.
Ao meu avô Horácio (in memorian) por sempre acreditar e torcer por mim e, principalmente, por ter sido o pilar da minha vida.
Aos meus pais, José e Aparecida, que me estimulam a crescer científica, ética, profissional e pessoalmente, desde sempre. Meus sinceros agradecimentos.
Às minhas irmãs, Denise e Adriana, pelo ininterrupto estímulo à minha vida acadêmica e por todo carinho de vocês.
Aos meus grandes amigos do laboratório de Parasitologia da UNESP de Araraquara, pela convivência extremamente amigável e pelos ensinamentos que marcaram esses anos. Meus afetivos agradecimentos.
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Aos amigos e técnicos do Laboratoire Evolution, Génomes et Spéciation do Centre National de la Recherche Scientifique de Gif Sur Yvette, França, em especial Marion Quartier e Claire Capdevielle-Dulac por todo auxílio nas análises dos dados.
À valiosa amiga, Carina Mara, pelo grande incentivo e amparo, sempre torcendo por mim até o final desta jornada, auxiliando-me em todos os momentos em que precisei.
À Plataforma de Sequenciamento de DNA da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) do Rio de Janeiro pelo apoio no sequenciamento do DNA.
Trabalho realizado com o apoio do Laboratório de Biodiversidade Entomológica, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz; do Laboratoire Evolution, Génomes et Spéciation; do Le Centre national de la recherche scientifique (CNRS); do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); do Convênio Bilateral Fiocruz-CNRS; da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
xi Resumo
Triatoma sherlocki, espécie primeiramente coletada por Cerqueira, 1975, tem distribuição registrada na região do município de Gentio do Ouro, Centro Norte do Estado da Bahia, Brasil. Populações intradomiciliares dessa espécie foram encontradas em um assentamento de garimpo em Gentio do Ouro, conhecido como Encantado. Em sua localidade tipo (Santo Inácio) invasões domiciliares são frequentes, mas não foi constatado qualquer indício de domiciliação, portanto informações sobre a sua biologia e aspectos epidemiológicos quanto à transmissão de Trypanosoma cruzi se fazem necessárias. O objetivo central deste trabalho foi verificar se o fator genético poderia estar envolvido no processo de domiciliação de T. sherlocki e se as populações provenientes de ambientes antropizados poderiam apresentar identidade genética. Coletas em ambientes estritamente silvestres e em áreas antropizados nas localidades Santo Inácio e Encantado foram efetuadas entre 2008 e 2009. A análise da variabilidade genética das populações coletadas de T. sherlocki foi verificada por meio de sequenciamento de um fragmento do gene mitocondrial Citocromo B e a estrutura genética foi avaliada utilizando Análise de Variância Molecular (AMOVA). Exemplares de T. sherlocki foram coletados em nove localidades, duas antrópicas, denominadas “Encantado 1” e “Santo Inácio 1”, e as demais estritamente silvestres denominadas “Encantado 2”, “Santo Inácio 2”, “Gentio do Ouro 1”, “Gentio do Ouro 2”, “Gentio do Ouro 3”, “Gentio do Ouro 4” e “Gentio do Ouro 5”. Somente na localidade de “Encantado 1” existem registros de capturas de ninfas e adultos no intradomicílo. Em Santo Inácio 1, segundo a Secretaria de Saúde de Gentio do Ouro, casos de invasões esporádicas são frequentes apenas por exemplares adultos. Foram obtidas 292 sequências de 565 pares de bases do fragmento do gene mitocondrial Cit B e 63 haplótipos foram encontrados. Os valores de diversidade haplotípica variaram de 0.602 para a localidade “Gentio do Ouro 4” até 0.820 para a localidade “Gentio do Ouro 2”. Os resultados obtidos por AMOVA demonstraram que o agrupamento de populações por distância geográfica variou mais entre os grupos (11.13%) do que entre populações dentro dos grupos (2.83%). As análises baseadas em agrupamentos ecológicos, isto é, silvestres versus antrópicos, variaram em 13.39% entre as populações dentro desses grupos, portanto, sem estruturação genética para esses agrupamentos. Esses resultados não suportam a hipótese de dispersão passiva para a formação de colônias intradomiciliares em Encantado 1 a partir de Santo Inácio 1 e sugerem que a colonização das habitações em Encantado 1 ocorre a partir de focos silvestres adjacentes. Como as populações de Encantado 1 e 2 apresentaram relativo grau de diferenciação genética quando comparadas às demais, a possibilidade do fator genético estar envolvido na colonização dos domicílios em Encantado deve ser considerada. As análises de populações de T. juazeirensis e de T. melanica, membros do complexo T. brasiliensis, foram conduzidas com a mesma abordagem utilizada para o estudo da estrutura genética de T. sherlocki. A variação entre as populações T. sherlocki e T. melanica são compatíveis com a diferenciação intraespecífica, ao passo que para T. juazeirensis encontrou-se alta diferenciação genética entre populações da Localidade Tipo (Juazeiro) em relação às populações da região Centro Norte do Estado da Bahia, indicando um possível processo de isolamento reprodutivo.
Palavras-chaves: Triatoma sherlocki, complexo T. brasiliensis, genética populacional, DNA mitocondrial.
xii Abstract
Triatoma sherlocki, a specie first collected by Cerqueira, 1975, it is registered in the municipality of Gentio do Ouro region North Central from Bahia State, Brazil. Household population of T. sherlocki were found in a small artisan quarry-mining community in the municipality of Gentio do Ouro, known as Encantado. From the type locality (Santo Inácio) home invasions are common, but did not report any evidence of domestication, therefore information about its biology and epidemiology aspects in relation to the transmission of Chagas disease are needed. The main objective of this study was to determine if the genetic factor might be involved in the process of domestication of this specie and if the populations from anthropized environments could present genetic identity. Collected from wild strictly and anthropized environmental in the localities Santo Inácio and Encantado were performed between 2008 and 2009. The analysis of genetic variability of populations collected was verified by sequencing of fragment of the mitochondrial gene Cytochrome B and the genetic structure was evaluated by using analysis molecular variance (AMOVA). Specimens of the T. sherlocki were collected in nine locations, two anthropogenics, denominated “Encantado 1” and “Santo Inácio 1”, and the others wild strictly denominated “Encantado 2”, “Santo Inácio 2”, “Gentio do Ouro 1”, “Gentio do Ouro 2”, “Gentio do Ouro 3”, “Gentio do Ouro 4” and “Gentio do Ouro 5”. Only in the Encantado 1 locality were collected nymphs and adults in households. In Santo Inácio 1 according the Health Secretary from Gentio do Ouro, Bahia, sporadic invasions are frequent and only adults were collected in households. 292 sequences of 565 bases pairs of the fragment mitochondrial gene Cyt B were obtained and 63 haplotypes were founded. Haplotype diversity values ranged from 0.602 in the “Gentio do Ouro 4” locality to 0.820 in the “Gentio do Ouro 2” locality. The results of AMOVA showed that the population grouping based on geographical distance resulted in a greater variation between groups (11.13%) than among populations within groups (2.83%). When performed the analysis based on groupings ecologic, ie, localities wild strictly vs. anthropized localities, where specimens household are observed, there was no significance for the variation between groups, which showed 13.39% of variation among populations within groups. These results rule out the hypothesis of passive spread to formation of household colonies in Encantado 1 from Santo Inácio 1, suggesting that colonizations of houses in Encantado 1 occurs from adjacent foci wild. As the populations Encantado 1 and 2 presented relative degree of genetic differentiation when compared to other populations, the possibility that the genetic factor is involved in the colonization of houses in Encatado should be considered. Analysis of populations of T. juazeirensis and T. melanica, others members of the Triatoma brasiliensis complex that occur in the Bahia State, was also conducted with the same approach for the inferences about the genetic structure of T. sherlocki. The variation between T. sherlocki and T. melanica populations are consistent with intraspecific differentiation, whereas T. juazeirensis found a high genetic differentiation between populations from the Type Locality (Juazeiro) in relation to the populations of the North Central region of Bahia State, indicating a possible process of reproductive isolation.
