Análogos de goniotalamina : síntese e avaliação biológica de triazóis e de híbridos fluorescentes

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

ISMAEL RAITZ

ANÁLOGOS DE GONIOTALAMINA: SÍNTESE E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE TRIAZÓIS E DE HÍBRIDOS FLUORESCENTES

CAMPINAS 2017

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ISMAEL RAITZ

ANÁLOGOS DE GONIOTALAMINA: SÍNTESE E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE TRIAZÓIS E DE HÍBRIDOS FLUORESCENTES

Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências

Orientador: Prof. Dr. Ronaldo Aloise Pilli

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO ISMAEL RAITZ, E ORIENTADA PELO PROF. DR. RONALDO ALOISE PILLI

CAMPINAS 2017

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Dedico este trabalho ao meu pai, José Abel Raitz, e à minha mãe, Ana Maria Raitz, com todo o meu amor.

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AGRADECIMENTOS

Ao meu pai, José Abel Raitz, e à minha mãe, Ana Maria Raitz, os primeiros a me apoiar nessa busca por conhecimento e desenvolvimento pessoal.

Aos meus irmãos, Maristela e Emerson. Ao meu cunhado Fabricio e minha cunhada Vívia. À minha linda afilhada, Mariana, e às minhas lindas sobrinhas, Sandy, Raiely e Ritiely, e à minha linda sobrinha-neta, Lara.

À minha amada Suzane que, com muito amor e dedicação, esteve ao meu lado participando ativamente de muitos momentos dentro e fora do laboratório, demonstrando sempre total apoio ao desenvolvimento do meu trabalho.

Aos pais da Suzane, dona Margaria e seu Hamilton, e à sua irmã, Mirelle. Ao meu primo Jair, que sempre me ajudou nas dúvidas da minha carreira e pelo incentivo durante toda a minha formação na vida acadêmica.

Ao professor Ronaldo Aloise Pilli, sempre muito responsável com este projeto e com a minha formação, criando muitas oportunidades e incentivando-me a aprender e pesquisar sempre mais. Muito obrigado.

Ao professor Barrie Kellam, que supervisionou o trabalho que eu desenvolvi no Centro para Ciências Biomoleculares, da Universidade de Nottingham.

À professora Tracey D. Bradshaw, pela orientação no desenvolvimento e análise dos ensaios biológicos realizados no Centro para Ciências Biomoleculares, da Universidade de Nottingham.

Aos membros da banca examinadora, pela disponibilidade e pelas contribuições dadas pela avaliação da tese.

À Dra. Maria Augusta Arruda, pelo suporte prestado tanto pessoal, quanto profissional durante o período de doutorado-sanduíche em Nottingham.

Ao Dr. Kleber Gomes Franchini, diretor do LNBio-CNPEM e coordenador do grande projeto no contexto do Programa CAPES-UoN Drug Discovery, o qual estava inserido o projeto do doutorado-sanduíche.

Aos professores Brenno A. D. Neto e José Raimundo Correa, da Universidade de Brasília, que realizaram os experimentos fotofísicos e de bioimagem, e por todas as discussões a respeito dos resultados. Ao Dr. Roberto Y. de Souza Filho e da Ma. Lorena P. de Andrade, da Universidade de Brasília, colaboradores no trabalho com o composto híbrido fluorescente.

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Ao professor João Ernesto de Carvalho, do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA), onde foram realizados os ensaios de atividade antiproliferativa in vitro, pela sua colaboração com os resultados biológicos. À Dra. Débora B. Vendramini-Costa e à Ma. Thais Petrochelli Banzato, que realizaram os ensaios de atividade antiproliferativa no CPQBA e pelas discussões sobre os resultados.

Ao corpo docente do Instituto de Química da UNICAMP, principalmente os Diretores, os Coordenadores da Pós-Graduação e os professores do Departamento de Química Orgânica.

À Walkyria, técnica do laboratório do professor Pilli, que prestou um grande suporte na execução do trabalho. Ao Lee Hibbet, técnico dos laboratórios no Centro para Ciências Biomoleculares da Universidade de Nottingham, e à Jane Doughty, funcionária no mesmo Centro.

Aos funcionários do Instituto de Química da UNICAMP, principalmente à Bel (secretaria da CPG), à Paula, ao Anderson e ao Gustavo (Central Analítica).

Às amigas Marjorie e Daniela, pelo suporte com o projeto realizado na Universidade de Nottingham.

Aos amigos do Instituto de Química, principalmente Luis Henrique, Lucas, Júlio Milan, Marcela, Matheus, Thiago, Ian, Emerson, Franco, Kishore, Lívia, Vânia, Karla, Chiko, Ricardo e Nagendra.

Aos amigos da Universidade de Nottingham, principalmente o Dr. Shailesh Mistry, Dra. Sarah Mistry, Dra. Sarah Cully, Cristian, Zhi, Emanuel, Will, Alastair, Shahadat, J. B., Jean, Nádia, Jonathan, Danieli, Liciane e Emiliana.

Aos amigos Rosi, Júlio Pastre, Gilmar, Rodrigo, Carol, Danilo, Emílio, Ellen, Luiz Novaes, Bruno, Henrique, Airton, Roberto e Mohammed Al-Hayali pelo companheirismo e todas as discussões sobre química e biologia.

Aos amigos Fabrício, Nilton e Clive, que ofereceram grande ajuda no âmbito pessoal.

Aos amigos Ricardo Labes e Rafael Levi Coelho, pelas discussões.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pela bolsa de doutorado e taxa de bancada. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela bolsa de doutorado-sanduíche. Ao Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão (UNICAMP), pelo auxílio-ponte. E à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo suporte financeiro ao laboratório.

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RESUMO

A goniotalamina (1) é uma estiril-lactona isolada de várias espécies de plantas, principalmente do gênero Goniothalamus, que possui importantes propriedades biológicas, tais como atividade antitumoral. Neste trabalho, seis novos análogos 1,2,3-triazólicos de goniotalamina foram sintetizados a partir do álcool propargílico (61) (5 ou 8 etapas em 6% a 8% de rendimento global) ou do 2-penten-4-in-1-ol (62) (5 ou 8 etapas em 3% a 19% de rendimento global) e testados frente a nove linhagens tumorais, sendo que 87-89 e 111 tiveram toxicidade comparáveis à da goniotalamina (1) na maioria das linhagens. O resultado mostrou que o anel 1,2,3-triazólico mimetizou o grupo estirênico do produto natural 1 e que o substituinte no anel aromático não influenciou na atividade citotóxica. Os derivados sem grupo benzila ligado ao anel triazólico mostraram toxicidade inferior a da goniotalamina (1). Também foi sintetizado um composto híbrido da goniotalamina e do 2,1,3-benzotiadiazol (GTN-BTD 54) a partir do 7-bromo-2,1,3-2,1,3-benzotiadiazol-4- 7-bromo-2,1,3-benzotiadiazol-4-carboxaldeído (112), em 7 etapas com 11% de rendimento global, o qual apresentou propriedades fluorescentes. O híbrido fluorescente 55, que apresenta um espaçador alquila-1,2,3-triazólico, foi sintetizado em 8 etapas a partir do 4-hidroxibenzaldeído (117), em 1% de rendimento global. Os ensaios de citotoxicidade de GTN-BTD 54 e GTN-espaçador-BTD 55 e seus intermediários foram realizados frente a duas linhagens tumorais. As análises realizadas com esses compostos mostraram a importância da presença da diidropiranona para a atividade citotóxica e que o anel 2,1,3-benzotiadiazol e o espaçador de três carbonos reduzem essa atividade. No entanto, o híbrido GTN-BTD 54, o qual não possui o espaçador, apresentou toxicidade similar a da goniotalamina (1). A análise por microscopia confocal em cinco linhagens tumorais mostrou que o híbrido GTN-BTD 54 foi capaz de transpor a membrana celular e localizou-se no citoplasma, preferencialmente nas mitocôndrias.

