Aspectos genéticos relacionados à SAB

2.2.5.1 Polimorfismos de base única (SNPs)

Com a modernização das técnicas de sequenciamento e, com o estabelecimento de consórcios entre laboratórios e centros de pesquisa de vários países, tornou-se possível o sequenciamento do genoma de diversos organismos incluindo o genoma humano (LANDER et al., 2001; VENTER et al., 2001), que atualmente é considerado completo (COLLINS et al., 2003). Antes disso, era esperado que a espécie Homo sapiens fosse detentora de aproximadamente 100 mil genes, mas, após o sequenciamento, viu-se que o genoma da espécie humana é composto por cerca de 30 mil genes. Assim, talvez a resposta para a complexidade da espécie humana esteja não no número de genes, mas na regulação da expressão destes. Em contrapartida, no decorrer do processo de sequenciamento, foram identificados milhões de polimorfismos de base única (SNPs, do inglês Single Nucleotide

Polimorphisms) e sua identificação no genoma humano tem contribuído de

forma significativa para os estudos moleculares, principalmente aqueles ligados ao mapeamento genético (SACHIDANANDAN et al., 2001).

Os SNPs são encontrados no genoma humano aproximadamente a cada 500 pares de bases, sendo mais frequentes em regiões intrônicas e menos frequentes em regiões codificantes, ou seja, sua ocorrência não é totalmente

aleatória, mas depende da região do gene. Deste modo, os SNPs representam as variações mais comuns no genoma humano. São geralmente de natureza polimórfica do tipo bialélica, podendo ocorrer em menor frequência polimorfismos tri ou tetralélicos (BROWN, 2002). A maior frequência de polimorfismos do tipo bialélico pode ser devida ao fato de que o SNP é originado por uma mutação pontual no genoma. Essas mutações são originadas através de erros na replicação do DNA, como, por exemplo, falhas da enzima DNA polimerase, que podem ser do tipo transição, mais frequentes, ou do tipo transversão, mais raras. As transversões são, geralmente, causadas por alterações químicas (metilação, desaminação oxidativa, tautomeria) de origem espontânea ou induzida (BROWN, 2002). Para que ocorra a fixação das mutações, forças evolutivas como seleção natural, derivação gênica e fluxo gênico devem atuar na população modulando as variações. Para que um terceiro alelo ocorra, é necessário uma segunda mutação em outro indivíduo, distinta da primeira, na mesma posição no genoma, levando à ocorrência de um SNP trialélico na população. A fixação desses alelos ocorrerá se as mutações forem transmitidas para as gerações futuras e se mantiverem em frequência na população (BROWN, 2002).

A primeira estimativa do possível número de SNPs no genoma humano foi de 1,42 milhão de SNPs por Sachidanandan et al. (2001). Atualmente, o banco de dados de SNPs do Centro Nacional para Informação Biotecnológica dos EUA (do inglês, NCBI, National Center for Biotechnology Information), apresenta mais de 23 milhões de polimorfismos do tipo SNP. Com base na análise funcional de SNPs presentes em regiões codificantes e devido à degeneração do código genético, que resulta em SNPs sinônimos (que não resultam em alterações de aminoácido), menos de 1% dos SNPs exercem impacto direto na estrutura e função do produto gênico final (VENTER et al., 2001). Portanto, a grande maioria dos SNPs está presente em regiões não codificantes ou representam alterações silenciosas. Porém, há evidências de que polimorfismos em regiões não codificantes podem estar envolvidos em processos de regulação de expressão gênica, como alteração de sítio de “splicing” e produção de microRNAs (miRNA) (PROKUNINA, ALARCÓN- RIQUELME, 2004; WEBER, 2005). Em eucariotos, os níveis de RNAm e

proteína são controlados frequentemente por elementos regulatórios na região não codificante 3´UTR (do inglês, untranslated region), assim polimorfismos nessa região podem atuar na regulação da expressão gênica (MAZUNDER; SESHADRI; FOX, 2003; STANDART, JACKSON, 2007).