Key-words: Triatoma sherlocki, T. brasiliensis complex, population genetic, mitochondrial DNA.
xiii Sumário
Resumo xi
Abstract xii
I Lista de abreviaturas xv
II Lista de figuras xvi
III Lista de tabelas xviii
1. Introdução 1
1.1. Doença da Chagas 1
1.2. Subfamília Triatominae 6
1.3. Complexo Triatoma brasiliensis 8
1.4. Triatoma brasiliensis brasiliensis 13
1.5. Triatoma juazeirensis 14 1.6. Triatoma melanica 14 1.7. Triatoma sherlocki 15 1.8. Domiciliação 16 1.9. Marcadores moleculares 18 1.10. Genética populacional 21 2. Objetivos 25 2.1. Objetivo Geral 25 2.2. Objetivos específicos 25 3. Materiais e Métodos 26 3.1. Área de estudo 26 3.2. Coletas e identificações 27 3.3. Extração e sequenciamento 38
3.4. Análises estatísticas dos haplótipos 39
3.5. Neutralidade e Demografia 40
3.6. Genealogia 41
3.7. Análise filogenética 42
3.8. Estrutura genética 42
xiv
4.1. Coletas e aspectos ecológicos 44
4.2. Dados moleculares 45 4.3. Triatoma sherlocki 46 4.3.1. Neutralidade e Demografia 50 4.3.2. Genealogia 51 4.3.3. Análise filogenética 53 4.3.4. Estrutura genética 56
4.4. Triatoma juazeirensis e Triatoma melanica 57
4.4.1. Neutralidade e Demografia 57
4.4.2. Genealogia 58
5. Discussão 61
5.1. Domiciliação 62
5.2. Análise dos haplótipos 63
5.3. Neutralidade e demografia 65
5.4. Estrutura genética 66
6 Conclusões 71
xv I - Lista de abreviaturas θ - Theta π - Pi Φ - Fi A - Adenina
a.C. - antes de Cristo
AMOVA - Analysis of Molecular Variance C - Citocina
Cit B - Citocromo B
DNA - Ácido desoxiribonucleico
G - Guanina
gDNA - DNA genômico
MCMC - Markov chain Monte Carlo ITS - Internal Transcribed Spacer mtDNA - DNA mitocondrial
OMS - Organização Mundial de Saúde
RAPD - Random Amplification of Polymorphic DNA RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism RNA - Ácido ribonucleico
T - Timina
xvi II - Lista de figuras
Figura 1. Rota de migração de indivíduos infectados com doença de Chagas para
áreas não endêmicas. Fonte: Coura & Viñas, 2010. 3
Figura 2: Espécies do complexo Triatoma brasiliensis. A – T. brasiliensis brasiliensis; B – T. brasiliensis macromelasoma; C – T. juazeirensis; D – T. melanica; E – T. sherlocki. Fonte: (Costa et al., 2006; Costa & Felix, 2007; Costa et al., 2009; Mendonça et al., 2009).
11
Figura 3: Áreas de distribuição das espécies e subespécies pertencentes ao complexo T. brasiliensis, com destaque para o Estado da Bahia, Brasil (Costa et al., 2002;
Mendonça et al., 2009). 12
Figura 4. Mapa do genoma mitocondrial de Triatoma dimidiata. Fonte: Dotson &
Beard (2001). 20
Figura 5: Mapa do Brasil, com destaque para o Estado da Bahia, ilustrando os pontos de coletas das populações de triatomíneos estudadas. A: T. sherlocki; B’: T. juazeirensis (região Central); B’’: T. juazeirensis (Localidade tipo); C: T. melanica. 26 Figura 6. Localidades de coletas de populações de T. juazeirensis, T. melanica e T.
sherlocki. 29
Figura 7. Localidades de coleta das populações de T. sherlocki no município de
Gentio do Ouro, Bahia. 30
Figura 8. Ambiente rural da localidade de Encantado na área de coleta de T. sherlocki, com casas construídas de barro e madeira. Foto: Carlos Eduardo Almeida (2009). 32 Figura 9. Triatoma sherlocki no intradomicílio na localidade de Encantado, município de Gentio do Ouro, Bahia. Foto: Carlos Eduardo Almeida (2009). 33 Figura 10. Ambiente silvestre característico para a presença de T. sherlocki na localidade de Santo Inácio, Bahia. Foto: Carlos Eduardo Almeida (2009). 34 Figura 11. Região de coleta das populações de T. melanica no município de Urandi, Bahia com referência aos locais de coletas de T. sherlocki e T. juazeirensis. 35 Figura 12. Local de coleta de T. melanica realizada no ambiente silvestre no município de Urandi, Bahia. Foto: Elaine Folly Ramos (2009). 36 Figura 13. Localidades de coleta de populações de T. juazeirensis no entorno da área de ocorrência de T. sherlocki, nos municípios de Itaguaçu, Ibipeba, Central e Juazeiro, 37
xvii Bahia.
Figura 14. Ambiente silvestre e rochoso no município de Central, Bahia, local de coleta de T. juazeirensis. Foto: Elaine Folly Ramos (2009). 38 Figura 15. Rede genealógica de parcimônia máxima ilustrando a relação entre os 63 haplótipos de nove populações geográficas de T. sherlocki baseado no fragmento do
gene mitocondrial Cit B. 51
Figura 16. Rede genealógica de parcimônia máxima mostrando a relação entre os 63 haplótipos de nove populações de T. sherlocki baseado no fragmento do gene mitocondrial Cit B codificada de acordo com aspecto ecológico. 53 Figura 17. Inferência bayesiana dos haplótipos das populações de T. sherlocki, baseada no sequenciamento do fragmento do gene mitocondrial Cit B. 54 Figura 18. Rede genealógica de parcimônia máxima mostrando a relação entre os seis haplótipos de três populações de T. melanica baseado no fragmento do gene
mitocondrial Cit B. 59
Figura 19. Rede genealógica de parcimônia máxima mostrando a relação entre os 12 haplótipos de quatro localidades de T. juazeirensis baseado no gene mitocondrial do
xviii III - Lista de tabelas
Tabela 1. Distâncias geográficas das localidades amostradas para as populações de T.
juazeirensis, T. melanica e T. sherlocki. 27
Tabela 2. Coordenadas geográficas dos pontos de coleta das populações de T.
juazeirensis, T. melanica e T. sherlocki. 29
Tabela 3. Distâncias geográficas das localidades amostradas das populações de T.
sherlocki. 31
Tabela 4. Dados de coletas das populações de T. juazeirensis, T. melanica e T. sherlocki quanto ao ecótopo e tamanho amostral para estudo da estrutura genética
(genotipados). 44
Tabela 5. Sítios polimórficos do fragmento do gene mitocondrial Cit B dos 63 haplótipos das populações de T. sherlocki. H: Haplótipos. 47 Tabela 6. Tamanho amostral, Sítios polimórficos, Diversidade nucleotídica, Diversidade haplotípica e número de Haplótipos das populações de T. sherlocki. 49 Tabela 7. Alelos observados, estimativas da variabilidade e testes de neutralidade para o fragmento do gene mitocondrial Cit B das populações de T. sherlocki. 50
Tabela 8. Matriz com os valores de FST par-a-par das populações de T. sherlocki.