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ABSTRACT

Goniothalamin (1) is a styryl-lactone isolated from several species of plants, mostly of the genus Goniothalamus, which displays important biological properties such as antitumoral activity. In this work, six new goniothalamin 1,2,3-triazole analogues were synthesised from propargylic alcohol (61) (5-8 steps, 6%-8% overall yield) or from 2-penten-4-yn-1-ol (62) (5-8 steps, 3%-19% overall yield). All compounds were tested against nine tumor cell lines and 87-89 and 111 displayed toxicity comparable to goniothalamin (1) in most of the cell lines. These results revealed that 1,2,3-triazole ring mimics the styryl group of the natural product 1, and the substituents in the aromatic ring had no influence in the citotoxicity. The derivatives without the benzyl group bond to the triazole moiety were less citotoxic than goniothalamin (1). Additionally, a hybrid compound of goniothalamin and 2,1,3-benzothiadiazole (GTN-BTD 54) was synthesised from 7-bromo-2,1,3-benzothiadiazol-4-carboxaldehyde (112), in 7 steps and 11% overall yield, which displayed fluorescent properties. The hybrid fluorescent derivative 55 displaying an alkyl-1,2,3-triazole linker was synthesised in 8 steps from 4-hydroxybenzaldehyde (117; 1% overall yield). Cytotoxicity assays of GTN-BTD 54 and GTN-linker-BTD 55 and their intermediates were performed in two cancer cell lines. The analyses performed with those compounds showed the importance of the dihydropyranone moiety for the cytotoxic activity, and that the 2,1,benzothiadiazole ring and the 3-carbon linker decrease this activity. However, GTN-BTD 54 hybrid without the linker displayed similar toxicity as goniothalamin (1). Assays by confocal microscopy using five tumor cell lines showed that GTN-BTD 54 was capable of transposing the cell membranes and to localize in the cytoplasm, preferentially in mitochondria.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Resumo das reações utilizadas na síntese da goniotalamina (1). --- 28 Figura 2: Cascata simplificada de apoptose celular. --- 31 Figura 3: Fatores estruturais para a atividade antitumoral da goniotalamina (1). ---- 35 Figura 4: Estruturas de ressonância do 1,2,3-triazol. --- 43 Figura 5: a) Estrutura 2D da amida 31; b) Estrutura 2D do 1,2,3-triazol 32; c)

Estrutura 3D da amida 31; d) Estrutura 3D do 1,2,3-triazol 32; e), f) Potenciais eletrônicos moleculares; g) Sobreposição. --- 44 Figura 6: Reação “Click” bioortogonal. --- 47 Figura 7: Arquitetura do análogo BTD 47. --- 50 Figura 8: Atribuições para hidrogênio, para carbono e para nitrogênio do

composto 64 segundo análise de espectros 1D e 2D de RMN (600 MHz, 400 MHz, 150 MHz, 100 MHz, 40 MHz, acetona-d6) --- 59 Figura 9: Perfil fluorescente de células de HCT-116 tratada com 10 μM de

GTN-espaçador-BTD 55 e MitoTracker Red®. A imagem A mostra a localização das mitocôndrias pelo MitoTracker Red®. A imagem B mostra a localização de 55. A imagem C mostra aspectos morfológicos em microscopia de contraste. A imagem D é a sobreposição das imagens A/B --- 99 Figura 10: Perfil fluorescente de células de Caco-2 tratada com 10 μM de

GTN-BTD 54 visualizado nos canais azul, verde e vermelho. Imagens A, B, C e D mostram células vivas, e as imagens E, F, G e H mostram células aderidas. As imagens D e H mostram aspectos morfológicos em microscopia de contraste. --- 100 Figura 11: Perfil fluorescente de células de MDA-MB-231 tratada com 10 μM de

GTN-BTD 54 visualizado nos canais azul, verde e vermelho. Imagens A, B, C e D mostram células vivas, e as imagens E, F, G e H mostram células aderidas. As imagens D e H mostram aspectos morfológicos em microscopia de contraste. --- 101 Figura 12: Perfil fluorescente de células de A549 tratada com 10 μM do híbrido

GTN-BTD 54 visualizado nos canais azul, verde e vermelho. Imagens A, B, C e D mostram células vivas, e as imagens E, F, G e H mostram células

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aderidas. As imagens D e H mostram aspectos morfológicos em microscopia de contraste. --- 102 Figura 13: Perfil fluorescente de células de MCF-7 tratada com 10 μM de

GTN-BTD 54 visualizado nos canais azul, verde e vermelho. Imagens A, B, C e D mostram células vivas, e as imagens E, F, G e H mostram células aderidas. As imagens D e H mostram aspectos morfológicos em microscopia de contraste. --- 103 Figura 14: Perfil fluorescente de células de RAW264.7 tratada com 10 μM de

GTN-BTD 54 visualizado nos canais azul, verde e vermelho. Imagens A, B, C e D mostram células vivas, e as imagens E, F, G e H mostram células aderidas. As imagens D e H mostram aspectos morfológicos em microscopia de contraste. --- 104 Figura 15: Perfil fluorescente de células MDA-MB-231 incubadas com

GTN-BTD (54) mais MitoTracker Red®. A imagem A (canal verde) é sobre a distribuição de 54. A imagem B (canal vermelho) é sobre a distribuição do MitoTracker Red®. A imagem C é a sobreposição de A e B, e os pontos amarelos indicam a mesma localização para 54 e MitoTracker Red®. A imagem D mostra aspectos morfológicos em microscopia de contraste. --- 106 Figura 16: Perfil fluorescente de GTN-BTD (54) e Rodamina 1,2,3 (Imagens A e

B) em células de MDA-MD-231. As imagens C e D mostram aspectos morfológicos em microscopia de contraste. --- 107 Figura 17: Ensaio de Deslocamento Fluorescente entre goniotalamina (1) e

MitoTracker Red® em células MDA-MB-231. A imagem A é a visualização das células tratadas com 1, o qual adicionou-se MitoTracker Red®. A imagem B é a visualização das células tratadas com MitoTracker Red®, o qual adicionou-se 1. As imagens C e D mostram aspectos morfológicos em microscopia de contraste. A imagem E é a análise quantitativa da intensidade de fluorescência. --- 108 Figura 18: Placa de 96 compartimentos utilizada nos testes de atividade

antiproliferativa in vitro, mostrando a disposição das concentrações utilizadas, do controle do meio de cultura (aplica-se somente meio de cultura), do branco das amostras (aplica-se somente amostra diluída) e das células (aplicam-se somente células). --- 178

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Figura 19: Espectro de UV-Vis (A), Espectro de Fluorescência (B) e Deslocamento de Stokes (cm-1) (C) para os solventes testados (soluções de 10 mM em todas as análises). Híbrido GTN-BTD 54 (D) sob irradiação de luv branca (esquerda) e luz UV (direita, comprimento de onda = 365 nm) em acetonitrila (80 mM). --- 194 Figura 20: Imagem do ensaio de deslocamento de fluorescência. (A)

Intensidade da emissão de fluorescência da amostra de controle incubada apenas com o híbrido GTN-BTD 54. (B) Intensidade da emissão de fluorescência da amostra pré-incubada com o híbrido GTN-BTD 54 a uma solução de 2,5 μM, seguida por incubação com goniotalamina (1) a uma solução de 10 μM. (C) e (D) mostram aspectos morfológicos em microscopia de contraste. --- 199 Figura 21: Imagem do ensaio de deslocamento de fluorescência. (A)

Intensidade da emissão de fluorescência da amostra de controle incubada apenas com o híbrido GTN-BTD 54. (B) Intensidade da emissão de fluorescência da amostra pré-incubada com o híbrido GTN-BTD 54 a uma solução de 10 μM, seguida por incubação com goniotalamina (1) a uma solução de 10 μM. (C) e (D) mostram aspectos morfológicos em microscopia de contraste. --- 202

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Reações “Click” sobre o álcool propargílico (61) --- 58 Tabela 2: Valores de TGI (µM) para a substância padrão (doxorrubicina), a

goniotalamina (1) e os análogos sintetizados. --- 76 Tabela 3: Otimização da reação “Click” para a obtenção do 1,2,3-triazol 58. --- 91 Tabela 4: Valores de GI50, dados em μM, para os compostos 1, 54-59 (média ±

desvio padrão da média ≥ 3 experimentos; n=4 por experimento). --- 95 Tabela 5: Linhagens celulares tumorais e normal (HaCat) utilizadas nos

ensaios de atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação --- 177 Tabela 6: Médias do número de colônias formadas para cada agente teste. --- 193 Tabela 7: Dados de emissão de fluorescência e UV-Vis em diferentes solventes

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Ar Aromático

asc. de sódio Ascorbato de sódio

ATCC Coleção Americana de Tipos de Cultura (sigla inglesa)

Atmosf. Atmosfera

ATP Trifosfato de Adenosina

Bn Benzil BINOL 1,1'-binaftaleno-2,2'-diol BODIPY Borodipirrometeno BPR Regulador de Pressão BTD 2,1,3-Benzotiadiazol cat. Catalisador compart. Compartimento

COSY Espectroscopia de Correlação

d Dupleto

DCM Diclorometano

dd Dupleto de dupleto

ddd Dupleto de dupleto de dupleto

dens. Densidade

DHP 3,4-Diidro-2H-pirano

DI Densidade de inoculação

DIBAL-H Hidreto de diisobutilalumínio

DIPA Diisopropilamina DIPEA Diisopropiletilamina DMAP Dimetilaminopiridina DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DOXO Doxorrubicina dq Dupleto de quarteto dt Dupleto de tripleto