O grande desafio para a medicina genômica está na compreensão de como a variabilidade alélica e a ocorrência dos polimorfismos gênicos estão relacionados com a predisposição para o desenvolvimento de doenças complexas e mecanismos variados de resposta às drogas (NEBERT; ZHANG; VESELL, 2008). Sendo assim, o mapeamento de SNPs torna-se uma ferramenta eficaz em estudos de associação em populações (KRUGLYAK, 1999).

O sequenciamento do genoma humano aliado aos custos relativamente baixos de amplificação de DNA por reação em cadeia pela polimerase (PCR -

polymerase chain reaction) têm tornado comum o procedimento de análise de

DNA na medicina clínica e ciências básicas. Nos últimos anos, milhares de trabalhos científicos foram publicados, divulgando estudos de biologia molecular, bem como associações de mutação/polimorfismos com doenças humanas. Entretanto, a coleta de amostras para a extração de DNA é um processo crítico, uma vez que é demorado e pode envolver aspectos éticos importantes, sendo, portanto, desejável que este procedimento torne-se mais simples e barato. Na maioria dos casos, a fonte preferida de material para análise é o sangue periférico, no entanto, a coleta pode ser problemática em casos como doença grave, pacientes idosos, bebês e pessoas que não estão dispostos a serem submetidas a este procedimento “invasivo”. Por esta razão, vários protocolos têm sido desenvolvidos para a obtenção de DNA a partir de células epiteliais (AIDAR; LINE, 2007).

Entre as fontes consideradas convenientes para extração de DNA estão as células da mucosa oral, que permitem estabelecer diagnósticos e estudos epidemiológicos. Várias abordagens têm sido desenvolvidas para o seu isolamento, e as mais frequentemente utilizadas são: método de lise por ebulição, obtendo-se DNA de baixa qualidade; fenolclorofórmio, que é trabalhoso e utiliza reagentes tóxicos; e kits disponíveis comercialmente, que não são tóxicos e são de fácil utilização. Aidar e Line (2007) propuseram um

protocolo simples, prático e de baixo custo para obtenção de DNA genômico de alta qualidade a partir de células do bochecho bucal. Os procedimentos usados neste estudo evitam o uso de solventes orgânicos permitindo uma prática laboratorial mais segura. Isto é alcançado pela remoção das proteínas celulares por desidratação e precipitação com uma solução saturada de acetato de amônio. Este protocolo permite a extração de maneira rápida, simples, econômica e garante o processamento de várias amostras ao mesmo tempo, facilitando assim os procedimentos laboratoriais. Suas análises forneceram evidências consistentes de que o DNA extraído por esta metodologia é suficiente para diversas amplificações por PCR.

Têm sido proposta a utilização de saliva como meio de análise por métodos sialométricos e sialoquímicos para detecção de doenças ou acompanhamento de tratamentos realizados, onde determinados elementos orgânicos e inorgânicos podem ser investigados e assim contribuir para o diagnóstico de doenças (KÜSTNER; MARQUES-SOARES, 2002). As principais buscas realizadas são dosagens hormonais; pesquisa de agentes biológicos virais, bacterianos e fúngicos; além de marcadores biológicos úteis no diagnóstico e prognóstico do câncer. Segundo uma revisão da literatura realizada por De Moura et al. (2007A), os avanços nos estudos de métodos de diagnóstico e acompanhamento de condições bucais e sistêmicas que utilizam saliva como meio biológico apresentam resultados promissores, o que poderá constituir um meio de exame usado na rotina clínica.

2.2.5.2 Desequilíbrios de Ligação

Desequilíbrio de ligação (DL) é um fenômeno genético definido como associação não aleatória entre alelos de dois ou mais loci que estão estreitamente ligados. As principais medidas do DL são D’ e r2, sendo que a primeira identifica regiões em que há pouca recombinação e a segunda está relacionada com o poder de detectar a associação, pois avalia o DL completo, o qual se refere ao quadrado do coeficiente de correlação entre a frequência dos alelos em dois loci. Assim, pode-se afirmar que um r2 de pelo menos 0,8 (80%) entre um par de polimorfismos de base única (SNP) indica que eles

estão em alto DL. Estudos de associação genética indireta utilizando SNPs são possíveis porque dependem da existência do desequilíbrio de ligação (DL) entre marcadores genéticos e o locus da doença (CLARK, 2003).