55 Tabela 9. Componentes de variação para AMOVA, percentagem de variação explicada em cada nível hierárquico espacial/ecotópico e índices de fixação para (a) sítios agrupados de acordo com as distâncias geográficas; e (b) sítios agrupados de acordo com ecótopo: intradomiciliar e silvestre.
56
Tabela 10. Tamanho amostral (N), Sítios polimórficos, Diversidade nucleotídica (Hd), Diversidade haplotípica (Pi) e número de haplótipos para as populações de T. melanica e T. juazeirensis. T. mel.: T. melanica; T. juaz.: T. juazeirensis. 57 Tabela 11. Alelos observados, estimativas da variabilidade e testes de neutralidade das populações de T. melanica e T. juazeirensis. T. mel.: T. melanica; T. juaz.: T.
juazeirensis. 58
xix
Tabela 13. Matriz com os valores de FST par-a-par das populações de T. juazeirensis.
1 1. Introdução
1.1. Doença de Chagas
A tripanossomíase americana ou doença de Chagas é uma zoonose que tem como agente etiológico o protozoário Trypanosoma cruzi. Os primeiros casos humanos da doença foram descritos em Minas Gerais pelo médico sanitarista Carlos Justiniano Ribeiro das Chagas que determinou o agente etiológico, a espécie vetora (Panstrongylus megistus), os reservatórios domésticos e silvestres e a patogenia (Chagas, 1909).
Trypanosoma cruzi infecta mais de 100 espécies de mamíferos que atuam como reservatórios desse protozoário que apresenta como hospedeiros invertebrados várias espécies de hemípteros hematófagos da família Reduviidae, subfamília Triatominae (vetores). A doença é quase exclusiva de áreas rurais onde os triatomíneos podem contaminar-se principalmente nos reservatórios naturais de T. cruzi, entre os quais os mais comuns são os gambás (didelfídeos) e tatus (dasipodídeos). Entretanto, mamíferos domésticos como gatos e cachorros, bem como humanos, também podem atuar como reservatórios importantes do protozoário. A transmissão entre os animais ocorre há aproximadamente 10 milhões de anos (WHO, 2002; Coura & Viñas, 2010).
Por meio de ferramentas moleculares foi possível evidenciar casos de infecção humana por T. cruzi em múmias procedentes dos vales andinos e Peruanos há cerca de 9.000 anos a.C. (Aufderheide et al., 2004). No Brasil comprovou-se caso da infecção humana em um sítio arqueológico no Estado de Minas Gerais, datado de 4,5 – 7 mil anos atrás (Lima et al., 2008).
A partir do descobrimento da América por Cristóvão Colombo, os deslocamentos e as atividades humanas propiciaram contatos entre homens, vetores, agentes etiológicos e reservatórios e consequentemente o aparecimento de enfermidades, tal como a doença de Chagas. O deslocamento dos vetores de seus ecótopos naturais para área antropizadas ou suas proximidades, determinaram a domiciliação dos vetores e a endemização da doença de Chagas, primitivamente uma zoonose silvestre e que se tornou uma antropozoonose (Forattini, 1980; WHO, 2002; Coura & Viñas, 2010).
A doença de Chagas dispersou-se nas Américas por circunstâncias e fatores de natureza antrópica e de aspectos políticos sociais, retratados em ranchos rurais rudimentares, populações
2
socialmente excluídas, bolsões de pobreza e baixa produção, sistemas de saúde ineficientes e espaços geograficamente abertos, principalmente por desmatamentos intensivos (Forattini, 1980).
Vivendo em casas mal construídas e em estado precário, o homem propiciou aos vetores condições à colonização. Muitas espécies adaptaram-se ao domicílio e essa condição é primordial para a transmissão da tripanossomíase americana. Devido ao caráter crônico e rural, a doença de Chagas não é tratada com a atenção merecida, pois a distribuição da doença quase sempre acompanha a distribuição da pobreza (Vinhaes & Dias, 2000; Silveira, 2000).
A prioridade ao combate da doença de Chagas sempre foi negligenciada devido ao seu caráter crônico e rural, acometendo populações carentes, sem condições de reivindicação de suas necessidades. Senão por compromisso social, estudos de custo-benefício mostram a importância do combate à doença (Silveira, 2000).
A doença de Chagas produz perdas sociais importantes nas áreas endêmicas, em termos de mortalidade, absenteísmo, incapacidade laboral e custos médico-sociais, números esses geralmente ignorados por políticos e governos, tanto em virtude da evolução crônica e pouca visibilidade da doença como, principalmente, pelo anonimato da população exposta ou afetada pela doença (Dias & Coura, 1997).
Uma vez que a transmissão por meio do inseto vetor ainda é considerada a forma mais comum de se contrair a doença de Chagas, o monitoramento vetorial é tido como uma forma saudável, no senso estrito da palavra, bem como econômica de combater a doença de Chagas (Dias, 2006).
Nos países da América Latina a doença de Chagas permanece um importante problema de saúde pública com implicações sociais e econômicas. A doença de Chagas afeta aproximadamente 10 milhões de pessoas e representa um risco para 25 milhões da população latino americana, desde o Sul dos Estados Unidos até o Sul da Argentina. Estima-se que a doença de Chagas foi responsável por mais de 10.000 óbitos em 2008 (Moncayo & Silveira, 2009; Coura & Viñas, 2010; WHO, 2010).
Em adição, a crescente migração de chagásicos e a falta de triagem em bancos de doação de sangue em países não endêmicos, como os Estados Unidos, Japão, Austrália e os países da Europa (Figura 1), está criando nesses países uma questão relevante relacionada aos riscos de transmissão transfusional, congênita e por transplantes de órgãos (Schmuñis, 2007; Coura & Viñas, 2010; WHO, 2010).
3
Segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO, 2002) a transmissão vetorial é responsável por mais de 80% dos casos da doença de Chagas. Transmissão por transfusão sanguínea (16%), transmissão congênita, oral e transplante de órgãos (2%) e transmissão devido à acidentes de laboratório (<1%) representam outras formas de transmissão da doença.
Na década de 1970 havia no Brasil mais de cinco milhões de pessoas infectadas por T. cruzi, estimando-se 100 mil casos novos por ano e uma mortalidade superior a 10 mil casos anuais. Apenas 5% dos bancos de sangue faziam o controle dos doadores e mais de 700 municípios tiveram suas casas infestadas por triatomíneos. Assim, em continuidade a um programa criado em 1991, denominado “Iniciativa do Cone Sul”, uma série de ações objetivando o controle dessa moléstia foram estabelecidas no Brasil e também em outros países como Chile, Argentina, Bolívia, Paraguai e Uruguai (Schofield & Dias, 1999).
Até 1997, Triatoma infestans foi considerada a principal espécie vetora da doença de Chagas entre os países que representavam a Iniciativa do Cone Sul e o principal objetivo desse programa foi o combate a esse vetor (Vinhaes & Dias, 2000).