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EMAR Espectrometria de Massas de Alta Resolução

ESI+ Ionização por Eletrospray

FADD Proteína de domínio de morte associada a Fas

g Grama

GI50 Inibição do crescimento de 50% da população total

GTN Goniotalamina

HMBC Correlação Heteronuclear de Quantum-Múltiplo

HMDS Bis(trimetilsilil)amina

HOMO Orbital molecular ocupado de maior energia

HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

HSQC Correlação Heteronuclear de Quantum Único

Hz Hertz

IC50 Concentração inibitória máxima de 50% da população

ICT Transferência intramolecular de carga

IU Unidade Internacional

J Constante de acoplamento

KHMDS Bis(trimetilsilil)amida de potássio

L Litro

lit. Literatura

LUMO Orbital molecular não ocupado de menor energia

m Multipleto

m Metro

m/z Razão massa-carga

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

NAD Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina

NCI Instituto Nacional do Câncer

ρ Coeficiente de correlação

p.f. Ponto de fusão

PARP Poli (ADP-ribose) polimerase

PeT Transferência intramolecular fotoinduzida de elétrons

ppm Parte por milhão

PTSA Ácido p-toluenossulfônico

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qd Quarteto de dupleto

quin Quinteto

rend. Rendimento

ROS Espécies reativas de oxigênio

RPMI Instituto Memorial Parque Roswell

s Simpleto

s.l. Sinal largo

SFB Soro fetal bovino

SRB Sulforrodamina B

t Tripleto

t.a. Temperatura ambiente

TBAF Fluoreto de tetrabutilâmonio

TBS Terc-butildimetilsilila

TBSCl Cloreto de terc-butildimetilsilila

td Tripleto de dupleto

TGI Inibição Total do Crescimento

THF Tetraidrofurano

TIPS Triisopropilsilano

TIPSOTf Trifluorometanosulfonato de triisoproprila

TMS Trimetilsilila

UV Ultravioleta

UV-Vis Ultravioleta-Visível

v Volume

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LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1: Síntese para determinação estrutural da goniotalamina (1). --- 27

Esquema 2: Síntese da (R)-goniotalamina [(R)-1] em três etapas. --- 29

Esquema 3: Reação de 5,6-diidropiran-2-onas com etanotiol. --- 35

Esquema 4: Sínteses de 1,2,3-triazóis. --- 39

Esquema 5: Mecanismo geral da cicloadição de azidas e alcinos catalisada por cobre (I) deduzido de cálculos teóricos e análise calorimétrica. --- 41

Esquema 6: Mecanismo da cicloadição de azidas e alcinos catalisada por cobre(I) deduzido do isolamento de intermediários de reação. --- 42

Esquema 7: Ativação da emissão de fluorescência de um derivado de BODIPY. --- 48

Esquema 8: Materiais de partida para obtenção do análogo triazólico 60. --- 57

Esquema 9: Reação “Click” com NaN3 sobre o álcool propargílico (61). --- 58

Esquema 10: Preparação do composto 63 com desproteção do grupo benzila. --- 60

Esquema 11: Preparação do composto 63 com desproteção de pivalato de metila.--- 60

Esquema 12: Estudo para a síntese do análogo 1H-1,2,3-triazólico 60 com grupo protetor. --- 61

Esquema 13: Síntese do anel de diidropiranona ligado a grupo alcino-TMS. --- 63

Esquema 14: Mecanismo geral simplificado da reação de metátese de olefinas com catalisador de Grubbs. --- 64

Esquema 15: Síntese de análogos truncados 1,2,3-triazólicos de goniotalamina com alcino protegido por TIPS. --- 67

Esquema 16: Síntese de análogos truncados 1,2,3-triazólicos de goniotalamina com etapa “Click” inicial. --- 69

Esquema 17: Rota sintética empregando o grupamento alcino de 62 desprotegido. --- 71

Esquema 18: Rota sintética empregando o grupamento alcino de 62 protegido com TMS. --- 72

Esquema 19: Síntese do análogo 1,2,3-triazólico da goniotalamina 111. --- 74

Esquema 20: Síntese do híbrido GTN-BTD 54. --- 79

Esquema 21: Preparação da 4-hidroxigoniotalamina 124. --- 83

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Esquema 23: Proposta de mecanismo da substituição nucleofílica de 124--- 85

Esquema 24: Reação de alquilação da 3-hidroxigoniotalamina (129). --- 86

Esquema 25: Estudos para a preparação de análogo de goniotalamina 135. --- 87

Esquema 26: Estudos para a síntese do derivado BTD 139. --- 88

Esquema 27: Investigação da reação “Click” utilizando iodeto de cobre. --- 89

Esquema 28: Reação geral de formação de 5-iodo-1,2,3-triazóis. --- 90

Esquema 29: Síntese do análogo fluorescente de goniotalamina 55. --- 92

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LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Ensaio clonogênico realizado em linhagens de HCT 116 (média ±

desvio padrão, n=2). --- 97

Gráfico 2: Análise quantitativa da emissão de fluorescência do ensaio de deslocamento entre goniotalamina (1) e híbrido GTN-BTD 54 em células de MDA-MB-231. --- 109

Gráfico 3: Curva de concentração-resposta da doxorrubicina. --- 180

Gráfico 4: Curva de concentração-resposta da goniotalamina (1). --- 180

Gráfico 5: Curva de concentração-resposta do composto 87. --- 181

Gráfico 11: Curva de concentração-densidade óptica da goniotalamina (1) para HCT-116. --- 186

Gráfico 12: Curva de concentração-densidade óptica da goniotalamina (1) para MCF-7. --- 186

Gráfico 13: Curva de concentração-densidade óptica de 54 para HCT-116. --- 187

Gráfico 14: Curva de concentração-densidade óptica de 54 para MCF-7. --- 187

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO --- 26

1.1 O isolamento e a caracterização estrutural da goniotalamina --- 27

1.2 As sínteses da goniotalamina --- 28

1.3 Estudos do mecanismo de ação da goniotalamina como agente antitumoral - 30 1.4 Ensaios biológicos in vivo com goniotalamina --- 34

1.5 O grupo farmacofórico da goniotalamina --- 35

1.6 Avaliação citotóxica de análogos de goniotalamina --- 37

1.7 Reação “Click” --- 38

1.8 Mecanismo da reação “Click” catalisada por cobre (I) --- 40

1.9 Atributos do anel 1,2,3-triazolólico em Química Medicinal --- 43

1.10 Reação “Click” em ensaios biológicos --- 45

1.11 Reação “Click” para a marcação biomolecular --- 47

1.12 Benzotiadiazol como sonda fluorescente --- 49

2. OBJETIVOS --- 52

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO --- 56

3.1 Síntese e avaliação biológica de análogos triazólicos da goniotalamina --- 57

3.1.1 Estudo da síntese de análogos 1H-1,2,3-triazólicos da goniotalamina ---- 57

3.1.2 Síntese de análogos truncados 1,2,3-triazólicos da goniotalamina --- 63

3.1.2.1 Estudo da síntese de lactona com alcino protegido por TMS --- 63

3.1.2.2 Síntese de 1,2,3-triazóis com alcino protegido por TIPS --- 66

3.1.2.3 Síntese de 1,2,3-triazóis com etapa “Click” inicial --- 69

3.1.3 Síntese de análogos 1,2,3-triazólicos da goniotalamina --- 70

3.1.3.1 Estudo da síntese de 1,2,3-triazóis com etapa “Click” em estágio avançado --- 70

3.1.3.2 Estudo da síntese de 1,2,3-triazóis com etapa “Click” em estágio avançado sobre alcino protegido --- 71

3.1.3.3 Síntese de 1,2,3-triazol com etapa “Click” inicial --- 73

3.1.4 Avaliação citotóxica de análogos 1,2,3-triazólicos de goniotalamina --- 75

3.2 Síntese e avaliação citotóxica de híbridos fluorescentes de goniotalamina ---- 78

3.2.1 Síntese do híbrido GTN-BTD 54 --- 78

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3.2.3 Síntese do híbrido GTN-espaçador-BTD 55 --- 81

3.2.3.1 Planejamento da estrutura do GTN-espaçador-BTD (55) --- 81

3.2.3.2 Estudos envolvendo a 4-hidroxigoniotalamina (124)--- 81

3.2.3.3 Estudos envolvendo a 3-hidroxigoniotalamina (129)--- 86

3.2.3.4 Mais estudos para a síntese do análogo azidopropila-goniotalamina - 87 3.2.3.5 Estudos para a cicloadição 1,3-dipolar da sonda fluorescente --- 88

