UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia de Alimentos
FERNANDA RAMALHO PROCOPIO
Micropartículas lipídicas contendo oleoresina de casca de canela (Cinnamomum
zeylanicum & cassia L.): produção, caracterização e estabilidade.
CAMPINAS
FERNANDA RAMALHO PROCOPIO
Micropartículas lipídicas contendo oleoresina de casca de canela (Cinnamomum
zeylanicum & cassia L.): produção, caracterização e estabilidade.
Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestra em Engenharia de Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Miriam Dupas Hubinger – FEA/UNICAMP
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA FERNANDA RAMALHO PROCOPIO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MÍRIAM DUPAS HUBINGER.
CAMPINAS
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Márcia Regina Garbelini Sevillano - CRB 8/3647
Procopio, Fernanda Ramalho,
P942m ProMicropartículas lipídicas contendo oleoresina de casca de canela (Cinnamomum zeylanicum & cassia L.) : produção, caracterização e estabilidade / Fernanda Ramalho Procopio. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
ProOrientador: Miriam Dupas Hubinger.
ProDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Pro1. Microencapsulação. 2. Spray chilling. 3. Atividade antimicrobiana. 4. Óleo de palma. I. Hubinger, Miriam Dupas. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Solid lipid microparticles containing cinnamom bark oleoresin (Cinnamomum zeylanicum & cassia L.) : production, characterization and stability Palavras-chave em inglês:
Microencapsulation Spray chilling
Antimicrobial activity Palm oil
Área de concentração: Engenharia de Alimentos Titulação: Mestra em Engenharia de Alimentos Banca examinadora:
Miriam Dupas Hubinger [Orientador] Izabela Dutra Alvim
Maria Cristina Chiarinelli Nucci Mascarenhas Data de defesa: 09-03-2018
Programa de Pós-Graduação: Engenharia de Alimentos
______________________________________________ Profª Drª Míriam Dupas Hubinger
(Orientadora – DEA/ FEA/ UNICAMP)
______________________________________________ Drª Izabela Dutra Alvim
(Membro Titular - Cereal Chocotec/ ITAL)
______________________________________________ Dra Maria Cristina Chiarinelli Nucci Mascarenhas
(Membro Titular – NOVIGA PARTNER)
A Ata da Defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no processo de vida acadêmica do aluno.
“Crê em ti mesmo, age e verás os resultados. Quando te esforças, a vida também se esforça para te ajudar.”
Chico Xavier
Aos meus pais, irmãos e a toda minha família que, com muito carinho e apoio, não mediram esforços para que eu chegasse até essa etapa da minha vida. Amo vocês!
À Deus, por estar sempre presente iluminando meu caminho e abençoando minhas escolhas. Aos meus pais, Elizabete e José Fernandes, pelo apoio, carinho, dedicação e confiança demonstrados em todos os momentos de minha vida.
Aos meus irmãos, Mariana, Murilo e Carla pelo amor, cumplicidade e parceria desde a infância.
À Profª. Drª. Miriam Dupas Hubinger pela orientação, amizade, paciência e oportunidade de aprendizado.
À banca examinadora, Drª Izabela Dutra Alvim, Drª Maria Cristina C. N. Mascarenhas e profª Drª Louise Emy Kurozawa, pelas correções e sugestões que enriqueceram este trabalho. À Faculdade de Engenharia de Alimentos e ao Departamento de Engenharia de Alimentos pela oportunidade de realizar este trabalho.
Às companheiras de laboratório, Renata, Larissa, Ana Gabriela, Gabriela, Eliana, Klycia, Juliana, Ana Gabriela A., pela paciência, auxílio e conselhos durante essa jornada. Em especial à Vivian, pelo carinho, atenção e apoio na realização desse trabalho.
A toda a equipe do LEP, especialmente à Zildene e à Vanessa pela prontidão e carinho em ajudar.
Ao Laboratório de Bioaromas, especialmente ao doutorando Bruno Paulino.
Ao Laboratório de Microbiologia Quantitativa de Alimentos (LMQA), em especial ao doutorando Leonardo Silva.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de mestrado e pelo apoio financeiro.
Aos amigos, familiares e a todos que de alguma forma contribuíram para a conquista desse sonho.
A oleoresina de casca de canela (OC) é um aromatizante natural que possui diversas propriedades biológicas, podendo atuar como agente antimicrobiano e antioxidante. Porém, oleoresinas são susceptíveis à degradação pela luz, oxigênio e temperatura. Sendo assim, a microencapsulação desses compostos promove a proteção contra fatores externos além de facilitar sua aplicação em sistemas diversos. Dentre os métodos existentes, o processo de
spray chilling apresenta vantagens devido ao baixo custo, condições brandas de operação e
possibilidade de produção em larga escala. O objetivo deste trabalho foi, portanto, a produção, caracterização de micropartículas de OC, obtidas pela técnica de spray chilling, utilizando
hardfat (HP) e óleo de palma (OP) como carreadores, em diferentes proporções: 100:0; 80:20;
60:40. A concentração de ativo foi de 1 e 2% (m/m) em relação à massa total de lipídio. As micropartículas lipídicas sólidas (MLS) foram armazenadas a 25 e 45 °C tendo o seu comportamento térmico, polimorfismo, capacidade de retenção dos compostos voláteis e capacidade antimicrobiana avaliadas ao longo de 28 dias. A OC apresentou cinamaldeído (Cn), O-metoxi-cinamaldeído (OmCn) e cumarina (Co) como os componentes voláteis majoritários. A concentração inibitória mínima (MIC) da OC contra bolores, leveduras e bactérias Gram-negativas foi determinada, sendo possível a inibição de todos eles com uma concentração de 0,1% (v/v). Na caracterização das MLS, houve variação de tamanho significativo, apresentando diâmetro médio (d 0.5) na faixa de 8-72 µm. A maioria das formulações apresentou cristais na forma polimórfica β’. A formulação que continha apenas HP como agente carreador e 2% de OC foi capaz de reter melhor os compostos voláteis. Durante o período de armazenamento, as formulações contendo proporções de HP e OP de 80:20 e 60:40, respectivamente, e 2 % de OC apresentaram melhor estabilidade em relação à concentração de Cn. Houve aumento no conteúdo de OmCn e Co para todas as formulações armazenadas a 25 °C, que pode estar relacionado a uma degradação do ácido cinâmico. O poder antimicrobiano das MLS contra Candida pseudointermedia e Penicillium paneum,
avaliado através do halo de inibição, aumentou ao longo dos 28 dias. As partículas com maior teor de ácidos graxos insaturados apresentaram-se como potenciais agentes antimicrobianos para produtos de panificação.
