A reação de esterificação com cloreto de acriloíla sobre o álcool homoalílico
109 produziu o acrilato 110 em rendimento de 59%. O composto 111 foi sintetizado
a partir do éster 110 com catalisador de Grubbs de segunda geração via reação de metátese de olefinas para fechamento de anel em 55% rendimento. O espectro de RMN de 1H (250 MHz, CDCl3) do composto 111 apresentou sinal dupleto em 6,1 ppm (J=9,7 Hz, 1 H) e um sinal em 6,9 ppm (ddd, J=9,7; 5,2; 3,2 Hz, 1 H) referentes à olefina da lactona α,β-insaturada de 111, similar ao atribuído ao mesmo anel dos análogos truncados de goniotalamina 87-91 (Esquema 15).
O rendimento da reação de metátese de olefinas para fechamento de anel no qual se obteve 111 foi similar aos dos análogos truncados 87 e 88 sintetizados pela mesma rota sintética (Esquema 16). Entretanto, no caso de 111, o procedimento foi realizado a uma temperatura menor e a reação completou-se em menos tempo. Avaliando a estrutura de 110, o anel triazólico está mais afastado das olefinas em relação ao seu análogo truncado 97 (Esquema 16) e, por isso, deve interagir menos com o catalisador de rutênio, aumentando sua reatividade e favorecendo a formação do produto 111.
Esta rota sintética via 62 teve cinco etapas e rendimento global de 19%, que é um rendimento maior em relação ao protocolo que utilizou o alcino 61, que foi realizado em oito etapas, em 3% de rendimento global.
3.1.4 Avaliação citotóxica de análogos 1,2,3-triazólicos de goniotalamina
Os análogos 1,2,3-triazólicos de goniotalamina 87-91 e 111 sintetizados foram, então, avaliados quanto à sua citotoxicidade frente a queratinócitos humanos (HaCat) e a mais nove linhagens tumorais diferentes — U251 (glioma), MCF-7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário resistente a adriamicina), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão), PC3 (próstata), OVCAR-3 (ovário), HT-29 (cólon), K-562 (leucemia) — pois o agente de teste pode gerar um perfil de resposta diferente para cada tipo de célula.
Esta avaliação foi realizada em colaboração com o prof. João Ernesto de Carvalho, do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas. Os ensaios foram executados pela Dra. Débora B. Vendramini-Costa e pela Ma. Thais Petrochelli Banzato.
Os agentes de teste foram incubados em placas com cultura de células tumorais por 48 horas. O crescimento celular — ou viabilidade celular — em cada concentração aplicada foi determinado a partir da leitura espectofotométrica das placas que continham uma solução das proteínas celulares coradas. O tratamento estatístico dos dados de absorbância relativos às concentrações forneceu os valores de TGI de cada agente de teste.
O valor de TGI (Inibição Total do Crescimento, sigla inglesa) refere-se à concentração necessária de uma substância para inibir totalmente (100%) o crescimento celular. Este parâmetro é utilizado para comparar a potência e seletividade dos agentes de teste.133
Os resultados de atividade antiproliferativa dos análogos 1,2,3-triazólicos de goniotalamina foram comparados à doxorrubicina e à goniotalamina (1) e estão apresentados na Tabela 2. Os dados de TGI desta tabela não exibem margem de erro por se tratar de uma triagem inicial.
Tabela 2: Valores de TGI (µM) para a substância padrão (doxorrubicina), a
goniotalamina (1) e os análogos sintetizados.
Doxo* 1 87 88 89 90 91 111 U251 2,54 0,92 2,67 2,96 2,26 7,85 37,71 5,47 MCF-7 14,32 1,90 3,74 6,23 4,29 6,58 129,61 10,19 NCI-ADR/RES 7,68 9,74 9,67 9,14 23,98 29,17 179,94 2,76 786-0 0,46 1,30 2,45 3,91 2,36 7,11 96,69 2,97 NCI-H460 39,64 2,83 3,53 7,93 7,16 21,30 159,40 37,71 PC-3 3,22 3,10 7,99 7,49 8,03 12,25 73,57 7,00 OVCAR-3 5,75 4,22 11,74 10,15 10,34 29,57 113,88 7,05 HT-29 7,16 2,36 3,00 8,46 8,44 14,26 38,89 4,16 K-562 9,48 3,16 13,04 7,11 12,05 16,66 424,19 113,88 HaCaT 0,35 6,92 4,09 11,72 13,08 101,65 52,81 5,68 *Doxo = doxorrubicina.
Os análogos 1,2,3-triazólicos 87-91 e 111 mostraram, em números absolutos, toxicidade inferior em relação ao quimioterápico de referência e ao produto natural 1 na maioria das linhagens testadas. Entretanto, todos os compostos foram menos tóxicos frente à linhagem de queratinócitos humanos (HaCat) comparados à doxorrubicina.