3.2.3.6 Síntese do híbrido 55 com acoplamento inicial da sonda fluorescente --- 91

3.2.4 Avaliação citotóxica dos híbridos fluorescentes de goniotalamina --- 93

3.2.4.1 Ensaios de viabilidade celular de MTT --- 93

3.2.4.2 Ensaio de sobrevivência celular clonogênica --- 96

3.3 Bioimagem do GTN-BTD (54) e do GTN-espaçador-BTD (55) --- 98

3.3.1 Avaliação da bioimagem do híbrido GTN-espaçador-BTD 55 --- 98

3.3.2 Localização celular do híbrido GTN-BTD 54 --- 99

4. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS--- 111

5. PARTE EXPERIMENTAL --- 114

5.1 Procedimentos da síntese química --- 115

5.1.1 Reagentes, solventes, instrumentação --- 115

5.1.2 Síntese do 2-(4-(hidroximetil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)prop-2-en-1-ol (64) --- 116

5.1.3 Preparação da benzilazida (65) --- 117

5.1.4 Preparação do (1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol (66) --- 117

5.1.5 Preparação do (1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol (63) via reação de desproteção de benzila --- 118

5.1.6 Preparação do pivalato de azidometila (67) --- 119

5.1.7 Síntese do pivalato de (4-(hidroximetil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metila (68) - 119 5.1.8 Preparação do (1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol (63) via reação de desproteção de pivalato de metila --- 120

5.1.9 Síntese do pivalato de (E)-(4-(3-hidroxiprop-1-en-1-il)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metila (69) --- 120

5.1.10 Síntese do pivalato de (E)-(4-(3-oxoprop-1-en-1-il)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metila (70) --- 121

5.1.11 Síntese do pivalato de (E)-(4-(3-hidroxihexa-1,5-dien-1-il)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metila (71) e do (E)-1-(1H-1,2,3-triazol-4-il)hexa-1,5-dien-3-ol (72) 122 5.1.12 Preparação do 1-(trimetilsilil)hex-5-en-1-in-3-ol (75) --- 123

(22)

5.1.14 Síntese do diacrilato de (E/Z) 1,10-bis(trimetilsilil)deca-5-en-1,9-diino-3,8-diila (77) --- 125 5.1.15 Preparação do 2-(prop-2-in-1-iloxi)tetraidro-2H-pirano --- 125 5.1.16 Preparação do triisopropil(3-((tetraidro-2H-piran-2-il)oxi)prop-1-in-1-il)silano --- 126 5.1.17 Preparação do 3-(triisopropilsilil)prop-2-in-1-ol (79) --- 127 5.1.18 Preparação do 3-(triisopropilsilil)propinaldeído (80) --- 127 5.1.19 Preparação do 1-(triisopropilsilil)hex-5-en-1-in-3-ol (81) --- 128 5.1.20 Preparação do acrilato de 1-(triisopropilsilil)hex-5-en-1-in-3-il (82) --- 128 5.1.21 Preparação da 4-metoxibenzilazida (84) --- 129 5.1.22 Preparação da 4-nitrobenzilazida (85) --- 130 5.1.23 Síntese de análogos truncados 1,2,3-triazólicos da goniotalamina --- 130

5.1.23.1 Preparação da 6-((triisopropilsilil)etinil)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (83) --- 130 5.1.23.2 Sínteses do 6-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (87), do 6-(1-(4-metoxibenzil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (88), do 6-(1-(4-nitrobenzil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (89), do pivalato de (4-(6-oxo-3,6-diidro-2H-piran-2-il)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metila (90) e do triacetato de (2R,3R,4S,5R,6R)-2-(acetoximetil)- 6-(4-(6-oxo-3,6-diidro-2H-piran-2-il)-1H-1,2,3-triazol-1-il)tetraidro-2H-piran-3,4,5-triila (91) --- 131 5.1.24 Preparação do (1-(4-metoxibenzil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metanol (92) -- 134 5.1.25 Preparação do 1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-carbaldeído (93) --- 135 5.1.26 Síntese do 1-(4-metoxibenzil)-1H-1,2,3-triazol-4-carbaldeído (94) --- 135 5.1.27 Síntese do 1-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)but-3-en-1-ol (95) --- 136 5.1.28 Síntese do 1-(1-(4-metoxibenzil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)but-3-en-1-ol (96)137 5.1.29 Síntese do acrilato de 1-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)but-3-en-1-ila (97) --- 137 5.1.30 Síntese do acrilato de 1-(1-(4-metoxibenzil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)but-3-en-1-ila (98) --- 138 5.1.31 Síntese da 6-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (87) e da 6-(1-(4-metoxibenzil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (88) --- 139 5.1.32 Síntese do (E)-octa-1,5-dien-7-in-4-ol (99) --- 140 5.1.33 Preparação do (E)-terc-butildimetil(pent-2-en-4-in-1-iloxi)silano --- 141 5.1.34 Preparação do (E)-terc-butildimetil((5-(trimetilsilil)pent-2-en-4-in-1-il)oxi)silano --- 141

(23)

5.1.35 Preparação do (E)-5-(trimetilsilil)pent-2-en-4-in-1-ol (101) --- 142 5.1.36 Preparação do (E)-5-(trimetilsilil)pent-2-en-4-inal (102) --- 143 5.1.37 Síntese do (E)-8-(trimetilsilil)octa-1,5-dien-7-in-4-ol (103) --- 143 5.1.38 Síntese do acrilato de (E)-8-(trimetilsilil)octa-1,5-dien-7-in-4-ila (104) -- 144 5.1.39 Síntese da (E)-6-(4-(trimetilsilil)but-1-en-3-inil)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (105) --- 145 5.1.40 Síntese do (E)-3-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)acrilato de etila (106) -- 145 5.1.41 Síntese do (E)-3-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)prop-2-en-1-ol (107) via reação de redução --- 146 5.1.42 Síntese do (E)-3-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)prop-2-en-1-ol (107) via reação “Click” --- 147 5.1.43 Preparação do (E)-3-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)acrilaldeído (108) -- 147 5.1.44 Síntese do (E)-1-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)hexa-1,5-dien-3-ol(109) 148 5.1.45 Síntese do acrilato de (E)-1-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)hexa-1,5-dien-3-ila (110) --- 149 5.1.46 Síntese da (E)-6-(2-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)etenil)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (111) --- 150 5.1.47 Síntese do (E)-3-(7-bromobenzo[c][1,2,5]tiadiazol-4-il)acrilato de etila (113) --- 150 5.1.48 Síntese do (E)-3-(7-(4-metoxifenil)benzo[c][1,2,5]tiadiazol-4-il)acrilato de etila (57) --- 151 5.1.49 Síntese do (E)-3-(7-(4-metoxifenil)benzo[c][1,2,5]tiadiazol-4-il)prop-2-en-1-ol --- 152 5.1.50 Síntese do (E)-3-(7-(4-metoxifenil)benzo[c][1,2,5]tiadiazol-4-il)acrilal-deído (114) --- 153 5.1.51 Síntese do (E)-1-(7-(4-metoxifenil)benzo[c][1,2,5]tiadiazol-4-il)hexa-1,5-dien-3-ol (115)--- 153 5.1.52 Síntese do acrilato de (E)-1-(7-(4-metoxifenil)benzo[c][1,2,5]tiadiazol-4-il)hexa-1,5-dien-3-ila (116) --- 154 5.1.53 Síntese da (E)-6-(2-(7-(4-metoxifenil)benzo[c][1,2,5]tiadiazol-4-il)etenil)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (54) --- 155 5.1.54 Preparação do (E)-3-(4-hidroxifenil)acrilato de etila (118) --- 156 5.1.55 Preparação do (E)-3-(4-((terc-butildimetilsilil)oxi)fenil)acrilato de etila (119) --- 157 5.1.56 Preparação do (E)-3-(4-((terc-butildimetilsilil)oxi)fenil)prop-2-en-1-ol (120) --- 158 5.1.57 Preparação do (E)-3-(4-((terc-butildimetilsilil)oxi)fenil)acrilaldeído (121)158

(24)