O programa de controle da doença de Chagas no Brasil cobriu cerca de dois milhões de unidades domiciliares rurais borrifadas com inseticidas, e alcançou resultados satisfatórios em várias localidades antes consideradas altamente endêmicas. Além do combate ao vetor implantaram-se medidas para a redução do risco de transmissão por transfusão sanguníea. As Figura 1. Rota de migração de indivíduos infectados com doença de Chagas para áreas não endêmicas. Fonte: Coura & Viñas, 2010.
4
capturas do principal vetor da doença de Chagas na ocasião, T. infestans, que atingiram a marca de mais de 80 mil exemplares coletados no ano de 1979, caíram para pouco mais de 40 exemplares em 2005. Campanhas de controle fizeram com que a porcentagem de municípios brasileiros infestados por T. infestans fosse reduzida de 30,4% em 1983 para 7,6% em 1993 (Silveira & Vinhaes, 1998).
Após ações conjuntas de países ligados a Iniciativa Cone Sul e a Iniciativa Pacto Andino a prevalência de positividade de infecção por T. cruzi baixou de 5-7% para somente 0.65% nos candidatos à doação e a incidência decresceu dos 700.000 casos para 41.000 em recentes levantamentos (WHO, 2007). Assim, em junho de 2006, a Organização Panamericana de Saúde (OPS) e a Organização Mundial de Saúde (OMS) concederam o certificado de eliminação da transmissão da doença de Chagas por T. infestans e pela via transfusional ao Brasil (Dias, 2006; Schofield et al., 2006; WHO, 2007).
O modelo de cooperação internacional é eficiente e uma iniciativa semelhante vem sendo implantada desde 1997 na Região andina e na América Central. Projeções indicam que a vigilância vetorial e a detecção prévia, bem como o devido cuidado de pessoas já infectadas pela doença de Chagas são formas eficazes para se controlar a emergência e reemergência dessa moléstia (Dias et al., 2002).
Em 2006 a Comissão Intergovernamental dos Países do Cone Sul e OPAS/OMS certificaram formalmente a interrupção da transmissão de T. cruzi por T. infestans. Apesar de focos remanescentes ainda serem encontrados, a transmissão foi considerada improvável pela baixa infestação e densidade das populações existentes daquele vetor no intradomicílio (Silveira & Dias, 2011).
Após o controle de T. infestans no Brasil, outras espécies, até então, consideradas de importância secundária, passaram a invadir ou mesmo a colonizar ecótopos domiciliares. Dentre os gêneros que apresentam maior relevância epidemiológica, destacam-se Panstrongylus, Rhodnius e Triatomaaos quais pertencem o maior número de espécies descritas e por possuírem considerável sinantropia. As principais espécies vetoras que emergiram como prioridades para as campanhas de controle após a interrupção da transmissão por T. infestans foram P. megistus, R. prolixus, T. brasiliensis, T. dimidiata, T. pseudomaculata e T. sordida. Tais espécies apresentam grande capacidade de adaptação ao peridomicílio e aos precários domicílios humanos, geralmente
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casas feitas de barro com cobertura de folhas de palmeira (Galvão et al., 2003; Jurberg et al., 2004; Costa & Lourenzo, 2009).
Dados levantados pela Funasa, entre 1975 e 1997, indicaram um crescente processo de invasão peri e intradomiciliar de T. rubrovaria. Essa espécie foi originalmente considerado exclusivamente silvestre no Rio Grande do Sul/RS, e que após o controle de T. infestans passou a ser o triatomíneo mais capturado nesse Estado. Atualmente, T. rubrovaria é tratado como prioridade no monitoramento vetorial no Rio Grande do Sul. Estudos bionômicos, ecológicos e isoenzimáticos foram desenvolvidos com o intuito de se ampliar os conhecimentos de aspectos relacionados à potencialidade vetorial dessa espécie. Os resultados obtidos pelo teste de precipitina indicaram ecletismo alimentar para T. rubrovaria e o soro anti-roedor apresentou o mais alto índice de positividade na maioria das localidades. Entretanto, foi registrado 1,28% de positividade para sangue humano (Salvatella et al., 1995; Almeida et al., 2000; 2002; 2003; Rosa et al., 2000; Martins et al., 2006).
Outro aspecto epidemiológico da doença de Chagas, principalmente no Brasil, que tem merecido atenção nos últimos anos, é o aumento dos surtos de transmissão oral, que tem sido notificados nos Estados da Bahia, Ceará, Piauí, Rio Grande do Sul, Santa Catarina, São Paulo e com maior frequência registrada nos Estados da Amazônia Legal (Amazonas, Maranhão, Matos Grosso, Amapá, Pará e Tocantins). A transmissão oral está associada principalmente ao consumo de caldo de cana-de-açúcar e açaí contaminados com fezes dos triatomíneos infectadas com o protozoário (Dias, 2006; Pérez-Gutiérrez et al., 2006; Steindel et al., 2008; OMS, 2009).
Em 1950, a população rural brasileira correspondia a 63,8% da população total, já no início dos anos 70 aproximadamente 50% e, atualmente, não é maior do que 20% do total de habitantes, havendo ao longo desse tempo uma melhora significativa dos indicadores econômicos e sociais. A partir dos anos 60 e 70 houve uma crescente e forte concentração da população no meio urbano, consequente à modernização da agricultura e intenso processo de industrialização (Forattini, 1980; Silveira & Dias, 2011).
Como ainda não existe cura para a fase crônica da doença de Chagas, os fármacos existentes para tratamento etiológico são comprovadamente eficazes apenas em casos de infecção recente, que na maioria das vezes são clinicamente inaparentes. Por conseguinte, diante do grande número de reservatórios, não é possível eliminar as fontes de infecção, desse modo os esforços para combater essa endemia devem ser voltados para a interrupção da transmissão
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vetorial, por meio do controle dos triatomíneos (Silveira & Vinhaes, 1999; WHO, 2002; Silveira & Dias, 2011).
O tratamento quimioterápico para a doença de Chagas ainda apresenta resultados insatisfatórios. Atualmente, o medicamento mais utilizado é o benzonidazol, alcançando índices de cura de 76% na fase aguda da doença (Cançado, 1999). Resultados recentes em camundongos demonstraram que o benzonidazol também previne o desenvolvimento de cardiomiopatia severa na fase crônica da doença, entretanto, além de altamente tóxico para mamíferos, esse fármaco não apresentou êxito na eliminação do protozoário (Garcia et al., 2005).
1.2. Subfamília Triatominae
Os triatomíneos constituem um grupo de insetos classificados na ordem Hemiptera, subordem Heteroptera, família Reduviidae, subfamília Triatominae (Lent & Wygodzinsky, 1979).
O primeiro triatomíneo descrito foi Cimex rubrofasciatus, em 1773, por DeGeer e 60 anos depois tal espécie foi descrita espécie-tipo do gênero Triatoma e designada Triatoma rubrofasciata por Laporte, em 1833 (Lent & Wygodzinsky, 1979).
A hematofagia dos triatomíneos foram primeiramente relatados em 1590 e são atribuídos ao Pe. Reginaldo Lizarraga em sua passagem pela região do Peru e Chile. Há também citações de Charles Darwin, de 1835 deixados em Diario del viaje de un Naturalista alrededor del Mundo em que relatou a presença de inúmeros insetos sanguinários na villa de Luján, província de Mendoza, Argentina (Abalos & Wygodzinsky, 1951; Lent & Wygodzinsky, 1979).