DL é um conceito de correlação estatística entre alelos que segregam juntos em dois ou mais loci, já o equilíbrio de ligação refere-se ao estado em que os alelos em seus respectivos loci são independentemente distribuídos em relação a outro alelo em locus alternativo. Uma variedade de processos pode acarretar o DL em um conjunto de cromossomos, entre eles: seleção natural, miscigenação e novas mutações (SCHRODI et al., 2007). Nesse contexto, a combinação particular de alelos em desequilíbrio de ligação ao longo de um segmento cromossômico de baixa recombinação, herdado de forma independente, é denominado haplótipo (THE INTERNATIONAL HAPMAP

CONSORTIUM, 2005).

Como o DL é uma medida estatística, o seu cálculo é baseado em medir o quanto um alelo está associado ao outro. Os métodos estatísticos mais utilizados são baseados nas frequências alélicas dos loci estudados, onde é verificada a diferença entre a frequência de haplótipo observada e esperada através do parâmetro de desequilíbrio de ligação (D´). Assim, as estatísticas de DL variam no modo em que empregam essa diferença. O primeiro modelo é o desequilíbrio gamético simples ou D´. Essa estatística estabelece que os alelos dos loci sejam idênticos por estado. O desequilíbrio gamético simples é baseado nas frequências alélicas observadas. Já o segundo modelo para cálculo de DL é conhecido como r2. Este é baseado na probabilidade de que dado dois alelos em determinado locus sejam idênticos por descendência, então dois alelos em um segundo locus também serão idênticos pelo mesmo modo (DALY et al., 2001).

O estudo de SNPs em DL é uma estratégia para identificar genes de susceptibilidade em doenças complexas (SCHRODI et al., 2007). O sucesso deste tipo de estudo depende unicamente do DL entre SNPs funcionais e SNPs comuns, tido como marcadores ao redor do SNP causal. Nas regiões de alto DL pode haver SNPs comuns que indiquem associação por estarem em DL com o SNP causal. Os SNPs que possuem essa característica são chamados de tagSNPs, pois representam outros com grande eficiência estatística em

regiões com alto desequilíbrio de ligação. As chances de se detectar uma associação genotipando parte dos polimorfismos nessas regiões podem ser as mesmas do que quando se genotipa todos os SNPs. Ao contrário, em regiões de baixo desequilíbrio de ligação, faz-se necessário, a fim de encontrar loci associados com doença, a genotipagem de todos os polimorfismos existentes, pois há baixa correlação entre eles, o que torna dispendioso os estudos de associação genética (INTERNATIONAL HAPMAP CONSORTIUM, 2005).

Portanto, o uso de blocos haplotípicos em estudos de associação por DL tem grande importância na associação de genes candidatos em doenças complexas. Avanços nas tecnologias mais simples permitem que os estudos sejam feitos tanto em regiões gênicas de pequenas extensões em estudos de associação indireta como em estudos de associação em genoma completo (SLADEK et al., 2007). Sendo assim, o entendimento da relação entre estrutura genética das populações e padrões de DL é cada vez mais importante nos estudos de associação.

2.2.5.3 Polimorfismos genéticos e suas correlações com doenças

Os SNPs são variações genéticas que ocorrem com frequência superior a 1% dentro de uma população e têm sido amplamente investigados na tentativa de se determinar as bases biológicas dos traços pessoais e condições patológicas (HEINRICHS; LOOK, 2007; PARLIAMENT; MURRAY, 2010; BORCHIELLINI et al., 2012). A predisposição a várias doenças humanas comuns como câncer, asma ou diabetes mellitus tem sido relacionada com alterações poligênicas, destacando-se o estudo da associação entre SNPs com a susceptibilidade a essas doenças ou respostas aos tratamentos propostos (PARLIAMENT; MURRAY, 2010; BORCHIELLINI et al., 2012; BUTKIEWICZ et al., 2012). Um exemplo relevante do papel dos SNPs é a radiosensibilidade. Aparentemente, as variações polimórficas em genes que codificam proteínas envolvidas nas vias de resposta à radiação podem afetar esta resposta, e os efeitos combinados de múltiplos SNPs em vários genes de uma ou mais vias de reparo de DNA podem exibir impactos maiores nos fenótipos patológicos do que SNPs em um gene isolado (RICCERI; MATULLO; VINEIS, 2012).