Cinnamon bark oleoresin (OC) is a natural flavoring agent that has several biological properties and can act as an antimicrobial and antioxidant agent. However, oleoresins are susceptible to degradation by light, oxygen and temperature. Thus, the microencapsulation of these compounds promotes the protection against external factors besides facilitating their application in many systems. Among the existing methods, the spray chilling process has advantages due to the low cost, soft operation conditions and possibility of large scale production. The objective of this work was, therefore, the production, characterization of microparticles of OC, obtained by the spray chilling technique, using hardfat (HP) and palm oil (OP) as carriers, in different proportions: 100: 0; 80:20; 60:40. The active concentration was 1 and 2%. Solid lipid microparticles (SLM) were stored at 25 and 45 ° C having their thermal behavior, polymorphism, retention capacity of the volatile compounds and antimicrobial capacity assessed over 28 days. OC presented cinnamaldehyde (Cn), O-methoxy cinnamaldehyde (OmCn) and coumarin (Co) as the major volatile components. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the OC against molds, yeasts and Gram-negative bacteria was determined, inhibiting all of them at a concentration of 0.1% (v/v). In SLM characterization there was a significant size variation, with a mean diameter (d 0.5) in the range of 8-72 μm. Most of the formulations showed crystals in the polymorphic form β '. The formulation containing only HP as the carrier agent and 2% OC was able to retain the volatile compounds better. During the storage period, formulations F2 and F3 containing proportions of HP and OP of 80:20 and 60:40, respectively, and 2% of OC showed better stability relative to the concentration of Cn. There was an increase in the content of OmCn and Co for all formulations stored at 25 ° C, which may be related to a degradation of the cinnamic acid. The antimicrobial activity of the SLM against Candida pseudointermedia and Penicillium
paneum evaluated by diameter of inhibition zone, increased over the 28 days. Particles with
higher content of unsaturated fatty acids presented potential application as antimicrobial agents for bakery products.
Figura 3.1. Principais compostos voláteis encontrados na oleoresina de casca de canela. ... 22
Figura 3.2 - Representação esquemática dos sistemas de encapsulação. (A), (B), (C) e (D) – Microcápsulas (reservatório); (E) – Microesfera (matriz). ... 24
Figura 3.3. Esquema de equipamento spray chilling.. ... 26
Figura 3.4. Esquema dos tipos mais comuns de organização molecular de triacilgliceróis.. .. 31
Figura 4.1. Diagrama das etapas envolvidas na realização desse trabalho. ... 34
Figura 4.2. Etapas para a produção das micropartículas lipídicas. ... 41
Figura 4.3. Equipamento no modo spray chilling (mini Spray Dryer Buchi – 291). ... 41
Figura 5.1. Curva de cristalização (A) e fusão (B) obtidas para o óleo de palma. ... 48
Figura 5.2. Curva de cristalização (A) e fusão (B) obtidas para o hardfat de palma. ... 49
Figura 5.3. Difratogramas de hardfat e óleo de palma. ... 51
Figura 5.4. Curvas de fusão obtidas para as misturas contendo proporção de hardfat e óleo de palma de 60:40 (A), 70:30 (B), 80:20 (C), 90:10 (D), 100:0 (E). ... 52
Figura 5.5. Curvas de cristalização obtidas para as misturas contendo proporção de hardfat e óleo de palma de 60:40 (A), 70:30 (B), 80:20 (C), 90:10 (D), 100:0 (E)... 53
Figura 5.6. Influência do tipo de revestimento das fibras na eficiência de extração de compostos voláteis da oleoresina de canela pela técnica de HS-SPME, considerando: (a) número de picos e (b) área total dos picos. PA – poliacrilato; DVB – divinilbenzeno; CAR – carboxen; PDMS – polidimetilsiloxano. ... 55
Figura 5.7. Representatividade dos compostos majoritários em cada fibra. PA – poliacrilato; DVB – divinilbenzeno; CAR – carboxen; PDMS – polidimetilsiloxano. ... 55
a seguinte composição: (A) 100:0 (HP:OP) + 1% OC; (B) 80:20 (HP:OP) + 1% OC; (C) 60:40 (HP:OP) + 1% OC; (D) 100:0 (HP:OP) + 2% OC; (E) 80:20 (HP:OP) + 2% OC; (F)
60:40 (HP:OP) + 2% OC ... 63
Figura 5.11. Distribuição de tamanho das micropartículas lipídicas... 65
Figura 5.12. Difratogramas das micropartículas lipídicas. As formulações apresentam a seguinte coposição em hardfat de palma (HP), óleo de palma (OP) e oleoresina de canela (OC): FIOC1- 100:0 (HP:OP) + 1% OC; F1OC2 100:0 (HP:OP) + 2% OC; F2OC1 - 80:20 (HP:OP) + 1% OC; F2OC2 - 80:20 (HP:OP) + 2% OC; F3OC1 - 60:40 (HP:OP) + 1% OC; F3OC2 - 60:40 (HP:OP) + 2% OC. ... 68
Figura 5.13. Morfologia das micropartículas com 1% de oleoresina de casca de canela. ... 69
Figura 5.14. Morfologia das micropartículas com 2% de oleoresina de casca de canela. ... 70
Figura 5.15. Curva padrão de Cinamaldeído. ... 72
Figura 5.16. Termograma da formulação F1 (100:0- HP:OP+2%OC) estocada a 25 °C. ... 75
Figura 5.17. Termograma da formulação F1(100:0- HP:OP+2%OC) estocada a 45 °C. ... 75
Figura 5.18. Termograma da formulação F2 (80:20- HP:OP+2%OC) estocada a 25 °C. ... 76
Figura 5.19. Termograma da formulação F2 (80:20- HP:OP+2%OC) estocada a 45 °C. .... 76
Figura 5.20. Termograma da formulação F3 (60:40- HP:OP+2%OC) estocada a 25 °C. ... 78
Figura 5.21. Termograma da formulação F3 (60:40- HP:OP+2%OC) estocada a 45 °C. ... 78
Figura 5.22. Polimorfismo das formulações F1, F2 e F3 ao longo da estabilidade. ... 80
Figura 5.23. Concentração de cinamaldeído nos dias 0 e 28 da estabilidade a 25 °C. (Letras minúsculas diferentes para o mesmo dia representam diferença estatisticamente significativa (p≤0,05). ... 82
Figura 5.26. Área normalizada dos compostos majoritários da OC obtida por GC-MS ao
longo da estocagem para as formulações armazenadas a 45 °C. ... 85
Figura 5.27. Halos de inibição contra Candida pseudointermedia no sétimo dia de
Tabela 3.1. Principais técnicas de encapsulação. ... 25
Tabela 3.2. Características de micropartículas encapsuladas por spray chilling. ... 28
Tabela 3.3. Composição em ácidos graxos da gordura de palma e suas principais frações. ... 32
Tabela 4.1. Composição das misturas lipídicas avaliadas. ... 37
Tabela 4.2. Variáveis dependentes utilizadas para planejamento experimental 2³. ... 38
Tabela 4.3. Composição das micropartículas lipídicas. ... 42