Contudo, em ordem de grandeza, os derivados testados possuem citotoxicidade comparáveis à goniotalamina (1) frente às linhagens de U251, MCF-7, NCI-ADR/RES, 786-0, NCI-H460 e HT-29, exceto pelo análogo de glicose 91, com valores de TGI muito acima de 1. Isto significa que o anel 1,2,3-triazólico não tem influência significativa na ação antitumoral quando comparado ao produto natural 1. A atividade foi mantida provavelmente devido à presença do grupo farmacofórico (lactona α,β-insaturada) nas estruturas dos compostos testados.
Os derivados 1,2,3-triazólicos truncados 87, 88 e 89 mostraram que não houve efeito significativo dos substituintes elétron-retirador e elétron-doador no anel aromático. Estes três compostos aromáticos apresentaram valores similares de TGI principalmente nas linhagens de U251, 786-0, PC-3 e OVCAR-3. Comparando-se os análogos 87 e 111, observou-se que composto truncado foi um pouco mais citotóxico na maioria das linhagens testadas, possivelmente por esta molécula possuir um tamanho similar ao da goniotalamina (1). No caso de 87, o grupo 1,2,3- triazólico mimetizou a porção estireno do produto natural 1 com sucesso, corroborando com o fato de que é necessária uma estrutura rígida ligada ao anel da lactona para a atividade.59 O derivado 111, contudo, foi o único composto que foi mais potente que a doxorrubicina e a goniotalamina (1; no caso, para a linhagem NCI-ADR/RES), uma evidência de que anéis heteroaromáticos podem substituir o anel benzênico de 1.
Os valores de TGI foram superiores para o composto 90 quando confrontado com os do análogo 87, indicando a importância do anel aromático naquela posição, em acordo com o que foi demonstrado na literatura26 acerca da relevância de um grupamento hidrofóbico naquela parte da molécula, algo que não está presente nos derivados 90 e 91. Entretanto, o análogo 90 foi pouco tóxico a queratinócitos humanos, o que valoriza os valores de TGI observados nas linhagens testadas.
Portanto, os anéis 1,2,3-triazólicos podem ser usados nas pesquisas biológicas de análogos de goniotalamina (1) como elo entre o seu grupo farmacofórico e outras estruturas químicas.
3.2 Síntese e avaliação citotóxica de híbridos fluorescentes de goniotalamina
3.2.1 Síntese do híbrido GTN-BTD 54
O mecanismo de ação da goniotalamina (1) ainda não está completamente elucidado, mesmo tendo atividade antiproliferativa comprovada e vários estudos relacionados ao seu perfil citotóxico. Uma das ferramentas que pode contribuir para este estudo é a bioimagem, em que a molécula de interesse é ligada a um fluoróforo, que permite a visualização de sua localização celular. Nesse campo, derivados 2,1,3-benzotiadiazólicos (BTD) têm sido utilizados com sucesso como sondas fluorescentes.113 Na literatura, encontram-se análogos BTD que foram sintetizados de modo a possuir um sítio de ação em uma de suas extremidades, como intercaladores de DNA ou ligantes de mitocôndrias.110,117 Além disso, derivados de BTD foram ligados à estrutura química de um candidato a fármaco através de um anel 1,2,3-triazólico para determinar sua localização celular.112
Conforme visto nas discussões anteriores do presente trabalho, o anel aromático de 1 pode ser substituído por anéis heteroaromáticos. Portanto, a fim de conhecer o sítio de ação da goniotalamina (1) a nível celular, realizou-se a síntese de análogos de 1 contendo BTD como fluoróforo. Inicialmente, sintetizou-se o composto híbrido mais simples 54 (Esquema 20) a fim de conhecer suas propriedades fotofísicas para determinar a viabilidade dos ensaios de bioimagem.
O 2,1,3-benzotiadiazol 112 possui dois sítios de reação: o grupamento aldeído, onde pode ser construído o anel da lactona, e o átomo de bromo, onde pode ser adicionado o doador de elétrons π da sonda fluorescente. Como o grupo aldeído é o mais reativo, optou-se por realizar a primeira etapa reagindo 112 com fosfonoacetato de trietila em uma reação de olefinação de Horner-Wadsworth- Emmons, obtendo-se o éster 113 como o único isômero (E) em 99% de rendimento. Optou-se por sintetizar a lactona α,β-insaturada após a reação de acoplamento C-C de Suzuki,134 pois esta é realizada com reagente básico e água, que pode causar uma hidrogenólise do anel. Portanto, o brometo 113 foi submetido à esta reação de acoplamento utilizando ácido 4-metoxifenilborônico, sal de paládio (II), trifenilfosfina e solução aquosa de carbonato de sódio, produzindo o éster 57 em 85% de rendimento, após a otimização da reação.