Algo similar ocorre com azido-cumarinas, que se tornam fluorescentes após a cicloadição com alcinos.107 Essa característica foi utilizada para a marcação de nucleotídeos108 e de cromossomos109 via cicloadição 1,3-dipolar de azida e alcino.
Outra aplicação dessa reação “Click” é a localização de alvos biomoleculares de fármacos ou potenciais substâncias bioativas.110 Algumas linhagens de células tumorais foram tratadas com um análogo propargílico do ácido acetilsalicílico 42 e, após a acilação, as biomoléculas foram funcionalizadas com o alcino. Em seguida, estas biomoléculas foram tratadas com uma azido-rodamina em condições de reação “Click” catalisada por cobre (I). Por detecção de fluorescência, foram encontradas mais de cem proteínas que não tinham sido reportadas como alvos do ácido acetilsalicílico.111 Um derivado da nor-β-lapachona, que é conhecida por sua atividade antitumoral, foi ligado por um anel 1,2,3-triazólico a um 2,1,3- benzotiadiazol (BTD) com propriedades fluorescentes (composto 43). A molécula híbrida 43 transpôs a membrana celular e foi localizada no citoplasma das células de MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama).112
1.12 Benzotiadiazol como sonda fluorescente
Os derivados de 2,1,3-benzotiadiazol (BTD) têm se mostrado sondas eficazes em muitas análises por bioimagem e uma alternativa aos marcadores fluorescentes mais conhecidos, como as fluoresceínas, BODIPY, cumarinas e rodamina.113 Os análogos de BTD apresentam características que os tornam sondas de interesse,110,113 tais como:
Eficiência (alto rendimento quântico) e estabilidade em estados excitados por longos períodos de irradiação;
Estabilidade por transferência intramolecular de carga (ICT, sigla inglesa); Altamente polarizado, permitindo interações intermoleculares;
Grande deslocamento de Stokes, o que evita erros por auto-absorção;
Excitação na região de luz visível, prevenindo alterações no sistema biológico devido à elevação da temperatura;
Apresenta brilho intenso sem cintilação; Estocagem à temperatura ambiente por anos;
Transposição da membrana celular e seletividade de associação.
Embora a presença de uma sonda possa mudar a resposta da atividade biológica da molécula de estudo, esta estratégia tem sido muito utilizada experimentalmente, inclusive aproveitando as propriedades de derivados de BTD.112,113
Por exemplo, o BTD derivado do ácido oleico 44 pode ser empregado para visualizar a dinâmica de ácidos graxos em células tumorais.114 O análogo BTD-2NH2 45 emitiu fluorescência após sofrer redução dos grupos nitro do precursor 46 em
células MG63 (osteosarcoma), sendo seletivo para estas células hipóxias.115
Uma cadeia de DNA no qual foi inserido o anel BTD pode ser útil como bloco de construção de biomateriais fluorescentes.116 O derivado BTD 47 foi seletivo em baixas concentrações para a detecção espectroscópica e quantificação de DNA. Sua interação ocorreu por intercalação nos nucleotídeos. Avaliando outros análogos de BTD, foram determinadas as suas características estruturais que permitiram tal resultado (Figura 7).117
Figura 7: Arquitetura do análogo BTD 47.
Ambos os substituintes do derivado 4,7-substuído-BTD 47 possuem funções diferentes. A extremidade fenilacetilênica é responsável pela intercalação ao DNA, enquanto que o grupo 4-metoxifenila é essencial para a propriedade fluorescente do composto. A fluorescência ocorre devido ao processo de transferência intramolecular de carga. Em 47, isso é possível porque o BTD é um grupo retirador de elétrons e o substituinte 4-metoxifenila é um forte doador de elétrons em uma
estrutura química plana. Além disso, há uma extensa conjugação π, corroborada pelo grupo fenilacetilenênico, que diminui a energia de transição π-π*, aumentando o comprimento de onda de absorção da molécula.117
Entretanto, derivados de BTD monossubstituídos também apresentaram ótimos resultados. Com bioimagem, foi observado que os compostos BTD-Br (48) e BTD-H (49) foram seletivos para mitocôndrias em células de MCF-7 (adenocarcinoma de mama).118
Similar ao trabalho com DNA acima, o BTDShiny (50) possui um substituinte seletivo para mitocôndrias.119 Então, outros derivados de BTD foram sintetizados e testados contra linhagens de células tumorais. Com isso, foi possível desenvolver um análogo de BTD que possui um substituinte que atribui alta emissão de fluorescência e outro que se associa fortemente às mitocôndrias. Essa molécula foi chamada Splendor (51).110
Por esses motivos, o BTD como sonda biomolecular está passando do estágio de prova-de-princípio para ser adotado pela comunidade científica.113
Tendo em vista a pesquisa a respeito de derivados de goniotalamina como antitumorais, a literatura apresenta apenas dois exemplos de análogos heteroaromáticos do produto natural 1.12e,63 Devido aos muitos atributos em Química Medicinal do 1,2,3-triazol e sua facilidade de síntese através de reações de cicloadição 1,3-dipolar catalisada por cobre, o presente trabalho tem como primeira proposta desenvolver rotas sintéticas para a obtenção dos análogos 1,2,3-triazólicos de goniotalamina 52 e 53 por meio de reação “Click”.