Tabela 5.1. Composição em ácidos graxos do óleo e hardfat de palma. ... 46
Tabela 5.2. Composição em triacilgliceróis do óleo e hardfat de palma. ... 47
Tabela 5.3. Parâmetros da curva de fusão obtidos para os agentes carreadores. ... 49
Tabela 5.4. Parâmetros da curva de cristalização obtidos para os agentes carreadores. ... 49
Tabela 5.5. Parâmetros da curva de fusão das misturas lipídicas. ... 52
Tabela 5.6. Parâmetros da curva de cristalização das misturas lipídicas... 53
Tabela 5.7. Coeficientes de regressão para a resposta Área Total (a.u). ... 56
Tabela 5.8 ANOVA para a resposta Área Total. ... 57
Tabela 5.9. Condições ótimas para extração e identificação dos compostos voláteis. ... 58
Tabela 5.10. Identificação dos compostos voláteis da oleoresina de canela. ... 59
Tabela 5.11. Concentração inibitória mínima da oleoresina de canela. ... 60
Tabela 5.12. Condições de processamento e rendimento das MLS. ... 62
Tabela 5.13. Diâmetro médio e distribuição de tamanho das micropartículas lipídicas. ... 63
Tabela 5.14. Formas polimórficas das micropartículas lipídicas. ... 66
temperaturas de estocagem. ... 75
Tabela 5.18. Parâmetros da curva de fusão obtidos para a formulação F2 nas duas
temperaturas de estocagem. ... 77
Tabela 5.19. Parâmetros da curva de fusão obtidos para a formulação F3 nas duas
temperaturas de estocagem. ... 78
Tabela 5.20. Halos de inibição das micropartículas e oleoresina de canela livre contra
Candida pseudointermedia. ... 87
Tabela 5.21. Halos de inibição das micropartículas e oleoresina de canela livre contra
OC: oleoresina de casca de canela; Cn: cinamaldeído;
OmCn: o-metoxi-cinamaldeído; Co: cumarina;
MLS: micropartículas lipídicas sólidas; OP: óleo de palma;
HP: hardfat de palma;
MIC: concentração inibitória mínima; DMSO: dimetilsulfóxido TAG: triacilglicerol; PA: poliacrilato; PDMS: polidimetilsiloxano; DVB: divinilbenzeno; CAR: carboxen;
ΔHfusão: entalpia de fusão;
ΔHcristalização: entalpia de cristalização;
Tonset,f: temperatura inicial de fusão;
Tonset,c: temperatura inicial de cristalização;
Tendset,f: temperatura final de fusão;
Tendset,c: temperatura final de cristalização;
Tpeak,f: temperatura de pico de fusão;
2. OBJETIVO ... 20
2.1 Objetivos específicos ... 20
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 21
3.1 Oleoresinas ... 21
3.1.1 Oleoresina de casca de canela ... 22
3.2 Microencapsulação ... 23
3.2.1 Spray chilling ... 26
3.2 Lipídios ... 29
3.2.1Cristalização e polimorfismo ... 30
3.2.2 Óleo e hardfat de palma ... 31
3.3 Microencapsulação de agentes antimicrobianos naturais ... 32
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 34
4.1 Material ... 34
4.2 Métodos ... 34
4.2.1 Etapa 1: Caracterização dos lipídios carreadores e oleoresina de casca de canela .. 35
4.2.2 Etapa 2: Produção e caracterização das micropartículas lipídicas carreadoras de oleoresina de casca de canela ... 40
4.2.3 Etapa 3: Estudo da estabilidade das micropartículas lipídicas ... 44
4.2.4 Análise estatística ... 45
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 46
5.1 Etapa 1: Caracterização dos lipídios carreadores e oleoresina de casca de canela ... 46
5.1.1 Caracterização do óleo e hardfat de palma ... 46
5.1.2 Seleção da mistura lipídica para produção das micropartículas ... 51
5.1.3 Caracterização da oleoresina de casca de canela ... 53
5.2 Etapa 2: Produção e caracterização das micropartículas lipídicas sólidas (MLS) carreadoras de oleoresina de casca de canela ... 61
5.2.1 Produção das micropartículas lipídicas sólidas (MLS) ... 61
5.2.2 Diâmetro médio e distribuição de tamanho das partículas ... 63
5.2.3 Polimorfismo ... 66
5.2.4 Morfologia ... 69
5.2.5 Capacidade de retenção de cinamaldeído... 71
5.3.3 Retenção dos compostos voláteis durante a estocagem ... 82
5.3.4 Atividade antimicrobiana ... 86
6. CONCLUSÕES ... 91
7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 92
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 93
APÊNDICE A ... 104
APÊNDICE B ... 105
1. INTRODUÇÃO
Com o aumento da preocupação com a saúde, o consumidor procura cada vez mais produtos alimentares naturais que possuam algum apelo nutricional. A utilização de extratos naturais como substitutos dos agentes sintéticos utilizados para manutenção da qualidade de alimentos vai de encontro a essa tendência (LANG; BUCHBAUER, 2011).
A canela (Cinnamomun sp.) pode ser considerada uma das especiarias mais antigas sendo amplamente utilizada na culinária, devido ao seu sabor e aroma característicos. Pertence à família das Lauráceas e é cultivada principalmente em países como Índia, Sri Lanka e China. Desperta o interesse também por suas propriedades medicinais. Os extratos de canela, seja o óleo essencial ou a oleoresina, possuem grande aplicação em alimentos, cosméticos e pesticidas, devido às propriedades antimicrobianas, antioxidantes e antifúngicas que apresentam (KIM; MARSHALL; WEI, 1995).
A oleoresina de canela apresenta-se como um líquido viscoso e escuro obtido por extração com solvente de diferentes partes da planta. Vem sendo utilizada como agente saborizante em bolos e confeitos, substituindo o uso da especiaria seca (KRISHNAMOORTHY; REMA, 2004). A composição química da oleoresina de canela depende da origem de cultivo e de em qual parte da planta ocorreu a extração. Geralmente, o óleo essencial proveniente da casca de canela apresenta cinamaldeído (65-95%), acetato de cinamilo, ácido cinâmico, benzaldeído e cumarina como os principais compostos voláteis. Diversas atividades biológicas, como antitumorais, antifúngicas, antimutagênicas, foram atribuídas ao cinamaldeído (MATHEW;ABRAHAM, 2006; SHAABAN; EL-GHORAB; SHIBAMOTO, 2012 ). Apesar disso, oleoresinas são consideradas misturas complexas de diversas classes de compostos e suas atividades biológicas devem ser atribuídas ao efeito sinérgico de todos eles (SINGH et al., 2007)
As oleoresinas apresentam, além do aroma, o sabor total e a pungência das especiarias. Elas são mais concentradas do que os óleos essenciais e, portanto, permitem sua aplicação em menores quantidades (UHL, 2000; VAIDYA et al., 2006). No entanto, também são suscetíveis à degradação por exposição à luz, calor e oxigênio, o que torna difícil garantir sua estabilidade. A microencapsulação de oleoresinas pode oferecer soluções possíveis para resolver os desafios enfrentados por suas aplicações em alimentos (CALO et al., 2015).