Segundo Pratesi et al. (2011), os SNPs nos genes de reparo de DNA podem alterar a função protéica e a capacidade individual para reparar o DNA lesionado. Aiello et al. (2011) sugerem que os diferentes tipos de SNPs e mutações em vários tipos de cânceres podem auxiliar na previsão da reposta clínica ao tratamento quimioterápico e sua toxicidade, já que essas alterações genéticas podem afetar o metabolismo das drogas usadas comumente na quimioterapia. Alguns SNPs comuns de baixa penetrância em genes que controlam o reparo do DNA têm sido relacionados com uma maior susceptibilidade ao câncer e consequentemente com uma maior ocorrência de casos de câncer na população (ERICHSEN; CHANOCK, 2004; GAL et al., 2005).

Existem aproximadamente 150 genes que codificam enzimas envolvidas no reparo de vários tipos de danos ao DNA. A maioria das variações nessas enzimas resulta em alterações nos níveis e ou na atividade enzimática. Dessa forma, SNPs nos genes que codificam proteínas envolvidas em vias metabólicas ativadas após algum dano ao DNA podem influenciar a capacidade de reparo do DNA, alterando as propriedades funcionais de determinadas enzimas e modulando a susceptibilidade ao câncer e a outras desordens degenerativas (ANDRESSOO; HOEIJMAKERS; MITCHELL, 2006; PABALAN et al., 2010; WLODARCZYK; NOWICKA, 2012).

2.2.5.4 Interleucina-6 e a SAB

A interleucina-6 (IL-6) é uma citocina produzida pelo gene IL6, localizado na região 21 do braço curto do cromossomo 7 (cromossomo 7 p21) (BORAS et al., 2006). Apresenta 5 exons e 4 introns e está relacionada com respostas imunes antígeno específicas e reações inflamatórias, sendo um dos principais mediadores da fase aguda da inflamação. Estimula a resposta imune, por exemplo, durante a infecção e após trauma, especialmente em queimaduras ou outros danos nos tecidos, conduzindo à inflamação e tem ainda fundamental papel na indução da febre (em nível de hipotálamo) (GUIMARÃES et al., 2006). Ademais, esta citocina estimula a produção de proteínas da fase aguda da inflamação nos hepatócitos (CHEN et al., 2007) e tem ação importante na

atração de eosinófilos para o local da inflamação. Nos seres humanos, a IL-6 é secretada por células T e macrófagos. Pequenos aumentos crônicos nos seus níveis plasmáticos de repouso estão associados com obesidade, baixo nível de atividade física, resistência insulínica, diabetes mellitus tipo 2, doença cardiovascular, além de servirem como preditores de mortalidade, enquanto que aumentos menos expressivos podem ser encontrados em doenças inflamatórias e infecciosas (BORAS, 2006; SIMCIĆ et al., 2006). Assim como a IL-1, a IL-6 também estimula a produção de ACTH pela hipófise, estabelecendo um “feedback negativo” entre o sistema imune e o eixo neuroendócrino (GAL et al., 2005; PEZELJ-RIBARIĆ et al., 2013).

Poucos estudos têm buscado uma explicação genética para a ocorrência da SAB e algumas pesquisas apontam para um possível papel de citocinas como interleucina 2 (IL-2) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) na iniciação da SAB (PEKINER et al., 2008). Guimarães et al. (2006) investigaram uma possível associação entre SNPs funcionais relacionados com a produção de citocinas e a ocorrência de SAB, sendo encontrado um aumento significativo na produção de inteleucina-1β (IL- 1β) nos pacientes acometidos pela síndrome. Com isso, os autores sugerem que a presença desses SNPs pode ter um papel importante na patogênese da síndrome. Simcić et al. (2006) encontraram níveis elevados de interleucinas 2 (IL-2) e 6 (IL-6) em pacientes com SAB, achado que demonstrou correlação estatisticamente significativa com a intensidade do ardor. Essa produção exacerbada das interleucinas mencionadas poderia ser decorrente de variações polimórficas no grupo de indivíduos estudados.