Desse modo, o protocolo de cicloadição 1,3-dipolar de azidas e alcinos permite ligar o grupo farmacofórico da goniotalamina (1) — a lactona α,β-insaturada — a várias outras estruturas para fins de estudo biológico a fim de avaliar a atividade citotóxica quando o anel benzênico ou o grupo estirênico são substituídos por anéis 1,2,3-triazólicos ligados à alquila, à benzila ou sem substituinte.
Para tanto, os derivados 52 e 53 são submetidos a ensaios de citotoxicidade frente a linhagens tumorais e de queratinócitos humanos utilizando a goniotalamina (1) e a doxorrubicina como substâncias-padrão. Estes testes são realizados em colaboração com o grupo de Farmacologia do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da UNICAMP.
A segunda proposta é determinar a localização celular de híbridos fluorescentes de goniotalamina (1) em linhagens tumorais, somando aos estudos de determinação do mecanismo de ação deste produto natural e ao uso de derivados de BTD como sondas fluorescentes para bioimagem de substâncias bioativas em células tumorais.
Para iniciar esta pesquisa, planeja-se sintetizar o híbrido goniotalamina-2,1,3- benzotiadiazol (GTN-BTD) 54, em que o grupo farmacofórico de 1 é mantido e o anel aromático é substituído por uma estrutura com propriedades fluorescentes — o BTD. A seguir, objetiva-se determinar as propriedades fotofísicas na Universidade
de Brasília em colaboração com os professores Brenno A. D. Neto e José Raimundo Correa.
Ainda, pretende-se sintetizar o composto híbrido 55, que apresenta um espaçador entre o BTD e a estrutura completa da goniotalamina (1). O espaçador 1,2,3-triazol-proprila permite separar eletronicamente a sonda fluorescente da molécula do produto natural 1, algo que não é observado no GTN-BTD (54). Acredita-se que o grupo alquila de três carbonos possa não influenciar significativamente na atividade biológica de 1, enquanto que o anel 1,2,3-triazólico foi escolhido por haver estudos precedentes na literatura para ligar compostos bioativos a BTD,112 e também porque sua viabilidade sintética e biológica fora estudada no presente trabalho.
A seguir, planeja-se submeter os compostos 54 e 55 à avaliação biológica contra linhagens tumorais, em conjunto com os compostos 1 e 56-59, de modo a verificar a importância de cada parte da estrutura química — BTD, espaçador, lactona — para a atividade citotóxica, cujo conhecimento também é um requisito para a realização dos experimentos de bioimagem.
Por fim, depois dos resultados fotofísicos de fluorescência e da avaliação citotóxica, objetiva-se submeter os compostos 54 e 55 a ensaios de bioimagem utilizando microscopia confocal. Este estudo pode determinar a localização celular destas duas substâncias em linhagens de câncer, além de ampliar a discussão sobre o mecanismo de ação da goniotalamina (1). Estas práticas de bioimagem são realizadas em colaboração com os professores Brenno A. D. Neto e José R. Correa, da Universidade de Brasília, e com a Dra. Maria Augusta Arruda, Dra. Tracey D. Bradshaw e Professor Barrie Kellam, da Universidade de Nottingham, Inglaterra.
3.1 Síntese e avaliação biológica de análogos triazólicos da goniotalamina
3.1.1 Estudo da síntese de análogos 1H-1,2,3-triazólicos da goniotalamina
O análogo triazólico mais simples da goniotalamina (1) é o composto 1H- 1,2,3-triazol 60. A fim de se obter este produto, realizaram-se algumas investigações sintéticas a partir do álcool propargílico (61) e do (E)-pent-2-en-4-in-1-ol (62). Estes materiais de partida possuem um grupo alcino terminal, em que se pode construir o anel 1,2,3-triazólico via reação “Click” catalisada por cobre (I). A partir do grupo hidroxila de 61, pode-se formar a olefina externa e, a seguir, a lactona α,β- insaturada. Ao se iniciar a síntese com 62, pode-se construir a diidropiranona diretamente a partir de sua hidroxila (Esquema 8).