A microencapsulação é um processo onde uma substância é revestida ou incorporada em uma matriz, dando origem a pequenas partículas capazes de proteger o composto contra fatores externos. Os compostos a serem encapsulados podem ser gotículas líquidas, partículas sólidas ou até mesmo compostos gasosos (GARSALLAOUI et al., 2007). As aplicações desta técnica na indústria alimentícia têm aumentado, pois proporcionam maior estabilidade, proteção e viabilidade dos ingredientes, além de mascarar odores e sabores e, em alguns casos, promover uma liberação controlada (GIBBS; KERMASHA, ALLI, MULLIGAN, 1999; NEDOVIC et al. 2011; SOBEL; VERSIC; GAONKAR, 2014).
Dentre as diversas técnicas de microencapsulação existentes, o método de spray
chilling se destaca pelo custo relativamente baixo, possibilidade de produção em larga escala
e temperaturas brandas de processamento, quando comparado ao spray dryer, por exemplo. A técnica consiste na solidificação do material lipídico utilizado como agente encapsulante através do contato com a câmara fria após a passagem pelo atomizador (OKURO; MATOS-JR; FAVARO-TRINDADE, 2013).
Diversos materiais lipídicos podem ser utilizados na microencapsulação por spray
chilling. É de interesse que a matriz apresente boa propriedade de cristalização, baixo custo e
compatibilidade com o ativo lipofílico. O óleo de palma apresenta característica semissólida à temperatura ambiente (25 °C), é livre de ácido graxo trans e possui ponto de fusão variando entre 32-40 °C (LIN, 2002). A formação de partículas estáveis, que apresentam baixa aderência e, portanto, maior rendimento na microencapsulação por spray chilling requer uma matriz lipídica com ponto de fusão superior a 45 °C (RIBEIRO, 2010; ALVIM et al., 2013). O hardfat de palma (óleo de palma totalmente hidrogenada livre em trans) apresenta ponto de fusão de aproximadamente 60 °C (O’BRIEN, 2004). Sendo assim, a utilização de hardfat de palma em conjunto com óleo de palma possibilita um aumento no ponto de fusão da matriz lipídica carreadora, permitindo a formação de micropartículas de menor aderência, maior facilidade de manuseio e, consequentemente, maior rendimento (SANTOS, 2014).
Um dos objetivos de se promover a microencapsulação de um ativo é permitir a liberação controlada do mesmo no meio no qual será inserido. Tendo a oleoresina boas propriedades antifúngicas e antibacterianas, as partículas podem promover a proteção de um alimento por um período de tempo prolongado, já que permitem a liberação gradual do ativo. Porém, devido à volatilidade dos compostos da oleoresina de casca de canela e dependendo das condições de processamento, os compostos podem ser rapidamente liberados. Sendo
assim, é interessante que se acompanhe a estabilidade das micropartículas a fim de garantir que as propriedades do material encapsulado serão mantidas ao longo do tempo.
Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi a produção e caracterização de micropartículas lipídicas contendo oleoresina de casca de canela, obtidas por spray chilling. Um estudo da estabilidade e potencial antimicrobiano durante o período de armazenamento também foi realizado a fim de avaliar o comportamento das micropartículas ao longo do tempo.
2. OBJETIVO
Produzir, caracterizar e avaliar a estabilidade de micropartículas lipídicas formadas por óleo e hardfat de palma (carreadores) e oleoresina de casca de canela (ativo), obtidas por spray chilling..
2.1 Objetivos específicos
Otimizar a extração dos compostos voláteis;
Determinar a concentração inibitória mínima da oleoresina de casca de canela contra diferentes micro-organismos;
Caracterizar as micropartículas em relação à morfologia, tamanho, polimorfismo e retenção dos compostos voláteis
Avaliar a estabilidade das micropartículas armazenadas a 25 e 45 °C, durante 28 dias, em relação ao polimorfismo, comportamento térmico, retenção de voláteis e potencial antimicrobiano.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Oleoresinas
Oleoresinas são classificadas como o segundo produto mais importante derivado de especiarias, sendo o primeiro os óleos essenciais (UHL, 2000; KALEMBA; WAJS, 2011). São definidas como extratos líquidos ou semissólidos obtidos a partir de especiarias por extração com solvente, contendo compostos voláteis e não voláteis (REVERCHON, 1997).
Um processo comum de extração de oleoresina é primeiro obter o óleo essencial através da destilação a vapor e, posteriormente, expor o material restante a um solvente para extrair a fração não volátil. Após a remoção do solvente, os dois extratos são misturados, homogeneizados, estabilizados com alguns óleos (mono e diglicerídeos) e padronizados para um teor de óleo essencial (CURRY; NIP, 2006; KHASANAH et al., 2017).
As oleoresinas podem ser consideradas produtos secundários do cultivo de especiarias. Possuem uma ampla gama de aplicações devido à sua composição química variada. A maioria dos componentes das oleoresinas consiste em terpenóides lipofílicos, fenilpropanóides ou derivados de hidrocarbonetos alifáticos de baixo peso molecular (BAKKALI et al., 2008). Além disso, algumas oleoresinas compreendem compostos de cor e pungência.
O mercado global de oleoresinas envolveu cerca de US $ 449,4 milhões em 2015, com a Índia responsável por 50% da produção mundial (GRAND VIEW RESEARCH, 2016). Na Europa, as importações de oleoresinas aumentaram a uma taxa anual média de 3,0% no período 2011-2015, sendo o Reino Unido, a Alemanha, a Espanha e a França os mercados finais mais importantes. A comercialização de especiarias sob a forma de oleoresinas e óleos essenciais é uma forma de agregar valor ao produto. Com a crescente preocupação com a saúde, os consumidores estão cada vez mais à procura de produtos naturais com algum apelo nutricional. O uso de óleos essenciais e oleoresinas como substitutos para agentes sintéticos está em linha com essa tendência (LANG ; BUCHBAUER, 2011).
O flavor, aroma e cor são as propriedades responsáveis pela maioria dos usos das oleoresinas. Elas também despertam interesse devido às suas várias propriedades funcionais, tais como antioxidantes, anti-inflamatórios, antimicrobianos, anticancerígenos e repelentes de insetos, incluindo aplicações nos setores gastronômico, nutricional e farmacêutico (BAKKALI et al., 2008; LANG; BUCHBAUER, 2011). As oleoresinas de páprica, cúrcuma e açafrão são geralmente utilizadas para conferir cor ao produto. Já as de orégano, cravo e
canela têm uma excelente atividade antimicrobiana. Aroma e pungência são funções típicas de oleoresinas de gengibre, mostarda e pimenta (UHL, 2000).
