Atividade antimicrobiana

A atividade antimicrobiana de óleo essencial e oleoresina de canela vêm sendo estudada ao longo dos anos. Dussault et al. (2014) avaliaram a atividade antimicrobiana de diversos óleos essenciais e oleoresinas contra patógenos comumente encontrados em alimentos. Eles compararam o efeito inibitório da oleoresina e óleo essencial de canela, e os resultados foram semelhantes para ambos. Zhang et al. (2015) avaliaram o efeito inibitório de óleo essencial de canela contra E. coli e S. aureus. Foram determinados a concentração inibitória mínima e o halo de inibição e os resultados mostraram que o óleo essencial apresentou maior capacidade de inibição contra S. aureus.

O método de difusão em Agar utilizando a técnica da cavidade, onde a oleoresina é depositada em poços cortados no Agar solidificado, é indicado quando deseja-se determinar a atividade antimicrobiana de um grande número de amostras (BURT, 2004). Tendo em vista a avaliação da OC livre mais 3 formulações de MLS estocadas durante 28 dias em duas temperaturas diferentes, optou-se por utilizar essa metodologia.

O processo de microencapsulação da oleoresina de casca de canela acarretou em perda dos componentes voláteis, o que pode influenciar sua atividade antimicrobiana. Além disso, a temperatura e tempo de armazenamento das mesmas podem alterar a conformação da partícula, fazendo com que mais voláteis sejam liberados. Sendo assim, avaliou-se através do método de halo de inibição o poder antimicrobiano das micropartículas e da oleoresina livre estocadas a 25 e 45 °C nos dias 0, 7, 14 e 28 da estabilidade. Os detalhes dos resultados obtidos nessa análise estão apresentados nas Tabelas C.1 e C.2 do Apêndice B.

Foram selecionados uma levedura (Candida pseudointermedia) e um bolor (Penicillium paneum) para a avaliação. Uma bactéria Gram-negativa (P. aeruginosa) também foi analisada, mas já no dia zero, nenhuma das amostras testadas foi capaz de inibir seu crescimento. Como demonstrado na avaliação da MIC (Tabela 5.11), as bactérias demonstraram ser mais resistentes em relação à oleoresina e a concentração de ativo presente na alíquota utilizada para avaliação do halo de inibição não foi suficiente para inibi-las. Sendo assim, optou-se por avaliar os halos de inibição apenas para o bolor e levedura selecionados. Os resultados obtidos encontram-se nas Tabelas 5.20 e 5.21.

Tabela 5.20. Halos de inibição das micropartículas e oleoresina de canela livre contra Candida pseudointermedia. Halo de inibição (mm) Formulação Dia 0 7 14 28 F1 - 25°C SI 9,73 ± 0,62 b 11,63 ± 0,83b 16,48 ± 0,38a F1 - 45°C 8,15 ± 0,41a 8,43 ± 0,68a IT F2 - 25°C 12,53 ± 0,7a 13,40 ± 0,67 a 14,35 ± 0,43 a IT F2 - 45°C 12,53 ± 0,7b 13,04 ± 2,34b 11,79 ± 0,37b 36,86 ± 2,63a F3 - 25°C 12,40 ± 0,73b 12,22 ± 0,77b 12,30 ± 1,60b 19,93 ± 0,88a F3 - 45°C 12,40 ± 0,73b 12,35 ± 1,18b 10,65 ± 0,84b 18,47 ± 0,58a OC - 25°C 15,15 ± 0,42a 14,54 ± 1,03a 18,98 ± 1,72a IT OC - 45°C 15,15 ± 0,42a 18,6 ± 3,76a 17,62 ± 1,73a IT

Valores são médias de dois ensaios, com cada placa contendo a amostra em triplicata.

Letras minúsculas diferentes em cada linha representam diferença estatisticamente significativa (p≤0,05). SI: sem inibição; IT: inibição total.

Tabela 5.21. Halos de inibição das micropartículas e oleoresina de canela livre contra Penicillium paneum. Halo de inibição (mm) Formulação Dia 0 7 14 28 F1 - 25°C SI 10,19 ± 1,52 SI SI F1 - 45°C SI SI SI F2 - 25°C 12,53 ± 0,70b 10,67 ± 1,76b 11,19 ± 1,15b 15,11 ± 0,98a F2 - 45°C 12,53 ± 0,70c 10,24 ± 1,01b,c 11,37 ± 1,39b 14,45 ± 0,49a F3 - 25°C 12,40 ± 0,73c 11,79 ± 1,41b 8,71 ± 0,70c 13,47 ± 0,52a F3 - 45°C 12,40 ± 0,73b 7,93 ± 0,36c SI 11,47 ± 0,31a OC - 25°C 15,15 ± 0,42b 17,91 ± 1,78b 18,28 ± 1,86b 22,63 ± 2,75a OC - 45°C 15,15 ± 0,42b 17,94 ± 2,00b 15,46 ± 1,13b 23,17 ± 2,02a

Valores são médias de dois ensaios, com cada placa contendo a amostra em triplicata.