5.1.58 Preparação do (E)-but-2-enoato de (E)-1-(4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-fenil)hexa-1,5-dien-3-ila (122) --- 159 5.1.59 Preparação da (E)-6-(4-((terc-butildimetilsilil)oxi)estiril)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (123) --- 160 5.1.60 Preparação da (E)-6-(4-hidroxiestiril)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (124) - 161 5.1.61 Preparação da 1-azido-3-bromopropano (125) --- 161 5.1.62 Síntese do 7-(4-hidroxifenil)hepta-2,4,6-trienoato de 3-azidopropila (E/Z-127) e do 7-(4-(azidopropoxi)fenil)hepta-2,4,6-trienoate de 3-azidopropila (128) --- 162 5.1.63 Síntese da (E)-6-(3-(3-azidopropoxi)estiril)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (130) --- 163 5.1.64 Síntese do (E)-3-(4-(3-azidopropoxi)fenil)acrilato de etila (131) --- 164 5.1.65 Síntese do (E)-3-(4-(3-azidopropoxi)fenil)prop-2-en-1-ol (132) --- 165 5.1.66 Síntese do (E)-3-(4-(3-azidopropoxi)fenil)acrilaldeído (133) --- 165 5.1.67 Síntese do (E)-3-(4-(3-azidopropoxi)fenil)hexa-1,5-dien-3-ol (134) --- 166 5.1.68 Preparação do 4-(4-metoxifenil)-7-((trimetilsilil)etinil)benzo[c][1,2,5]-tiadiazol (138) --- 167 5.1.69 Síntese do 4-(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)-7-(4-metoxifenil)benzo[c]-[1,2,5]tiadiazol (140) --- 168 5.1.70 Síntese do (E)-1-(4-(3-(4-fenil-1H-1,2,3-triazol-1-il)propoxi)fenil)hexa-1,5-dien-3-ol (141) e do (E)-1-(4-(3-(5-iodo-4-fenil-1H-1,2,3-triazol-1-il)propoxi)fenil)hexa-1,5-dien-3-ol (142) --- 168 5.1.71 Síntese do (E)-3-(4-(3-(4-fenil-1H-1,2,3-triazol-1-il)propoxi)fenil)-acrilato de etila (58) e (E)-3-(4-(3-(5-iodo-4-fenil-1H-1,2,3-triazol-1-il)propoxi)-fenil)acrilato de etila (143) via reação “Click” com iodeto de cobre (I) --- 170 5.1.72 Síntese do (E)-3-(4-(3-(4-fenil-1H-1,2,3-triazol-1-il)propoxi)fenil)-acrilato de etila (58) via reação “Click” com sulfato de cobre(II) --- 171 5.1.73 Síntese do (E)-3-(4-(3-(4-(7-(4-metoxifenil)benzo[c][1,2,5]tiadiazol-4-il)-1H-1,2,3-triazol-1-il)propoxi)fenil)acrilato de etila (56) --- 172 5.1.74 Síntese do (E)-3-(4-(3-(4-(7-(4-metoxifenil)benzo[c][1,2,5]tiadiazol-4-il)-1H-1,2,3-triazol-1-il)propoxi)fenil)prop-2-en-1-ol (144) --- 173 5.1.75 Síntese do (E)-3-(4-(3-(4-(7-(4-metoxifenil)benzo[c][1,2,5]tiadiazol-4-il)-1H-1,2,3-triazol-1-il)propoxi)fenil)acrilaldeído (145) --- 174 5.1.76 Síntese do (E)-6-(4-(3-(4-(7-(4-metoxifenil)benzo[c][1,2,5]tiadiazol-4-il)-1H-1,2,3-triazol-1-il)propoxi)estiril)-5,6-diidro-2H-piran-2-ona (55) --- 175 5.2 Procedimentos dos ensaios biológicos --- 176

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5.2.1 Ensaios de atividade antiproliferativa in vitro dos análogos truncados de goniotalamina --- 176

5.2.1.1 Colaborações --- 176 5.2.1.2 Preparo das suspensões celulares --- 177 5.2.1.3 Preparo e aplicação das frações --- 178 5.2.1.4 Análise dos dados --- 179 5.2.1.5 Curvas de concentração-resposta: atividade antiproliferativa in vitro da goniotalamina (1) e análogos 1,2,3-triazólicos de goniotalamina frente a um painel de células tumorais --- 180 5.2.2 Ensaio de viabilidade celular de MTT --- 184 5.2.2.1 Conceito --- 184 5.2.2.2 Suspensões celulares --- 184 5.2.2.3 Tratamento das linhagens celulares e leitura espectrofotométrica--- 184 5.2.2.4 Análise dos dados espectrofotométricos --- 185 5.2.2.5 Curvas de concentração-densidade óptica para goniotalamina (1), análogos de goniotalamina e de BTD --- 186 5.2.3 Ensaio de sobrevivência celular clonogênica --- 193 5.2.4.Ensaios de microscopia confocal do híbrido GTN-espaçador-BTD 55 --- 194 5.2.5 Dados fotofísicos adicionais do GTN-BTD (54) --- 194 5.2.6 Ensaios de microscopia confocal e citometria de fluxo do GTN-BTD(54) 195 5.2.6.1 Cultura de Células --- 195 5.2.6.2 Ensaios de fluorescência do híbrido GTN-BTD 54 --- 195 5.2.6.3 Co-marcação com MitoTracker Red® --- 196 5.2.6.4 Ensaio de fluorescência com GTN-BTD (54) e Rodamina 1,2,3 --- 197 5.2.6.5 Ensaio de deslocamento de fluorescência de goniotalamina (1) e MitoTracker Red® --- 197 5.2.6.6 Ensaio de deslocamento de fluorescência de goniotalamina (1) e GTN-BTD (54) --- 198 5.2.6.7 Imagens do ensaio de deslocamento de fluorescência de goniotalamina (1) e GTN-BTD (54) --- 199 5.2.6.8 Experimento de citometria de fluxo para detecção de ROS --- 202 5.2.6.9 Análise Quantitativa --- 203 6. REFERÊNCIAS --- 216 7. ANEXOS --- 216 7.1 Espectros de RMN dos compostos sintetizados. --- 217

(26)

(27)

1.1 O isolamento e a caracterização estrutural da goniotalamina

A goniotalamina (1) é uma estiril-lactona que foi isolada de várias plantas, principalmente as do gênero Goniothalamus1 e que possui importantes atividades biológicas, tais como antimicrobiana,2 antifúngica,3 larvicida,4 inseticida,5 tripanocida6 e antitumoral.7

Embora as espécies de Goniothalamus sejam bastante difundidas na Ásia, a goniotalamina (1) também foi isolada no Brasil da planta Cryptocarya moschata.8 O primeiro isolamento desse composto data de 1967, a partir da Cryptocarya

caloneura e sua estrutura foi determinada por fragmentação, técnicas

espectroscópicas e pela síntese racêmica do produto natural (Esquema 1).9

Esquema 1: Síntese para determinação estrutural da goniotalamina (1).

O trans-cinamaldeído (2) foi submetido a uma reação de Barbier com brometo de propargila (3) e zinco metálico, obtendo-se o álcool secundário 4. Na presença de brometo de etilmagnésio, o alcino 4 converteu-se em um reagente de Grignard, o qual atacou o CO2(s) para produzir o ácido carboxílico 5. Após redução da tripla ligação de 5 para um Z-alceno com catalisador de Lindlar e hidrogênio molecular, o composto formado 6 reagiu com ácido p-toluenosulfônico catalítico numa reação de lactonização, produzindo a goniotalamina (1).

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Incialmente, a goniotalamina (1) foi determinada com configuração absoluta S no carbono 5 da diidropiranona comparando a rotação óptica de um dos produtos de sua ozonólise com o de uma substância conhecida.9 Contudo, anos mais tarde, a síntese de ambos os enantiômeros permitiu saber que o composto isolado foi a (R)-goniotalamina (R-1), corrigindo a literatura.10 De fato, até agora, a (S)-goniotalamina (S-1) foi isolada somente da planta Polyalthia parviflora.11

1.2 As sínteses da goniotalamina

A síntese da goniotalamina (1) foi realizada por muitas rotas sintéticas considerando a formação de quatro de suas ligações em específico, conforme resumido na Figura 1.

A olefina estirênica da goniotalamina (1) pode ser obtida por olefinação de Wittig12 ou de Julia,13 ou ainda pela metátese cruzada de olefinas com catalisador de Grubbs.14 A olefina interna foi construída por desidratação do carbinol na posição 4 da tetraidropiran-2-ona,10,12c,13c,15 ou também por hidrogenação de alcino usando catalisador de Lindlar,9,16 ou por reação de Horner-Wadsworth-Emmons modificada por Still.17 Alternativamente, usou-se a metátese de olefinas para fechamento de anel com catalisador de Grubbs.12d,13a,13b,18

(29)

A lactona pode ser conseguida pela reação de lactonização entre o álcool secundário e o ácido carboxílico — ou seu derivado — conjugado ou não a uma olefina de configuração Z,9,10,12c,13c,15c,16,17 ou até por selenolactonização com cloreto de fenilselenila.19

O centro estereogênico da goniotalamina (1) é o que possui mais opções para ser obtido haja vista os diversos protocolos de reações aldólicas15c,18d,20 e de alilação assimétricas12d,13a,18a-c existentes. As resoluções cinética21 e enzimática12c,14b,18e,19,22 também foram bastante utilizadas. Por fim, a construção do anel também foi realizada por uma elegante metodologia de hetero Diels-Alder que produz o enantiômero desejado.12b,23

De todas as rotas sintéticas realizadas para a obtenção da goniotalamina (1), a mais simples relatada até o momento tem apenas três etapas (Esquema 2).18a-b

Esquema 2: Síntese da (R)-goniotalamina [(R)-1] em três etapas.