3.1.1 Oleoresina de casca de canela
A canela (Cinnamomum sp.) é considerada como uma das especiarias mais comuns utilizadas como aromatizante em alimentos. É uma especiaria de origem asiática, pertencente à família das Lauráceas, e cultivada em países como Índia, Indonésia, Siri Lanka e China. A casca de canela é obtida através do tronco da árvore, separando os ramos secos de suas "cascas" marrom-avermelhadas (KOKETSU et al., 1997). Devido às suas propriedades antimicrobiana, antioxidante e anticancerígena, a canela tem sido utilizada em alimentos, condimentos, cosméticos e medicamentos (MATHEW; ABRAHAM, 2006a, JAYAPRAKASHA et al., 2003). De acordo com a Medicina Tradicional Chinesa, a casca de canela pode ser usada contra sintomas de dor abdominal, calafrios e diarreia (CURRY; NIP, 2006).
A oleoresina de canela é um líquido viscoso de coloração marrom escura utilizada como substituto das especiarias frescas para conferir flavor a bolos e confeitos (KRISHNAMOORTHY; REMA, 2004). Tem o delicado aroma da especiaria e um sabor doce e pungente. A composição química da oleoresina de canela depende da origem e de qual parte da planta foi utilizada para a extração de óleo essencial. O óleo essencial proveniente da casca possui cinamaldeído (65-95%), acetato de cinamila, ácido cinâmico, benzaldeído e cumarina como os principais componentes voláteis. Por outro lado, os principais compostos presentes no óleo essencial da folha da caneleira são eugenol (70-95%), linalol, aldeído cinâmico e cariofileno (SINGH et al., 2007). A estrutura química de alguns desses compostos está apresentada na Figura 3.1.
Figura 3.1. Principais compostos voláteis encontrados na oleoresina de casca de canela. Fonte: CHEMSPIDER
(2017)
As oleoresinas possuem o sabor, aroma e pungência completos das especiarias frescas ou secas, apresentam maior estabilidade ao calor e resultam em um sabor mais uniforme do que os óleos essenciais (UHL, 2000; VAIDYA et al., 2006). No entanto, elas são susceptíveis à degradação e possuem uma curta vida útil quando não são armazenados adequadamente. Algumas técnicas vêm sendo usadas para superar esse problema e facilitar a aplicação de oleoresinas e óleos essenciais, como a microencapsulação (RIBES et al., 2017, WANG et al., 2014, VAIDYA et al., 2006). A microencapsulação é usada para proteger a substância contra a degradação, promover uma melhor liberação e melhorar sua vida útil.
3.2 Microencapsulação
O processo de encapsulação pode ser definido como um empacotamento, a retenção de uma substância em outra. A substância encapsulada pode ser chamada de material de recheio, agente ativo, fase interna ou fase de carga útil. A substância utilizada como encapsulante pode ser chamada de revestimento, membrana, casca, material de suporte, material da parede, fase externa ou matriz (ZUIDAM; SHIMONI, 2010).
Substâncias encapsuladas possuem diversas aplicações, desde o setor farmacêutico, como também em indústrias química, de alimentos e agrícolas. Dentre os objetivos de utilização do processo de encapsulação, destacam-se (RÉ, 1998):
Proteger uma substância contra a degradação resultante da exposição a fatores ambientais, tais como umidade, oxigênio, calor e luz;
Mascarar sabor indesejável, odor, cor;
Facilitar a manipulação e aplicação;
Permitir a liberação controlada de uma substância no meio de interesse.
A morfologia das partículas varia dependendo do material de parede e técnica utilizada, dividindo-se em duas categorias: microcápsulas e microesferas. As microcápsulas apresentam o núcleo bem definido os e as microesferas são aquelas onde o recheio está disperso na matriz (ZUIDAM ; SHIMONI, 2010). A Figura 3.2 ilustra as diferentes configurações estruturais de sistemas microencapsulados e apresenta como o ingrediente ativo é distribuído na matriz.
Figura 3.2 - Representação esquemática dos sistemas de encapsulação. (A), (B), (C) e (D) – Microcápsulas
(reservatório); (E) – Microesfera (matriz) Fonte: Adaptado de (BAKRY et al., 2016) e (VASISHT, 2014).
Diversas substâncias podem ser utilizadas como materiais de parede, porém, para aplicação em alimentos, esse número se reduz em comparação àqueles utilizados pela indústria farmacêutica (WANDREY; BARTKOWIAK ; HARDING, 2010).
Ao selecionar um agente encapsulante algumas características devem ser consideradas. O material deve apresentar baixa viscosidade, possuir habilidade em dispersar ou emulsionar o material ativo, não apresentar reatividade com a substância encapsulada, ser solúvel em solventes permitidos para o uso na indústria de alimentos e possuir baixo custo (DESAI & PARK, 2005). Encontrar todas essas características em uma única substância é muito difícil, portanto, é comum o uso de blends para conseguir as propriedades adequadas e melhorar a eficiência de encapsulação.
No setor alimentício, os materiais encapsulantes mais utilizados são: carboidratos (amidos, dextrinas, celuloses, gomas e quitosana); proteínas (glúten, caseína, isolado protéico de soro de leite, gelatina e albumina) e lipídios (parafina, cera, ácido esteárico, triestearina, monoglicerídeo, óleos, gordura hidrogenada e diglicerídeos (SERVAT; SPINDOLA; RODRIGUES; FOGLIO, 2010).
A escolha do material encapsulante também depende da técnica a ser utilizada. As técnicas de microencapsulação são variadas e distinguem-se pelo tipo de processo envolvido, podendo ser de natureza química, física ou físico-química. A escolha da técnica baseia-se no tamanho de partícula desejado, aplicação do produto final, propriedades físicas e químicas do recheio e material de parede, mecanismo de liberação de requerido, escala de produção e custo (DESAI; PARK, 2005). A Tabela 3.1 apresenta alguns métodos de encapsulação encontrados.
Tabela 3.1. Técnicas de encapsulação.
Métodos químicos Métodos físicos Métodos físico-químicos
Polimerização interfacial Extrusão Coacervação simples Indução molecular Spray drying Coacervação complexa Polimerização in situ Spray chilling Lipossomas
Freeze-drying Cocristalização
Gelificação iônica
Leito-fluidizado
Fonte: Adaptado de (GIBBS et al., 1999).
A atuação de oleoresinas e/ou óleos essenciais incorporados em alimentos pode melhorar quando adicionados na sua forma encapsulada. A microencapsulação pode aumentar a estabilidade física de suas substâncias ativas, protegendo-as das interações com outros ingredientes alimentares. Além disso, as micropartículas podem conferir maior bioatividade em comparação à oleoresina pura (DONSÌ et al., 2011). Esta característica melhora os mecanismos passivos de absorção celular, permitindo a redução das doses de oleoresina necessárias para garantir a atividade antimicrobiana. Menor concentração de oleoresina minimiza o impacto no aroma e sabor dos alimentos. Gonçalves et al. (2017) concluiu que as micropartículas de óleo essencial de tomilho, obtidas por coacervação complexa, são mais eficazes no controle microbiano do que o óleo essencial puro. Durante et al. (2016) observaram um aumento na estabilidade da oleoresina de tomate, abóbora e farelo de trigo encapsuladas com α-ciclodextrina, pela tecnologia de fluido supercrítico. Khalili et al. (2015) reportaram resultados mostrando maior atividade antimicrobiana para o óleo essencial de tomilho encapsulado em nanogéis formados a partir de quitosana e ácido benzóico.