A evolução dos triatomíneos pode ter ocorrido a partir de reduvídeos predadores, sendo a hematofagia obrigatória resultado de uma modificação evolutiva a partir de uma hematofagia facultativa proveniente em ancestrais que habitavam ninhos de animais. Essa hipótese que sugere uma origem polifilética dos triatomíneos é sustentada pelo comportamento, os hábitos alimentares e suas relações estreitas com determinados hospedeiros vertebrados. As características compartilhadas seriam resultado de convergência durante a passagem da vida predatória para a hematofágica (Dujardin et al., 1999a; Lyman et al., 1999; Bargues et al., 2000; Schofield, 2000; Marcilla et al., 2001; Schaefer, 2003; Paula et al., 2005).
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Análises filogenéticas ilustram a divisão das duas principais tribos, Rhodniini e Triatomini, em clados distintos (Monteiro et al., 2000; Bargues et al., 2000). Essa divisão também é suportada por padrões morfológicos de antenas (Catalá, 1997), estrutura morfológica de ovos (Barata, 1998), isoenzimas (Dujardin et al., 1999b) e variação de proteínas salivares (Soares et al., 2000).
Porém, não há consenso sobre a origem dos triatomíneos. A adaptação à hematofagia pode ter ocorrido uma única vez e, dessa forma, todas as espécies compartilham um ancestral comum (Lent & Wygodzynsky 1979; Gaunt & Miles, 2000; Hypša et al., 2002), tendo origem monofilética. Tal hipótese é baseada em caracteres apomórficos como o rostro reto e fino apoiado na gula, cujo terceiro segmento pode fletir para cima durante a alimentação, antenas inseridas lateralmente e filiformes e ausência de glândulas abdominais dorsais.
A subfamília Triatominae compreende 144 espécies de triatomíneos que estão descritas e que são agrupadas em cinco tribos e 18 gêneros. Duas tribos apresentam os gêneros com maior relevância epidemilógica como transmissores do T. cruzi: Rhodniini (gêneros Rhodnius e Psammolestes) e Triatomini (gêneros Triatoma, Panstrongylus, Eratyrus, Dipetalogaster, Hermanlentia, Linshcosteus, Meccus, Mepraia e Paratriatoma). As outras três tribos (Alberproseniini, Carvenicolini e Bolboderini) apresentam menor importância por possuírem espécies que não são encontradas no ambiente domiciliar (Lent & Wygodzinsky, 1979; Galvão et al., 2003; Forero et al., 2004; Poinar Jr, 2005; Costa et al., 2006; Galvão & Angulo, 2006; Bérenger & Blanchet, 2007; Costa & Felix, 2007; Martínez et al., 2007; Sandoval et al., 2007; Jurberg et al., 2009; Schofield & Galvão, 2009).
Os triatomíneos são encontrados principalmente na região Neotropical, entretanto 14 espécies estão distribuídas fora do continente americano: seis do gênero Linshcosteus encontradas na Índia, e oito do gênero Triatoma encontradas na África, Ásia e Austrália (Galvão et al., 2003).
Tradicionalmente as espécies são descritas e classificadas com base em critérios morfológicos que levam em consideração a coloração do conexivo, do pronoto, a morfologia e morfometria dos ovos e das estruturas do corpo e a genitália do macho que permitem definir tribos, gêneros e espécies (Lent & Wygodzynsky, 1979). Apesar dessa abordagem permitir a identificação da maioria das espécies, variações cromáticas intra-específicas são observadas, como em T. infestans (Noireau et al., 1997) e T. rubrovaria (Almeida et al., 2002).
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Outras espécies são muito similares, como R. prolixus e R robustus, dificultando a identificação específica (Monteiro et al., 2003). O gênero Rhodnius é muito bem caracterizado, o mesmo não acontecendo com as espécies que o constituem (Neiva & Pinto, 1923).
A genitália masculina é empregada para caracterizar e separar espécies similares; porém, nem sempre é eficiente, como, por exemplo, para separar R. neglectus e R. prolixus (Lent & Wygodzynsky, 1979; Harry, 1993). A observação de estruturas da genitália feminina por meio de microscopia eletrônica de varredura para a identificação de triatomíneos foi verificada por Rosa et al. (2010) e mostrou-se como ferramenta sensível para a caracterização de espécies dos gêneros Panstrongylus, Rhodnius e Triatoma.
Nesse sentido, novas ferramentas morfométricas e moleculares têm sido usadas para a classificação dos triatomíneos e resolução de problemas taxonômicos (Abad-Franch & Monteiro, 2005).
1.3. Complexo Triatoma brasiliensis
Triatoma brasiliensis foi descrita por Neiva em 1911. A partir de exemplares coletados no município de Espinosa, Estado de Minas Gerais, uma variação cromática de T. brasiliensis foi descrita, atribuindo-lhe status sub-específico a esse novo padrão denominada T. brasiliensis melanica (Neiva & Lent, 1941).
Em 1956, Galvão descreveu um novo morfotipo de T. brasiliensis caracterizando-a como subespécie, denominada T. brasiliensis macromelasoma, com base em exemplares coletados em Juazeiro e Petrolina, nos estados da Bahia e Pernambuco.
Entretanto, Lent & Wygodzinsky (1979), sinonimizaram as subespécies T. brasiliensis melanica e T. brasiliensis macromelasoma como T. brasiliensis, alegando que formas intermediárias entre os diferentes padrões poderiam ser encontradas naturalmente no ambiente.
Pesquisas realizadas com diferentes populações de T. brasiliensis coletadas em Caicó (RN), Espinosa (MG), Petrolina (PE) e Juazeiro (BA), denominadas respectivamente de populações ‘brasiliensis’, ‘melanica’, ‘macromelasoma’ e ‘juazeiro’ mostraram que T. brasiliensis se apresentou como uma espécie politípica, constituída por diferentes populações
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alopátricas com potenciais epidemiológicos distintos (Costa et al., 1997a; 1997b; Costa & Marchon-Silva, 1998).
Estudos morfológicos (Costa et al., 1997a), ecológicos (Costa et al., 1998; 2002) e moleculares (Costa et al., 1997b; Monteiro et al., 2004), mostraram que os diferentes padrões cromáticos apresentados pelas diferentes populações são características estáveis sugerindo quatro formas distintas (brasiliensis, juazeirensis, macromelasoma e melanica) como entidades taxonômicas. As variações cromáticas do conexivo, pronoto e hemiélitros estão associadas com a distribuição geográfica que as mesmas apresentam (Costa et al., 2003).
Por meio da abordagem de Nested Clade Phylogeographic Analysis (NCPA), Monteiro et al. (2004) demonstraram que as populações acima mencionadas foram resultado de expansão populacional, seguida por fragmentação, ocorrida no passado e que a diferenciação ocorreu devido ao isolamento por distância geográfica, que mostrou quatro agrupamentos bem definidos. Nesse mesmo estudo as populações ‘juazeiro’ e ‘melanica’ apresentaram maior distância genética em relação às populações ‘brasiliensis’ e ‘macromelasoma’.
Com base na análise multidisciplinar (Costa et al., 1997a; 1997b; 1998; 2002; 2003; Monteiro et al., 2004) e na consistência desses padrões cromáticos, T. melanica (Costa et al.; 2006) e T. juazeirensis (Costa & Felix, 2007) foram descritas como novas espécies do complexo T. brasiliensis consituindo como unidades evolutivas independentes.
Um novo membro do complexo T. brasiliensis foi adicionado a partir de estudos filogenéticos baseados no sequenciamento de fragmentos dos genes mitocondriais Cit B e 16S que incluíram a espécie T. sherlocki (Mendonça et al., 2009).