Letras minúsculas diferentes em cada linha representam diferença estatisticamente significativa (p≤0,05). SI: sem inibição.

Como descrito na metodologia (item 4.2.3.2) a avaliação da capacidade de inibição das micropartículas e OC se deu de maneira diferente, pois não foi possível solubilizar as MLS em solventes permitidos para análise microbiológicas. A gota lipídica sólida, formada a partir das MLS fundidas, permitiu o contato direto com o Agar apenas na sua parte inferior. Por possuírem maior afinidade pelos lipídios presentes na matriz e por conta da barreira física formada pelo material, a difusão dos compostos voláteis para o meio pode ter sido prejudicada. Já para a OC livre, adicionada às cavidades formadas no Agar, foi possível obter sua completa difusão para o meio. Sendo assim, deve-se levar em consideração essa diferença entre as formas de contato e de liberação dos compostos voláteis na avaliação dos resultados. A Figura 5.27 ilustra a diferença entre as placas obtidas para as MLS e OC livre.

Figura 5.27. Halos de inibição contra Candida pseudointermedia no sétimo dia de armazenamento, para as

formulações estocadas a 25 °C.

F1- 100:0 (HP:OP) + 2% OC; F2- 80:20 (HP:OP) + 2% OC; F3- 60:40 (HP:OP) + 2% OC. HP: hardfat de palma; OP: óleo de palma; OC: oleoresina de canela

Nota-se através dos resultados apresentados na Tabela 5.20 que a formulação F1, formada apenas de hardfat de palma como agente carreador, não apresentou inibição no dia 0 de armazenamento contra Candida pseudointermedia. A presença de grande quantidade de lipídios saturados diminui a solubilidade dos compostos voláteis, levando a uma maior e mais rápida expulsão do ativo (PARAVISINI; GUICHARD, 2016). Além disso, a estrutura compacta da gota lipídica pode ter impedido a difusão dos compostos voláteis ainda aprisionados na matriz. À medida que as mudanças polimórficas ocorreram, a estrutura pode ter se modificado e os compostos voláteis liberados. Diferenças significativas (p<0,05) foram encontradas apenas a partir do dia 28 para as formulações F2, F3 e OC livre.

Para todas as formulações, nota-se que houve um aumento no halo de inibição contra Candida pseudointermedia. De acordo com os resultados vistos anteriormente no item 5.4.3, houve uma possível degradação do ácido cinâmico que pode ter levado ao aumento dos compostos OmCn e Co. Estes compostos apresentam atividade antimicrobiana e podem ter

contribuído para o aumento do poder de inibição (GUNAWARDENA et al., 2015). Segundo Singh et al. (2007), a capacidade antimicrobiana de óleos essenciais e oleoresinas deve ser atribuída ao efeito sinérgico ou antagônico de seus componentes. Sendo assim, a variação na concentração dos compostos majoritários ao longo do período de armazenamento pode aumentar ou diminuir o efeito inibitório da OC.

Avaliando os resultados contra Penicillium paneum (Tabela 5.21), nota-se que, novamente, a formulação F1 pode ter permitido uma rápida liberação dos compostos voláteis, apresentando halo de inibição contra o micro-organismo apenas no dia 7, para as amostras armazenadas a 25 °C.

As formulações F2 e F3 apresentaram diferença significativa (p<0,05) ao longo dos dias avaliados. As mudanças na parede das partículas, provenientes das transições polimórficas, podem ter influenciado os diferentes resultados. Além disso, apesar de terem sido pré-fundidas a uma mesma temperatura e durante aproximadamente o mesmo tempo, as formulações podem ter sofrido influência desses fatores, havendo perda dos voláteis durante a preparação das amostras para o plaqueamento. Mesmo assim, as amostras foram capazes de inibir o crescimento do bolor até o último dia de estocagem.

A oleoresina livre apresentou diferença significativa no halo de inibição contra

Penicillium paneum apenas no dia 28 de armazenamento, havendo um aumento do mesmo ao longo do tempo. A temperatura elevada de estocagem pode ter favorecido a degradação do ácido cinâmico, contribuindo para a maior atividade antimicrobiana.

As micropartículas lipídicas contendo oleoresina de casca de canela apresentaram- se como potenciais agentes antimicrobianos, sendo as formulações que continham mistura de lipídios saturados e insaturados mais efetivas. O processo de microencapsulação conferiu uma maior estabilidade aos compostos voláteis, permitindo assim que a capacidade de inibição contra os micro-organismos avaliados não fosse perdida ao longo do armazenamento. A aplicação das MLS em produtos alimentares que apresentam grandes problemas de contaminação por fungos, tais como pães e bolos, é interessante, podendo aumentar a vida de prateleira dos mesmos.