Para a microencapsulação de óleos essenciais é mais interessante a utilização de técnicas que necessitem de baixas temperaturas de processo, garantindo assim que uma menor quantidade de voláteis será perdida. Apesar de necessitar de altas temperaturas no bico atomizador, o processo de spray chilling permite a utilização de material encapsulante de origem lipídica, compatíveis com o ativo em questão, e baixa temperatura na câmara de atomização.
3.2.1 Spray chilling
Spray chilling ou spray cooling são tecnologias para produção de micropartículas
lipídicas sólidas. A técnica consiste em uma dispersão ou emulsão (contendo o ingrediente ativo e um agente carreador fundido) atomizada numa câmara onde é injetado ar frio ou nitrogênio líquido (Figura 3.3). Sob estas condições, o agente carreador se solidifica imediatamente, formando partículas esféricas (OKURO; MATOS-JR; FAVARO-TRINDADE, 2013).
O agente encapsulante é de natureza lipídica, podendo ser fosfolípidos, triacilgliceróis, ceras, ácidos graxos ou uma mistura destes (GAMBOA; GONÇALVES; GROSSO, 2011). O material ativo pode ser hidrofóbico ou estar presente na forma de cristais, partículas secas ou emulsões do tipo água em óleo (ZUIDAM; SHIMONI, 2010).
De acordo com Gouin (2004), o processo de spray chilling foi comumente utilizado para a encapsulação de uma série de sais orgânicos e inorgânicos, bem como agentes texturizantes, enzimas, aromas e outros ingredientes funcionais. As micropartículas obtidas por spray chilling podem ser aplicadas em produtos de panificação, misturas secas para sopa e alimentos que contenham um elevado nível de gordura (MADENE; JACQUOT; SCHER; DESOBRY, 2006).
.
Atualmente, a técnica de spray chilling vem ganhando atenção considerável por apresentar condições brandas de operação e facilidade de reprodução em larga escala (ALVIM et al., 2013). Além disso, a ausência de solvente durante o processo torna-o mais seguro, eliminando a preocupação com concentrações residuais nas micropartículas (ALBERTINI; PASSERINI; PATTARINO; RODRIGUEZ, 2008).
Entre as desvantagens desse método, existe a possibilidade de expulsão do ativo devido aos rearranjos polimórficos que os lipídios podem apresentar. É necessário um estudo prévio do polimorfismo dos agentes encapsulantes para minimizar esse problema. Além disso, essa técnica possui baixa capacidade de carga comparada a outros métodos, parte do recheio pode ficar retido na superfície da partícula e, no caso de emulsões, uma quantidade significativa de água permanece na partícula (LEONEL et al., 2010; MEHNERT; MADER, 2001; MÜLLER, 2002a, b).
Micropartículas obtidas pela técnica de spray chilling são classificadas como do tipo “matriz”, onde o recheio fica totalmente disperso no material encapsulante. Apresentam, geralmente, superfície esférica e lisa, característica da ausência de evaporação de solvente (OKURO et al., 2013). Apesar de parte do recheio se alocar nas extremidades das partículas, bons resultados de eficiência de encapsulação utilizando esta técnica foram encontrados, como mostra a Tabela 3.2.
Tabela 3.2. Características de micropartículas encapsuladas por spray chilling.
Material de parede Agente ativo Surfactante Tatom(°C) Tcâm (°C) EE (%) Dpartícula (μm) Referência Óleo de soja +
hardfat de soja Ácido gálico Polirricinoleato
de poliglicerol 79 7 54 - 83 24,0 – 36,0 (CONSOLI et al., 2016) Ácido palmítico +
ácido oleico +
gordura de palma Oleoresina de gengibre - 85 7 98 39,0 – 40,8 (ORIANI et al., 2016)
Gordura vegetal Extrato de canela rico em
proantocianidinas - 73 13 87
60,0 – 130,0
(TULINI et al., 2016) Ácido láurico +
ácido oleico Ácido ascórbico
Polirricinoleato
de poliglicerol 51,6-58,4 9,3 ± 0,5 58 - 88 0,3 – 1,0 (SARTORI et al., 2015)
Gordura vegetal Hidrolisado proteico de soja Lecitina de soja, tween 80 e Polirricinoleato de poliglicerol 60 - 80 15 96 53,06 – 68,03 (OLIVEIRA, 2014) Óleo de algodão interesterificado com hardfat de palma + hardfat de soja
α-tocoferol - 65 10 93,45 - (GAMBOA et al., 2011)
As micropartículas lipídicas sólidas (MLS) vem ganhando grande atenção das indústrias farmacêuticas e de cosméticos devido a diversos fatores, tais como: ausência de solvente durante o processamento; facilidade de produção em larga escala; capacidade de proteção a compostos hidrofóbicos e hidrofílicos; liberação gradual do ativo por um maior período de tempo, aplicação em sistemas líquidos e sólidos e ausência de toxicidade, uma vez que o material de parede pode ser constituído de substâncias naturalmente encontradas em alimentos (KATOUZIAN et al., 2017). Sua aplicação no setor alimentício é promissora, visto que são sistemas práticos para carrear compostos lipofílicos, como flavors, podendo aumentar sua estabilidade e biodisponibilidade, bem como facilitar a dispersão dessas substâncias em um produto.
3.2 Lipídios
Lipídios são compostos quimicamente diversos, considerados insolúveis em água, porém, solúveis em solventes orgânicos. Geralmente, são divididos entre óleos (líquidos) e gorduras (sólidos), indicando o estado físico que apresentam à temperatura ambiente. Apresentam-se como importantes nutrientes amplamente empregues como materiais lipofílicos em produtos de confeitaria, manteiga/sorvetes, entre outros e são também um dos principais carreadores utilizados na microencapsulação de substâncias (SERVAT; SPINDOLA; RODRIGUES; FOGLIO, 2010).
Os triacilgliceróis (TAGs) são as estruturas lipídicas mais comumente encontradas em alimentos, denominadas como ésteres de glicerol e ácidos graxos (AG). Seu ponto de fusão depende do tamanho da cadeia, do número de insaturações e da posição dos AG em torno da molécula de glicerol. Uma diversidade de TAGs com diferentes características constituem os óleos e gorduras naturais. Essa composição é que determina as propriedades físicas dos óleos e gorduras, afetando sua estrutura, estabilidade e características sensoriais (MCCLEMENTS; DECKER, 2010).