Além das espécies acima mencionadas, Schofield & Galvão (2009) consideram T. lenti, com ocorrência para o município de Macaúbas (BA) e para o Estado de Goiás, T. melanocephala, que apresenta ampla distribuição nos Estados da Bahia, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte e Sergipe, e T. petrochii distribuído nos Estados da Bahia, Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte, como pertencentes ao complexo T. brasiliensis (Galvão et al., 2003). A proposta de inclusão dessas três espécies baseou-se em características morfológicas.
As espécies que constituem o complexo T. brasiliensis ainda é uma quetão discutível e novas abordagens são necessárias para se chegar a uma conclusão acerca da correta classificação desse complexo.
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Levando em consideração dados moleculares, morfológicos e biogeográficos, neste estudo será considerado como pertencente ao complexo T. brasiliensis as espécies e subspécies: T. brasiliensis brasiliensis, T. brasiliensis macromelasoma, T. juazeirensis, T. melanica e T. sherlocki (Figura 2, A – E) (Costa et al., 2006; Costa & Felix, 2007; Mendonça et al., 2009).
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As espécies que compõem o complexo T. brasiliensis são os principais vetores da doença de Chagas no semi-árido brasileiro devido à sua capacidade de infestar o peridomicilio e colonizar o interior das casas e sua ampla distribuição geográfica no Nordeste brasileiro (Costa et al., 2009).
No presente trabalho estudou-se populações de três espécies com ocorrência para o Estado da Bahia: T. juazeirensis, T. melanica e T. sherlocki, que mostram diferenciada habilidade para invadir e colonizar tanto o peridomicílio, quanto o interior dos domicílios (Figura 3).
C
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E
Figura 2: Espécies do complexo Triatoma brasiliensis. A – T. brasiliensis brasiliensis; B – T. brasiliensis macromelasoma; C – T. juazeirensis; D – T. melanica; E – T. sherlocki. Fonte: (Costa et al., 2006; Costa & Felix, 2007; Costa et al., 2009; Mendonça et al., 2009).
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A correta identificação das espécies e subespécies que compõem o complexo T. brasiliensis tem implicações epidemiológicas, sendo importante para as ações de monitoramento e controle da doença de Chagas. Observa-se que T. melanica é encontrada no ambiente silvestre enquanto que T. brasiliensis pode frequentemente invadir e colonizar ambientes domésticos e peridomésticos assumindo importante papel na transmissão de T. cruzi, uma vez que estão associados com uma grande variedade de vertebrados dos quais muitos frequentam o peridomicílio, como é o caso de alguns roedores e marsupiais (Costa et al., 2003; Vitta et al., 2007; Almeida et al., 2008; De la Fuente et al., 2008; Gonçalves et al., 2009).
Em estudos epidemilógicos constatou-se que exemplares da população ‘brasiliensis’ apresentaram 15% de infectividade por T. cruzi, enquanto que populações de ‘melanica’ apresentaram 6,6%. Não foi detectada infecção natural nos espécimes das populações ‘macromelasoma’ e ‘juazeiro’. Os autores indicam a população ‘brasiliensis’ como a mais importante em termos epidemiológicos, por aliar a mais ampla distribuição geográfica com as altas taxas de infecção natural e também por ser encontrada infestando com mais frequencia o intradomicílio (Costa et al., 1997a; 1997b; Costa & Marchon-Silva, 1998).
Figura 3: Áreas de distribuição das espécies e subespécies pertencentes ao complexo T. brasiliensis, com destaque para o Estado da Bahia, Brasil (Costa et al., 2002; Mendonça et al., 2009).
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Sarquis et al. (2004), ao realizarem um estudo no Estado do Ceará, analisaram 158 domicílios de novembro de 2000 a abril de 2002. Triatoma brasiliensis foi o triatomíneo mais capturado nas unidades domiciliares, representando um percentual de 74-93% do total (3.082 exemplares), que apresentou 15% dos exemplares com infecção natural por T. cruzi.
Outra evidência da importância epidemiológica foi observada por Forattini et al. (1981) e Silveira, (2011) que detectaram T. brasiliensis com maior participação na transmissão domiciliar da infecção chagásica, mesmo com a presença de T. infestans.
1.4. Triatoma brasiliensis brasiliensis
No complexo T. brasiliensis, a espécie T. brasiliensis brasiliensis é a que se encontra mais amplamente distribuída no Nordeste brasileiro (Costa et al., 2003; Costa et al., 2009). Essa característica biogeográfica aliada a outras bionômicas, ecológicas e comportamentais conferem à espécie em uma maior dificuldade de monitoramento e medidas de controle (Almeida et al., 2008).
Triatoma brasiliensis brasiliensis (Figura 2-A), espécie-tipo do complexo, apresenta distribuição geográfica confirmada para os estados de Maranhão, Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba. Essa subespécie pode ser encontrada em ecótopos variados, no ambiente silvestre (pedregais), no peridomicílio (galinheiros, currais, cercas de madeira, muros de pedra, etc.). A coloração é geralmente amarelo-acastanhada, pronoto com faixas longitudinais amarelas, alargando-se para fora das carenas medianas, desde a margem posterior do lobo posterior até o lobo anterior, onde se estreitam, membrana do hemiélitro clara, com leve tonalidade escura nas células internas, trocânteres predominantemente amarelos, fêmures com anel mediano largo, machos com fosseta esponjosa nas tíbias anteriores e medianas, ausente nas fêmeas (Costa et al., 2003).
Frequentemente são responsáveis por proporcionar altas infestações intradomiciliares (Costa et al., 2003; Almeida et al., 2008).
14 1.5. Triatoma juazeirensis
Triatoma juazeirensis (Figura 2-C) ocorre no semi-árido ao Norte do Estado da Bahia tendo como localidade tipo a região de Juazeiro (Figura 3). A coloração geral é negra com partes amareladas a acastanhadas, pronoto inteiramente negro podendo apresentar um par de pequenos pontos castanhos na parte anterior da carena submediana, membrana do hemiélitro com células internas parcialmente enegrecidas, fêmures inteiramente negros, machos com fosseta esponjosa nas tíbias anteriores e medianas, ausente nas fêmeas. Essa espécie é encontrada no ambiente silvestre (pedregais) e no peridomicílio, podendo também invadir o intradomicílio (Costa & Felix, 2007).
1.6. Triatoma melanica
Triatoma melanica (Figura 2-D) encontra-se distribuído em regiões dos municípios de Espinosa e Porteirinha, Norte do Estado de Minas Gerais (Monteiro et al., 2004) e Urandi, Sul do Estado da Bahia (Figura 3).
A coloração geral apresenta-se enegrecida com relação aos outros membros do complexo, com áreas amarelo-alaranjadas, colarinho negro, pronoto com faixas triangulares partindo da margem posterior do lobo posterior, mas não atingindo o lobo anterior, membrana do hemiélitro com células internas totalmente negras, trocânteres escuros, fêmures com manchas claras não formando anel nítido, fosseta esponjosa ausente nas fêmeas, estando presente apenas nas tíbias anteriores dos machos (Costa et al., 2006).
Trata-se do único membro do complexo com hábitos exclusivamente silvestres (pedregais) podendo, eventualmente, invadir os domicílios, principalmente durante os períodos mais secos. Ainda não foi encontrada colonizando os domicílios (Costa et al., 2003).