O trans-cinamaldeído (2) reagiu com aliltributilestanana nas condições de alilação assimétrica de Maruoka produzindo o álcool homoalílico (R)-7. O álcool secundário (R)-7 foi submetido a uma reação de esterificação com cloreto de acriloíla obtendo-se o éster (R)-8. A terceira e última etapa foi a metátese de olefinas para fechamento de anel do éster (R)-8 com catalisador de Grubbs de primeira geração,24 produzindo a (R)-goniotalamina [(R)-1].

Essa simplicidade no processo sintético é desejável para que se possa produzir o produto natural 1 em grandes quantidades, bem como para promover a síntese de seus compostos análogos a fim de se realizar estudos de atividade biológica.

(30)

1.3 Estudos do mecanismo de ação da goniotalamina como agente antitumoral

As plantas do gênero Goniothalamus são usadas na medicina popular, o que instigou a pesquisa das propriedades terapêuticas de seus extratos e de seus constituintes isoladamente.1,25 Conforme dito anteriormente, a goniotalamina (1) é uma dessas substâncias e possui, entre outras, atividade antitumoral.7

Ambos os enantiômeros do produto natural 1 foram testados em oito linhagens de câncer diferentes com boas atividades frente a todas elas. Tanto (R)-1, quanto (S)-1 mostraram citotoxicidade maior que a substância controle (doxorrubicina) em células tumorais de ovário resistente a adriamicina (NCI-ADR/RES; (R)-1 foi 21 vezes mais potente, (S)-1 foi 10 vezes mais) e de rim (786-0; doxorrubicina IC50 >100 μM). O isômero (R)-1 foi duas vezes mais potente que (S)-1 nas linhagens de câncer de pulmão (NCI-H460), de adenocarcinoma colorretal (HT-29) e de melanoma (UACC-62), enquanto que o inverso foi observado na avaliação das células tumorais de ovário (OVCAR-03). Em linhagem de próstata (PCO.3), o composto (S)-1 (IC50 = 24,3 μM) foi mais potente que (R)-1 (IC50 >100 μM). O resultado foi similar para os dois enantiômeros em linhagem de adenocarcinoma de mama (MCF-7; (R)-1 IC50 = 10,5 μM; (S)-1 IC50 = 9,4 μM).26

Como consequência de análises como esta, a goniotalamina (1) tornou-se um potencial candidato a fármaco, o que resultou em ensaios biológicos para determinação do seu mecanismo de ação como composto antitumoral a fim de progredir no seu desenvolvimento terapêutico.7,27

Para um melhor entendimento disso, é necessário explicar que a morte celular é classificada em quatro tipos.28 Apoptose é um deles e seu processo ocorre por duas vias: a extrínseca e a intrínseca (Figura 2).29

Na via extrínseca, a interação receptor-ligante na membrana plasmática envia sinais de morte da superfície para o interior da célula, levando à ativação da caspase-8, uma protease que inicia a fase de execução da morte celular.29

(31)

Figura 2: Cascata simplificada de apoptose celular.29

Na via intrínseca, sinais intracelulares fazem com que a proteína p53 acione a família Bcl-2, que possui proteínas anti-apoptóticas — Bcl-2, por exemplo — e pró-apoptóticas — como a Bax. Esta família é responsável pela permeabilidade da membrana mitocondrial. Quando em processo de apoptose, as mitocôndrias têm perda de potencial da membrana interna, produzem proteínas pró-apoptóticas e têm o aumento de seus poros, permitindo a saída de proteínas que se direcionam ao

(32)

núcleo celular e causam a fragmentação do DNA e a condensação da cromatina, bem como a evasão de Smac/DIABLO (desativa inibidores de apoptose) e de citocromo-c (ativador da caspase-9) para o citoplasma.29

Então, a caspase-9 ativa a caspase-3, iniciando a fase de execução por esta via. Durante a execução de apoptose, as caspases iniciadoras — caspase-2, caspase-9, caspase-10, por exemplo — ativam as caspases executoras — tais como a caspase-3, a caspase-6 e a caspase-7 — que são responsáveis pela clivagem de proteínas de membrana, de núcleo, citoqueratinas, PARP, etc., para a formação de corpos apoptóticos para a etapa final, a fagocitose.29

Portanto, as células de câncer são aquelas que se dividem indeterminadamente por causa da expressão de proteínas que privam a morte celular ou a redução daquelas que permitem esta ação, ambos os fatores controlados pelo gene p53, que expressa a proteína p53 e é o principal supressor tumoral.29 Outro elemento a se considerar são as espécies reativas de oxigênio (ROS, sigla inglesa), que são produzidas nas mitocôndrias durante o processo de respiração celular.30 Em células tumorais, o nível das ROS é mais alto, o que ocasiona uma deficiência do gene p53, a proliferação celular, a metástase, a alteração na morfologia, entre outros. Entretanto, o estresse oxidativo pode causar a ativação de proteínas pró-apoptóticas ou danos ao DNA, levando à ativação do gene p53 em prol da morte celular.31

Nos estudos com goniotalamina (1), a apoptose foi observada em linhagens de HeLa (câncer cervical) sob efeito do produto natural 1, com a perda do potencial da membrana mitocondrial, a condensação do DNA e o estresse do retículo endoplasmático — o que causa o decréscimo de proteínas anti-apoptóticas.32

As linhagens de H400 (carcinoma de células escamosas bucal) tratadas com goniotalamina (1) sofreram apoptose associada à perda de potencial da membrana mitocondrial, à presença de citocromo-c no citosol e à regulação da família de proteínas Bcl-2, observando-se a inibição do fator (de transcrição) nuclear kappa B — que expressa genes anti-apoptóticos — mais a ativação da caspase-9 e, consequentemente, da caspase-3 e da caspase-7.33 Em células Ca9-22 (carcinoma de células escamosas gengival), o produto natural 1 induziu apoptose num processo em que se observou o aumento das ROS, danos aos DNA e alteração no potencial da membrana mitocondrial.34

(33)

A (R)-goniotalamina [(R)-1] em células H1299 (pulmão)35 e a (S)-goniotalamina [(S)-1] em linhagens de NCI-H460 (pulmão)36 foram citotóxicas devido à habilidade de ocasionar danos ao DNA que se encerraram em apoptose. O mesmo foi notado em células do tecido muscular liso de artérias.37 Nesse caso, ainda se observou estresse oxidativo e ativação da caspase-2 e da caspase-9, mas não da caspase-8. As mitocôndrias liberaram citocromo-c sem a perda de potencial de membrana.38

Nas linhagens de MCF-7 (adenocarcinoma de mama), o produto natural 1 levou a apoptose.39 Em células de MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama), a apoptose com estresse oxidativo devido ao tratamento com 1 também não dependeu da alteração do potencial de membrana mitocondrial.40 Já em outras células tumorais de mama, como a SK-BR-3, embora tenha se confirmado a fragmentação de DNA, disfunção mitocondrial, aumento da proteína Bax, ativação da caspase-9 e da caspase-7 com clivagem de PARP, a apoptose foi associada com autofagia, tipo de morte celular em que os corpos apoptóticos se degradam no próprio lisossomo.28,41 Algo similar foi observado em análise com células 786-0 (rim). No entanto, a morte celular com perda da função mitocondrial ocorreu primariamente por apoptose em painéis tratados com (R)-goniotalamina [(R)-1] e por autofagia naqueles submetidos à ação do enantiômero (S)-1.42

Em células LoVo e HT-29, ambos de adenocarcinoma colorretal, a goniotalamina (1) causou apoptose.43,44 Em HT-29, houve aumento de proteína Bax, geração das ROS, ativação da caspase-8, caspase-9 e caspase-3, mostrando que o processo apoptótico ocorreu por duas vias. Também foi observada a clivagem de PARP.44

O produto natural 1 levou células HepG2 (carcinoma hepatocelular) à morte celular por apoptose pela inibição e clivagem do DNA, também verificando-se a ativação da caspase-3.45