Em razão do aumento da preocupação do consumidor com a saúde, a segurança alimentar e a ingestão de uma dieta equilibrada, a maneira como as gorduras são disponibilizadas para o setor alimentício vem mudando ao longo dos anos. O aumento de alimentos livre em ácidos graxos trans, baixo teor de gorduras saturadas ou até mesmo o
surgimento de óleos estruturados com apelo nutricional, refletem essa tendência na preocupação com a forma dessas gorduras e suas aplicações (SATO; UENO, 2011).
A hidrogenação de óleos e gorduras para a indústria de alimentos possui dois objetivos principais: aumentar a estabilidade do óleo líquido diminuindo suas insaturações, porém mantendo ainda sua fluidez e, conferir textura a recheios, bolos, sorvetes, etc. através do uso de gorduras sólidas obtidas pela hidrogenação total da matriz lipídica.
A hidrogenação parcial de um óleo vegetal pode conduzir a uma produção elevada de isômeros geométricos e posicionais, ou seja, a matriz lipídica pode apresentar grandes quantidades de ácidos graxos trans (MCCLEMENTS; DECKER, 2010). A hidrogenação catalítica total permite a transformação de óleos líquidos em gorduras completamente saturadas e, portanto, livre em trans. Essa transformação dá origem aos chamados hardfats que possuem elevado ponto de fusão e são uma alternativa de baixo custo para diversas aplicações em sistemas lipídicos (O’BRIEN, 2004; OLIVEIRA; RIBEIRO; KIECKBUSH, 2015).
3.2.1Cristalização e polimorfismo
Óleos e gorduras, quando submetidos a temperaturas abaixo de seu ponto de fusão, se cristalizam. A formação dos cristais é influenciada por diversos fatores, mas, principalmente, pela taxa de resfriamento a qual os lipídios são submetidos a partir de seu estado líquido (RODRIGUES-RACT; COTTING; POLTRONIERI; SILVA; GIOIELLI, 2010).
Durante este processo de cristalização ocorre o empacotamento, onde as unidades individuais de moléculas de triacilglicerol se arranjam entre si formando uma estrutura tridimensional regular (deMAN, 1992; MASCARENHAS, 2015). O crescimento de cristais ocorre quando a matriz lipídica é submetida ao resfriamento e núcleos estáveis se formam na parte líquida (MCCLEMENTS; DECKER, 2010). Esses núcleos são formados a partir de moléculas que, ao colidirem, agregam-se em pequenos aglomerados chamados embriões ou
As propriedades específicas da cristalização das gorduras e dos lipídios podem estar relacionadas ao polimorfismo ou às interações moleculares (SATO, 2001). O polimorfismo é definido como a capacidade de um composto químico formar diferentes formas polimórficas, sendo as formas α, β 'e β típicas em óleos e gorduras, seguindo esta mesma ordem crescente de estabilidade (SATO; UENO, 2011). A estrutura molecular, a composição dos lipídios e as condições de processamento é que vão determinar quais formas polimórficas irão ser formadas (DOUAIRE et al, 2014; MCCLEMENTS; DECKER, 2010). A Figura 3.4 ilustra as três formas polimórficas mais comuns em lipídios.
Figura 3.4. Esquema dos tipos mais comuns de organização molecular de triacilgliceróis. Fonte:
(MCCLEMENTS & DECKER, 2010).
O empacotamento de gorduras sólidas, onde há predominância de ácidos graxos saturados, ocorre de maneira mais organizada. Mas, quando utilizadas como agentes carreadores no processo de microencapsulação, a ausência de insaturações permite maior aproximação das cadeias, diminuindo espaço disponível para o ativo, podendo levar à expulsão do mesmo. Para reverter esse problema, o uso de misturas entre gorduras sólidas e líquidas, incompatíveis espacialmente, é uma alternativa para criação de imperfeições na matriz lipídica, permitindo melhor incorporação e proteção do material ativo (LEONEL et al., 2010).
3.2.2 Óleo e hardfat de palma
A palma ou dendezeiro, como é conhecido no Brasil, é a planta que da origem ao óleo de palma ou azeite de dendê, sendo a Malásia e Indonésia considerados os maiores produtores de óleo de palma do mundo. É possível extrair dois tipos de óleos dessa planta: o óleo de palma, extraído da polpa, e o óleo de palmiste, extraído da amêndoa. A diferença entre eles está na predominância de ácido palmítico e oleico no óleo de palma e maior teor de ácido láurico no óleo de palmiste (LIN, 2002).
Segundo Ghotra, Dyal & Narine (2002), uma das propriedades físicas que torna a gordura de palma interessante para diversas aplicações em alimentos é sua característica semissólida em temperatura ambiente (25°C). Tal característica está relacionada com a composição química de ácidos graxos presentes em uma razão de 50/50 para saturados/insaturados.
A gordura de palma apresenta ponto de fusão variando em uma faixa de 32 a 40 °C e uma variada composição em ácidos graxos (LIN, 2002). A Tabela 3.3 apresenta a composição em ácidos graxos do óleo de palma e suas principais frações.
Tabela 3.3. Composição em ácidos graxos da gordura de palma e suas principais frações.
Composição em ácidos graxos (%)
Ácidos Graxos Óleo de palma Oleína de palma Estearina de palma
C12:0 Láurico 0,10 – 0,40 0,20 – 0,40 0,10 – 0,30 C14:0 Mirístico 1,00 – 1,40 0,90 – 1,20 1,10 – 1,70 C16:0 Palmítico 40,90 – 47,50 36,80 – 43,20 49,80 – 68,10 C18:0 Esteárico 3,80 – 4,80 3,70 – 4,80 3,90 – 5,60 C18:1 Oleico 36,40 – 41,20 39,80 – 44,60 20,40 – 34,40 C18:2 Linoleico 9,20 – 11,60 10,40 – 12,90 5,00 – 8,90 C18:3 Linolênico 0,05 – 0,60 0,10 – 0,60 0,00 – 0,50 C20:0 Araquidônico 0,20 – 0,70 0,30 – 0,50 0,00 – 0,50 Fonte: (Santos, 2014).
O hardfat de palma é uma gordura totalmente hidrogenada obtida a partir do processo de hidrogenação catalítica total do óleo de palma. O processo de hidrogenação elimina os grupos funcionais insaturados através da adição de átomos de hidrogênio e, no caso do óleo de palma, os ácidos oleico, linoleico e linolênico presentes são convertidos completamente nos ácidos saturados correspondentes. O hardfat de palma é, portanto, constituído de ácido palmítico e esteárico (O’BRIEN, 2004).
3.3 Microencapsulação de agentes antimicrobianos naturais
Devido à crescente preocupação com a saúde, consumidores procuram cada vez mais produtos que utilizam métodos naturais de preservação. A utilização de extratos
naturais, tais como óleos essenciais e oleoresinas, como substitutos dos agentes sintéticos está de acordo com essa tendência (LANG; BUCHBAUER, 2011).