15 1.7. Triatoma sherlocki
Os estudos sobre T. sherlocki (Figura 2-E) começaram em 1975, a partir de coleta realizada em Santo Inácio/BA. Os “triatomíneos silvestres”, assim denominados incialmente por Cerqueira (1982), foram capturados em ambiente silvestre, rochoso, desprovido de vegetação, a uma altitude de 473 metros e habitada por lacertídeos e roedores, aproximadamente 250 metros da área urbana (Cerqueira, 1982).
Cerqueira (1982) realizou intercruzamento do “triatomíneo silvestre” com T. brasiliensis, T. lenti e T. infestans, cruzamentos de híbridos e retrocruzamentos, chegando à conclusão que se tratava de uma subespécie de T. brasiliensis, denominando-o de T. brasiliensis santinacensis. Tal hipótese foi justificada pelo fato de T. brasiliensis ocorrer no mesmo ecótopo que o “triatomíneo silvestre”, apesar de este ter apresentado o fenótipo com coloração diferenciada no ambiente natural e também por ter formado híbridos férteis nos cruzamentos experimentais (Lent & Wygodzinsky, 1979, Cerqueira, 1982).
Em 2002, Papa et al., retomaram os estudos com o “triatomíneo silvestre” e levando em consideração características peculiares como os hemiélitros reduzidos, que reflete na sua incapacidade de voar (Almeida et al., 2012), os anéis de cor laranja avermelhado nos fêmures e manchas no conexivo, características morfológicas semelhantes à espécie T. lenti, que difere daquela pelas características das estruturas fálicas, do escutelo, do pronoto, do conexivo e das asas anteriores e posteriores, classificaram como uma nova espécie, Triatoma sherlocki (Papa et al., 2002).
Após a descrição específica (Papa et al., 2002), Mendonça et al. (2009) estabeleceram uma posição filogenética para a espécie T. sherlocki baseada no sequenciamento de genes mitocondriais e confirmaram a proximidade que T. sherlocki apresenta com as espécies do complexo T. brasiliensis inserindo-a como membro desse complexo.
Almeida et al. (2009) reportaram a ocorrência de T. sherlocki no intradomicílio no município de Encantado/BA, em coleta realizada em 2007 e 2008 que representa um possível processo de domiciliação dessa espécie e sua importância epidemiológica.
Assim, no que se refere a T. sherlocki, as modernas técnicas moleculares podem ser ferramentas úteis para um melhor entendimento da dinâmica populacional e, dessa forma,
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auxiliar nas atividades de controle, monitoramento vetorial e elucidação dos eventos relacionados à epidemiologia da doença de Chagas.
1.8. Domiciliação
O primeiro inquérito epidemiológico de pesquisa entomológica domiciliar e coleta de triatomíneos abrangeu a região Nordeste do Brasil e visou compreender a distribuição dos vetores domiciliados, determinar as fontes alimentares preferenciais e as taxas de infecção por T. cruzi das espécies identificadas. Outra informação de grande relevância para orientar as ações de controle foram as relações estabelecidas entre a distribuição dos vetores autóctones e os limites de sua dispersão, determinados em princípio pelas condições ambientais dos biomas de que faziam parte (Forattini et al., 1981; Silveira, 2011).
Pessoa (1962) abordou a íntima associação entre a domiciliação de triatomíneos e a epidemiologia da doença de Chagas, onde a transmissão vetorial é favorecida pela coabitação entre o vetor e o homem.
Em 1980, Forattini já havia elaborado hipóteses para explicar o processo de domiciliação dos triatomíneos, mencionando que a partir do desenvolvimento da domiciliação e do progredir das alterações do meio, instala-se o isolamento domiciliar que tenderá cada vez mais, à diferenciação desse comportamento. Compreende-se, assim, a possibilidade de evolução no sentido de populações acentuada ou mesmo estritamente sinantrópicas.
Na biologia evolutiva, o termo adaptação descreve o processo pelo qual uma característica, devido ao aumento do valor adaptativo, foi moldada por forças específicas de seleção natural fixando a variação genética (Futuyma, 1995). Para triatomíneos, Aragão (1983) cita o ecletismo alimentar como uma das características adaptativas ao ecótopo domiciliar.
Alguns autores (Forattini, 1980, Aragão, 1983, Silveira & Vinhaes, 1999, Dias et al., 2000) mencionaram que a adaptação ao ambiente antrópico pode ter facilitado a dispersão de dois dos mais importantes vetores da doença de Chagas da América Latina: T. infestans e P. megistus. Aragão (1983) mencionou que a adaptação ao ambiente domiciliar possa ter ocorrido devido ao ecótopo domiciliar minimizar as diferenças ambientais, sendo relativamente uniforme mesmo em diferentes condições climáticas.
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Segundo revisão realizada por Schofield & Dias (1999), o processo de domiciliação em triatomíneos pode ser encarado como uma extensão da rota evolutiva de predador para sugador em ninhos-abrigo, onde o habitat domiciliar representa simplesmente um novo tipo de abrigo de vertebrado. Segundo esses mesmos autores, existem indicações de que o fenômeno da domiciliação trate-se de uma especialização. Em conclusão, Schofield & Dias (1999) mencionaram que, embora tenham sido desenvolvidas razoáveis explicações para o processo de domiciliação, as pesquisas ainda estão distantes da elucidação dos mecanismos que esclareçam esse evento, indicando que talvez, estejamos diante de um dos maiores desafios nos estudos de triatomíneos para as próximas décadas.
Silveira & Rezende (1994) classificaram os triatomíneos de acordo com o status de domiciliação e sinantropia, relacionando-os com o potencial vetorial. Forattini (1980) levantou uma série de discussões sobre a origem do fenômeno da domiciliação. As opiniões divergem desde um simples oportunismo frente à escassez das fontes naturais de alimento até um possível processo gradual de adaptação, sujeito à seleção natural.
Ferramentas moleculares e morfométricas buscam elucidar a dinâmica populacional dos insetos entre ambientes domiciliar e silvestre mostrando a dispersão espacial e ecológica dentro e entre as populações de triatomíneos (Dujardin et al., 1998a; 1998b; Borges et al., 2005; Bargues et al., 2006; Almeida et al., 2008).
Silveira et al. (2001a; 2001b) e Almeida et al. (2008) observaram que o tempo de reinfestação de T. brasiliensis em um domicílio tratado com inseticida pode variar de seis meses a dois anos dependendo de fatores ecogeográficos e sugeriram que fatores genéticos também estariam envolvidos no processo de domiciliação.
Importa considerar que, dependendo do grau de adaptação de diferentes espécies vetoras a ecótopos artificiais, fundamentalmente ao domicílio humano, a vulnerabilidade ao controle será maior ou menor. Espécies introduzidas, não autóctones, são passíveis de eliminação e, uma vez eliminadas, isso pode significar a interrupção definitiva da transmissão vetorial em determinada área, desde que não existam aí espécies nativas, e desde que se impeça a re-infestação a partir de outras áreas. Tratando-se de espécies autóctones, o controle esperado é a extinção de colônias domiciliadas e impedir sua re-colonização, pela manutenção de ações estritas de vigilância entomológica. Dessa forma, evita-se que haja um risco continuado de transmissão (Silveira & Dias, 2011).
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A correta identificação e o conhecimento do relacionamento e história evolutiva de diferentes espécies de Triatominae são fundamentais para a vigilância entomológica da doença de Chagas e tem importância operacional nas atividades de controle e/ou eliminação de espécies domiciliadas e silvestres que apresentam tendências de domiciliação.