A leucemia e o linfoma são os tumores com mais informações sobre a ação da goniotalamina (1). O composto 1 foi citotóxico em células HL-60 com redução do potencial de membrana mitocondrial e expressão de Smac, caspase-8 e caspase-9, corroborando para duas vias apoptóticas de morte celular.46 Houve, ainda, a ativação de caspases executoras — caspase-3 e caspase-7 — associadas à destruição de PARP e fragmentação tardia do DNA, enquanto que os danos primários ao DNA talvez não estejam associados a estresse oxidativo.47 Em

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linhagens Jurkat T, o composto 1 provocou um decréscimo de glutationa (antioxidante) com consequente elevação das ROS, o que originou danos ao DNA.48 Um aumento na caspase-2 não foi crucial para a morte celular, bem como não houve mudança na expressão da proteína Bcl-2.48 A ativação de caspase-3 e de caspase-7 foi observada.49 Com isso, concluiu-se que a goniotalamina (1) causa apoptose em células Jurkat T por estresse oxidativo, porém sem se envolver diretamente na importante regulação da família de proteínas Bcl-2 e a caspase-2.48

1.4 Ensaios biológicos in vivo com goniotalamina

Diante de tantos dados a respeito da goniotalamina (1), testes biológicos in

vivo foram realizados. O produto natural 1 não causou efeitos tóxicos em ratos na

dose de 300 μg/dia por quatorze dias.50 Ambos os enantiômeros (R)-1 e (S)-1 e a forma racêmica de 1 reduziram o tumor sólido de Erlich em camundongos sem efeitos colaterais, sugerindo uma propriedade anti-inflamatória que favorece o efeito antiproliferativo.51 O perfil anti-inflamatório da goniotalamina (1) foi caracterizado por inibir as fases celular e vascular da inflamação.52 O racemato de 1 também foi antinociceptivo e evitou lesões gástricas em camundongos e ratos.52,53

Como a inflamação pode originar tumores, observou-se que ratos com colite tratados com 1 (30 mg/kg) por via oral durante três meses sem apresentar efeitos colaterais, não desenvolveram câncer colorretal.44,54 Em outro estudo, ratos senis com inflamação na próstata receberam doses de goniotalamina (1) ou Celecoxibe (medicamento anti-inflamatório comercial), sendo ambos eficientes para controlar o processo de inflamação, mas o produto natural 1 foi ativo por mais vias.55 Em camundongos com adenocarcinoma transgênico de próstata tratados com ambos os compostos, enquanto o Celecoxibe diminuiu a ação proliferativa, a goniotalamina (1) apresentou um espectro maior de ação, diminuindo a frequência da lesão prostática e atenuando o processo pró-inflamatório.56

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1.5 O grupo farmacofórico da goniotalamina

A estrutura química da goniotalamina (1) foi investigada para determinar quais fatores corroboram para sua atividade biológica, cujas conclusões estão resumidas na Figura 3.

Figura 3: Fatores estruturais para a atividade antitumoral da goniotalamina (1).

A lactona α,β-insaturada da goniotalamina (1) é o seu grupo farmacofórico, ou seja, a parte da molécula necessária para a interação supramolecular com um alvo biológico, causando uma resposta. Este anel é um aceptor de Michael, o qual pode reagir com biomoléculas nucleofílicas tais como a cisteína.57 Isso foi confirmado ao submeter as (R)-5,6-diidropiran-2-onas 9, que são análogas ao produto natural 1, a uma reação com etanotiol (Esquema 3).58

Esquema 3: Reação de 5,6-diidropiran-2-onas com etanotiol.

Os produtos de adição-1,4 10 foram testados contra linhagens tumorais de PC3 (próstata) e de MCF-7 (adenocarcinoma de mama) e nenhuma citotoxicidade foi observada até 50 μM, contrário aos compostos 9, com a insaturação endocíclica.

(36)

A perda da atividade de 10 pode ser justificada pela ausência do aceptor de Michael ou por efeitos estéreos.58 Todavia, a primeira hipótese foi validada ao verificar que análogos de 1 que simplesmente não possuem a olefina conjugada da lactona tiveram sua potência reduzida.26,59

A mudança do anel da lactona α,β-insaturada de 1 de seis para cinco membros com a presença de uma metila na posição 5 (composto 11) causou a diminuição da potência citotóxica de seis a trinta vezes dependendo da linhagem celular.60 A atividade antitumoral foi similar a 1 somente nos derivados fluorados 12 e 13.60 O análogo γ-lactônico 14 sem aceptor de Michael (IC50 = 66 μM) também foi testado em linhagens Jurkar-T (leucemia de células T) e a citotoxicidade não foi superior em relação a 1 (IC50 = 22 μM).12e

A configuração absoluta do único centro estereogênico de 1 não é mandatória para a atividade, conforme observado nos exemplos anteriores, embora um enantiômero responda melhor que o outro em cada linhagem tumoral.26,42 A mistura racêmica de 1 também foi citotóxica em algumas células de câncer testadas.51,53

A dupla ligação externa da goniotalamina (1) foi considerada importante para a atividade citotóxica ao se observar uma potência inferior em análogos saturados naquela posição.26,59 A avaliação citotóxica da (R)-goniotalamina [(R)-1] e da (R)-(Z)-goniotalamina [(R)-(Z)-1] frente a oito linhagens tumorais mostrou que o composto de configuração E foi até treze vezes mais potente em seis delas.13a Entretanto, o composto de configuração Z (IC50 = 12 μM) foi mais citotóxico que (R)-1 (IC50 = 87 μM) em células Jurkat T (leucemia de células T).12e

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1.6 Avaliação citotóxica de análogos de goniotalamina

Devido aos dados mencionados anteriormente, alguns estudos para aumentar a eficácia da goniotalamina (1) foram realizados ao se modificar a sua estrutura no resíduo estireno. O análogo 15 possui um epóxido na posição da porção vinílica e foi observada uma atividade citotóxica maior que o produto natural 1 em um painel de oito linhagens tumorais.61 Quando a dupla ligação externa foi substituída por um grupo ciclopropila (compostos 16-18), não houve perda de atividade em três tipos de células tumorais.59 Apesar da ausência da olefina externa, esses resultados mostraram que é necessária rigidez naquela posição.59

A semissíntese de uma pequena biblioteca de derivados de (R)-goniotalamina permitiu a avaliação citotóxica frente a quatro linhagens tumorais.62 Quatro compostos (19-22) foram ativos contra HL-60 (leucemia), sendo que 19 e 21 foram seletivos em células SGC-7901 (carcinoma gástrico).62

Quando todo o grupo estireno de (R)-1 foi substituído por um substituinte naftila ou quinolinila, cinco análogos (23-27) apresentaram uma potência similar ou

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superior em teste com linhagens tumorais de PC3 [próstata; (R)-1 IC50 = 4,0 μM] e MCF-7 [adenocarcinoma de mama; (R)-1 IC50 = 19,0 μM]).63

Em um estudo que envolveu a síntese de vinte e nove derivados de goniotalamina e sua avaliação citotóxica contra sete linhagens tumorais, observou-se o efeito favorável de substituintes metoxila no anel aromático de 1.64 O composto

28 mostrou-se de duas a quatro vezes mais potente considerando todo o painel de

células de câncer testadas, bem como os análogos 29 e 30, que também apresentaram citotoxidade superior em relação ao produto natural 1.64

Conforme foi possível observar, a lactona α,β-insaturada da goniotalamina (1) é o seu grupo farmacofórico e deve haver alguma estrutura rígida como substituinte na posição 6 do anel. Desse modo, o produto natural (1) pode sofrer modificações na porção aromática de modo a aumentar a potência da atividade antitumoral.

1.7 Reação “Click”

Em Química Medicinal, é preferível o uso de metodologias sintéticas simples que permitam a construção rápida de moléculas para a formação de uma biblioteca

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de compostos e, consequentemente, aumentar as chances de se encontrar um potencial fármaco ou melhorar a atividade biológica de um candidato pré-estabelecido.65 Assim, Sharpless e colaboradores agruparam alguns tipos de reações com estas características e publicaram um artigo de revisão lançando o conceito de Reação “Click”.66

Segundo os autores, para pertencer a este grupo, a reação química deve ser modular, de amplo escopo, resultar em altos rendimentos, ser esteroespecífica, gerar um produto de fácil isolamento e ter produtos laterais inofensivos, usar solventes benignos — idealmente água — e ser realizada em condições simples.66

Uma das reações que se enquadra no conceito de Reação “Click” é a cicloadição 1,3-dipolar entre azida e alcino, também conhecida como reação de Huisgen.66 Inicialmente, essa cicloadição [3+2] entre azida e alcino produzia 1,2,3-triazóis a altas temperaturas e sem seletividade.67 Mais tarde, um protocolo envolvendo um alcino, azida de lítio e cloreto de cobre (I) em temperatura branda formou um 1,2,3-triazol como produto lateral em baixo rendimento.68 Isto foi esquecido até o começo dos anos 2000, quando Meldal69 e Sharpless70 publicaram, independentemente, a cicloadição de azidas e alcinos terminais catalisada por cobre (Esquema 4).