1.9. Marcadores moleculares
As análises moleculares têm revolucionado as ciências biológicas, principalmente pela ampla aplicação em diversas áreas da pesquisa científica. A correta identificação das entidades biológicas e possíveis relações filogenéticas e evolutivas possibilitam estudos de epidemiologia, comportamento, fisiologia, intervenções de controle e monitoramento de vetores (Abad-Franch & Monteiro, 2005).
Com o intuito de contribuir com os estudos filogenéticos de Triatominae, algumas ferramentas moleculares tem sido aplicadas, como o RAPD (“Random Amplified Polymorphic DNA”) (García et al., 1998; Pacheco et al., 2003), sequenciamento de genes nucleares (Monteiro et al., 2000; Bargues et al., 2002; Marcilla et al., 2002) e mitocondriais (García & Powell, 1998; Lyman et al., 1999; Monteiro et al., 2000; 2004; Hypsa et al., 2002; Sainz et al., 2004) e RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphism”) (Naegele et al., 2006).
Os marcadores moleculares têm sido amplamente empregados como uma valiosa ferramenta para descrever os padrões da variabilidade genética em populações naturais, e estimar parâmetros de genética de populações e com a sua utilização é possível quantificar a variação dentro e até mesmo avaliar a distribuição da variação entre populações, fluxo gênico entre populações e a distinção genética de unidades taxonômicas. Alguns parâmetros, como o número de alelos por loco, a porcentagem de locos polimórficos, a heterozigosidade observada, heterozigosidade esperada, equilíbrio de Hardy-Weinberg, e o índice de fixação têm sido usados na caracterização da variabilidade genética intrapopulacional. Entre os marcadores de DNA mais utilizados nos últimos anos para estudar os níveis e padrões de distribuição de variabilidade genética destaca-se o mtDNA (Avise, 2000).
As vantagens em usar o mtDNA em estudos populacionais e filogenéticos é que ele possui uma elevada taxa de mutação, sendo de 5 a 10 vezes maior (1 X 10-8 substituição/sítio/geração)
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do que os genes codificadores de proteínas do DNA nuclear (Brown et al., 1982; Li, 1997). Esse fenômeno ocorre devido a alguns atributos desse material genético: (a) mtDNA não codifica proteínas envolvidas diretamente em sua própria replicação ou transcrição e produz apenas 13 proteínas; (b) ineficiência dos mecanismos de reparo, alta exposição a radicais livres mutagênicos no ambiente oxidante da mitocôndria; e (c) o fato do mtDNA não estar associado a proteínas histônicas, que são evolutivamente conservadas. Por essa razão, as variações intraespecíficas são mais fácilmente detectáveis (Wilson et al., 1985; Li, 1997; Nedbal & Flynn, 1998).
Além das características moleculares inerentes ao mtDNA a ampla utilização deve-se também pelo fato da facilidade em isolá-lo, ao grande número de cópias por célula, o tamanho reduzido e sua organização simples (Avise et al., 1984). Essa ferramenta tem sido utilizada extensivamente nas últimas três décadas para inferir o passado evolutivo e demográfico de populações e espécies (Ballard & Withlock, 2004).
O genoma mitocondrial completo tem sido sequenciado em diversas espécies de insetos, como em Diptera (Clary & Wolstenholme, 1985; Beard et al., 1993; Lewis et al., 1995; Krzywinski et al., 2006), Coleoptera (Bae et al., 2004), Hymenoptera (Crozier & Crozier, 1993), em Lepidoptera (Yukuhiro et al., 2002). Entre as espécies de Hemiptera a única espécie que teve o genoma mitocondrial totalmente sequenciado foi Triatoma dimidiata (Dotson & Beard, 2001). A organização do genoma mitocondrial (Figura 4) é relativamente simples, sendo constituído por uma dupla fita circular contendo 37 genes, dos quais dois codificam RNA ribossômico, 22 codificam RNA transportadores e 13 codificam proteínas (Dotson & Beard, 2001).
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Estudo de variabilidade genética e relações evolutivas em Triatominae tem utilizado amplamente sequencias de genes mitocondriais em suas análises (Stothard et al., 1998; Garcia & Powel, 1998; Lyman et al., 1999; Monteiro et al., 2000; Hypsa et al., 2002; Sainz et al., 2004). Esses estudos têm confirmado a separação entre as tribos Triatomini e Rhodniini e a diferenciação de espécies morfologicamente similares como R. prolixus, R. robustus, R. neglectus e R. nasutus. O sequenciamento de genes mitocondriais também tem sido usado para analisar a variabilidade genética de populações de triatomíneos (Garcia et al., 2003; Monteiro et al., 1999; 2003; 2004; Fitzpatrick, 2005), permitindo detectar complexos de espécies crípticas em R. robustus (Monteiro et al., 2003) e T. brasiliensis (Monteiro et al., 2004), sendo uma ferramenta muito útil em estudos de sistemática e filogeografia de espécies de triatomíneos.
Lyman et al. (1999) ao utilizarem dois genes mitocondriais demonstraram que as duas maiores tribos previamente propostas pela taxonomia clássica para a subfamília Triatominae (Triatomini e Rhodniini) se posicionaram em clados claramente suportados de forma robusta. Esses autores ainda indicaram o monofiletismo para os gêneros Psamolestes e Rhodnius.
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A variação de um fragmento de um gene do mtDNA (Cit B) por meio da abordagem de NCPA (Nested Clade Phylogeographic Analyses) demonstrou que as populações das espécies do complexo T. brasiliensis foram um resultado de expansão populacional (da população ‘brasiliensis’) seguida por fragmentação ocorrida no passado e que a diferenciação ocorreu devido a isolamento por distância geográfica (Monteiro et al., 2004).
Em análise ecotípica, espacial e temporal de populações de T. brasiliensis, utilizando o gene mitondrial Cit B, Almeida et al. (2008) concluíram que as reinfestações domiciliares, após tratamento com inseticida, eram compostas de diferentes populações, apontando para diversas fontes para as infestações domiciliares.
1.10. Genética populacional
População é o termo utilizado para definir um grupo de indivíduos de uma mesma espécie que coexiste numa mesma área e tempo. Cada população apresenta uma organização (ou estrutura) própria, que é resultado de características intrínsecas da espécie, de fatores físicos do ambiente onde ela se encontra, e de interações intraespecíficas e interespecíficas. Alguns aspectos importantes da estrutura populacional são: densidade de organismos, espaçamento entre eles, migrações, proporção de indivíduos em diferentes classes etárias, sistema de acasalamento, estrutura genética e disposição em áreas de habitat propício (Ricklefs & Miller, 2000).
A definição do termo populações sob um âmbito ecológico é de um grupo de indivíduos da mesma espécie vivendo em uma área restrita, o que permite o intercruzamento. Sob o ponto de vista genético, uma população é um grupo de indivíduos que compartilham um determinado “pool” genético, o que permite o intercruzamento. A genética populacional é a ciência que estuda a diferenciação dentro e entre populações e tenta mensurar essas variações, buscando as causas que levaram à diferenciação (Futuyma, 1995).
Segundo Futuyma (1995), genética de populações é um ramo da biologia evolutiva, que determina o nível e a distribuição de polimorfismo genético em populações naturais e detecta as forças evolutivas (mutação, migração, seleção e deriva) que determinam o padrão de variação genética observada. Idealmente, a melhor maneira de quantificar a variação genética em populações naturais deve ser feita por comparação de sequências de DNA (Kreitman, 1983).