Esquema 4: Sínteses de 1,2,3-triazóis.

Meldal e colaboradores realizaram esta reação com sal de cobre (I) catalítico e alcinos suportados em fase sólida, em solvente orgânico, sem aquecimento, mostrando que vários grupos protetores foram estáveis e que apenas o isômero 1,4 era produzido.69 Sharpless e colaboradores, por sua vez, apresentaram uma metodologia mais robusta, em que se utilizou uma mistura terc-butanol/água, sal de cobre (II) catalítico — mais barato que os sais de cobre (I) — e um agente redutor, à

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temperatura ambiente, produzindo apenas os regioisômeros 1,4-triazólicos, os quais foram facilmente isolados sem purificação cromatográfica.70 A velocidade da reação foi até dez milhões de vezes mais rápida que por via térmica, ou seja, o cobre aumentou a velocidade da reação e promoveu a sua regiosseletividade.71 Desde então, a utilização desse protocolo aumentou exponencialmente e os termos “cicloadição de azidas e alcinos catalisada por cobre” e “Reação Click” passaram a ser associados.72

Em geral, a reação 1,3-dipolar azida-alcino com cobre é dependente de um alcino terminal, uma azida orgânica e íon cobre (I). Sais de cobre (II) podem ser utilizados em conjunto com um agente redutor, o que evita a necessidade de atmosfera inerte no sistema.73 Porém, íons de cobre (II) podem reduzir em solventes como água ou álcool. Nesse caso, a redução do cobre ocorre ou pela oxidação do álcool, ou pela reação de homoacoplamento de alcinos.74 Aditivos como ligantes75 — para aumentar a reatividade do cobre — e bases76 — para a desprotonação do alcino — também podem ser adicionados ao sistema. Essa reação “Click” é tolerável a vários solventes, inclusive água, o qual é desejável em todas as áreas aplicadas da síntese.75

1.8 Mecanismo da reação “Click” catalisada por cobre (I)

O mecanismo da reação “Click” ainda é objeto de estudo. A proposta que envolve apenas um metal71 foi logo modificada após a análise de cálculos teóricos e de estudos calorimétricos.77 Foi observado que acetiletos de cobre não foram reativos a menos que um segundo íon de cobre fosse adicionado ao sistema.78 Portanto, o mecanismo proposto está relatado no Esquema 5.

O alcino terminal coordena-se ao primeiro íon de cobre (I) do ciclo (Esquema 5, etapa A), tornando-o mais acídico e permitindo que o segundo íon metálico forme o acetileto de cobre (etapa B). A seguir, ocorre a coordenação do grupo azida ao cobre que está π-coordenado ao alcino (etapa C). A regiosseletividade 1,4 é obtida porque este íon cobre coordena-se ao carbono α do acetileto de cobre e ao nitrogênio substituído da azida, ambos por terem densidade eletrônica maior (carga parcial negativa). Isto promove o acoplamento oxidativo e o ataque do carbono β do

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acetileto de cobre ao nitrogênio terminal da azida, formando um anel de seis membros com dois átomos de cobre (etapa D). Os estados de oxidação do cobre no intermediário dessa etapa não são conhecidos ainda. A contração do anel com saída de cobre (I) por eliminação redutiva gera o triazoleto de cobre (I) (etapa E), o qual sofre protonólise formando o respectivo 1,2,3-triazol e restaurando o íon de cobre (I) (etapa F).79

Esquema 5: Mecanismo geral da cicloadição de azidas e alcinos catalisada por

cobre (I) deduzido de cálculos teóricos e análise calorimétrica.

Recentemente, isolou-se e caracterizou-se um complexo hexaacetileto de octacobre (I), que pode ser o primeiro intermediário da reação.80 Em condições ácidas, este complexo produziu espécies de dicobre, as quais foram muito reativas para a formação de 1,2,3-triazóis.80 Além desse estudo, o isolamento e caracterização de quatro intermediários desta cicloadição 1,3-dipolar com cobre

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permitiu a atualização do mecanismo da reação (em condições estequiométricas), conforme visto no Esquema 6.81

A reação processa-se por duas vias, uma lenta e uma rápida, ambas iniciando com a formação do acetileto de cobre (isolado). A via lenta foi caracterizada pelo maior tempo para a formação do triazoleto de cobre (isolado) a partir do acetileto de cobre após adição da azida e também da produção do respectivo 1,2,3-triazol. A via rápida ocorreu com a formação em minutos de um complexo alcino-dicobre (isolado) a partir do acetileto de cobre, o qual gerou um triazoleto de cobre ligado ao segundo metal pelo nitrogênio-3 do anel (isolado). Este intermediário, com adição de um alcino terminal, produz o respectivo 1,2,3-triazol e restaura o complexo bimetálico.81 Este intermediário alcino-dicobre é constituído, provavelmente, por ambos os metais com estado de oxidação +1.82 O contra-íon do sal de cobre também influencia nessa cicloadição. Os ânions mais básicos favorecem a formação de acetileto de cobre e desfavorecem a etapa de coordenação do segundo cobre.83

Esquema 6: Mecanismo da cicloadição de azidas e alcinos catalisada por cobre (I)

deduzido do isolamento de intermediários de reação.

Contudo, os fatores estruturais das azidas e dos alcinos são ainda mais importantes para a velocidade dessa reação “Click”.84

Na maioria das situações, a etapa determinante da velocidade é a formação do acetileto de cobre. Mas, os alcinos muito ácidos são mais reativos e podem deslocar a etapa lenta para a de coordenação da azida ao complexo de dicobre.85 De outro modo, as azidas com

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substituintes quelantes são mais reativas porque estes facilitam a coordenação do nitrogênio ao cobre.86

Apesar de ser uma reação robusta em muitos casos, os estudos mecanísticos como estes favorecem a manipulação de substratos azida e alcino para a produção de 1,2,3-triazóis, que possuem propriedades importantes para o uso em Química Medicinal.87

1.9 Atributos do anel 1,2,3-triazolólico em Química Medicinal

O anel 1,2,3-triazólico é bastante polarizado devido às estruturas de ressonância e efeito indutivo (Figura 4).79

Figura 4: Estruturas de ressonância do 1,2,3-triazol.

Por isso, o 1,2,3-triazol possui tanto um sítio básico (no nitrogênio-3 ou no nitrogênio-2), quanto um sítio ácido (no carbono-5). No primeiro, ele pode ser um aceptor de ligação de hidrogênio, enquanto que no segundo, aquela posição pode ser um doador de ligação de hidrogênio, que são características importantes em interações biomoleculares.79,88

Devido à sua aromaticidade, foi possível observar interações π-π-stacking do 1,2,3-triazol com anéis aromáticos de aminoácidos, por exemplo. Essa propriedade também permite a sua intercalação com bases nitrogenadas de DNA.89

Os anéis 1,2,3-triazólicos 1,4-substituídos são bioisósteros não clássicos de amida de configuração Z, um importante grupo funcional no meio biológico. A comparação da amida 31 (Figura 5a) e do 1,2,3-triazol 32 (Figura 5b) permitiu observar a disposição espacial similar dos átomos de ambos (Figura 5c e 5d), o mesmo padrão de energia (Figura 5e e 5f), diferindo-se muito apenas na geometria dos substituintes (Figura 5g).89

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Figura 5: a) Estrutura 2D da amida 31; b) Estrutura 2D do 1,2,3-triazol 32; c)

Estrutura 3D da amida 31; d) Estrutura 3D do 1,2,3-triazol 32; e), f) Potenciais eletrônicos moleculares; g) Sobreposição.89

O anel 1,2,3-triazólico é estável em condições de hidrólise ácida e básica e em ambiente oxidativos e redutivos,65,87,90 bem como resistente à degradação metabólica, algo que não é observado em amidas.89 Quando 1,2,3-triazóis 1,4-dissubstituídos foram submetidos a microssomos de fígado de rato, alguns compostos foram inertes à degradação (32 e 33), enquanto outros sofreram baixa ou alta transformação oxidativa (34-37). Contudo, a instabilidade metabólica foi associada aos substituintes metila e metoxila das estruturas, que podem sofrer hidroxilação alifática e O-demetilação por enzimas, respectivamente.89

a) b)

c) d)

e) f)