Sabe-se que as plantas e especiarias aromáticas apresentam compostos ativos capazes de inibir o crescimento microbiano, podendo atuar como agentes antimicrobianos contra patógenos e deterioradores presentes em alimentos, aumentando a segurança e a vida útil dos produtos alimentares (RIBEIRO-SANTOS et al., 2017).
O cinamaldeído é considerado como o principal agente antimicrobiano presente nos extratos de canela, exibindo capacidade de inibição contra várias bactérias e fungos (JANTAN et al. , 2008; SHAN et al., 2007). Sua atuação se dá através da inibição da atividade de enzimas envolvidas nas vias metabólicas celulares das bactérias (MAYER, 2002). As proantocianidinas são importantes componentes bioativos não-voláteis que contribuem também para as propriedades antibacterianas da canela (SHAN et al., 2007).
Ao serem incorporados aos alimentos, agentes antimicrobianos naturais podem ser submetidos a inativação rápida através da ligação com componentes alimentares, tais como proteínas e lipídios, ou degradação por enzimas proteolíticas, resultando em uma disponibilidade reduzida para atuar contra micro-organismos em matrizes alimentares (CASTRO-ROSAS et al., 2017). A microencapsulação promove a proteção desses compostos impedindo a interação direta com outros ingredientes alimentares. As micropartículas podem ser usadas como veículos de controle da liberação dos compostos biotativos, além de aumentar sua estabilidade física (DONSÌ et al., 2011).
Diferentes trabalhos vêm avaliando a atividade de micropartículas contendo agentes antimicrobianos naturais. Kujur et al (2017) concluíram que a microencapsulação de óleo essencial de Gaultheria procumbens por microgéis de quitosana e ácido cinâmico promoveram uma maior atividade antifúngica em comparação ao óleo essencial livre. Gonçalves et al. (2017) avaliaram o efeito de micropartículas de óleo essencial de tomilho, obtidas por coacervação complexa, na proteção microbiana em produtos de panificação. A microencapsulação favoreceu a atuação do composto ativo. Wu et al. (2015) verificaram que a estabilidade antimicrobiana de filmes a base de gelatina foi aumentada quando incorporados de nanolipossomas contendo óleo essencial de canela. Teixeira et al. (2013) concluíram que nanopartículas de oleoresina de pimenta preta, produzidas por inclusão usando hidroxipropil β-ciclodextrina, promoveram um aumento na inibição de S. Typhimurium.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
Oleoresina de casca de canela (OC) (Cinnamomum zeylanicum & cassia L.), doado pela empresa NATUREX (São Paulo, SP). Óleo de Palma (OP), doado pela empresa AGROPALMA (São Paulo, SP). Gordura de Palma totalmente hidrogenada (hardfat de palma) (HP), doado pela empresa Triângulo Alimentos (Itápolis, SP). Álcool etílico 99,5% PA (Anidrol-produtos para laboratórios); trans-Cinamaldeído e 2-octanol (Sigma Aldrich); Dimetilsulfóxido (DMSO) (Synth).
4.2 Métodos
A figura 4.1 apresenta um diagrama das etapas utilizadas para concretização deste trabalho e que serão explicadas nesta seção.
Figura 4.1. Diagrama das etapas envolvidas na realização desse trabalho. (MPL: micropartículas lipídicas
sólidas)
Caracterização óleo e
hardfat de palma
Seleção mistura lipídica hardfat:óleo de palma
Caracterização oleoresina de casca de canela
Seleção das formulações
Produção das MPL
Caracterização das MPL
4.2.1 Etapa 1: Caracterização dos lipídios carreadores e oleoresina de casca de canela
Nesta etapa do projeto foram avaliados o comportamento térmico das matrizes lipídicas utilizadas como agentes carreadores, o hábito polimórfico, bem como os pontos de fusão de suas misturas a fim de determinar quais formulações se encontravam na faixa de 45-55 °C. Além disso, as gorduras foram caracterizadas quanto ao perfil de ácidos graxos e triacilgliceróis. Nesta etapa foi realizada também a otimização da extração dos compostos voláteis presentes na oleoresina de casca de canela (OC). Uma análise da concentração inibitória mínima (MIC) da oleoresina de canela em relação a bolores e leveduras, e bactérias Gram-negativas foi realizada para determinar a concentração de ativo a ser adicionada na partícula.
4.2.1.1. Caracterização do óleo e hardfat
4.2.1.1.1. Identificação composição de ácidos graxos e triacilgliceróis
O método Ce 1-62, da “American Oil Chemists’ Society” (AOCS -2009) foi utilizado para esterificação das amostras com BF3 (trifluoreto de boro) como reagente. Os
ésteres metílicos de ácidos graxos foram separados de acordo com as normas da "American Oil Chemists' Society" (2009), método Ce 2-66.
Um cromatógrafo gasoso com detector por ionização em chama (FID) equipado com coluna capilar DB-23 Agilent (50 % cianopropil – metilpolissiloxano, com 60 m de comprimento, diâmetro interno de 0,25 mm e espessura do filme de 0,25 μm) foi utilizado nas seguintes condições de operação: fluxo na coluna de 1,00 mL/min e velocidade linear de 24 cm/s. As temperaturas do detector e do injetor foram mantidas em 280 °C e 250 °C, respectivamente. A programação de temperatura na coluna iniciou-se em 110 ºC (mantida por 5 minutos), posteriormente foi aquecida até 215 ºC (5 °C/min) e permanecendo nesta temperatura durante 24 minutos, resultando em um tempo total de corrida de 48 minutos. Hélio foi utilizado como gás de arraste com razão split de 1:50 e volume de amostra injetado de 1µL . A identificação dos compostos presentes nas amostras foi realizada a partir da comparação dos tempos de retenção dos picos com os respectivos padrões para ácidos graxos.
A análise de composição em TAGs foi realizada no mesmo equipamento descrito acima de acordo com o método Ce 5-86 (AOCS, 2009). Uma coluna capilar cromatográfica DB-17HT Agilent Catalog 122-1811 (50% fenil-metilpolisiloxano, com comprimento de 15
m, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,15 μm de espessura de filme) sendo as condições de operação: injeção split, razão de 1:100; temperatura da coluna: 250 ºC, programada até 350 ºC à razão de 5 ºC/min; gás de arraste: hélio, em vazão de 1,0 mL/min; temperatura do injetor: 360 ºC; temperatura do detector: 375 ºC; volume injetado: 1,0 µL; concentração da amostra: 100 mg/5 mL de tetrahidrofurano. A identificação dos TAGs foi realizada através da comparação dos tempos de retenção. A análise foi realizada em duplicata para cada amostra.
4.2.1.1.2. Comportamento térmico
O comportamento térmico das matrizes lipídicas foi determinado por calorimetria diferencial de varredura (DSC) em um calorímetro modelo 2920 (TA Instruments, Pennsylvania, USA) de acordo com o método Cj 1-94 da AOCS (2004). Foram pesadas 5 mg de amostra (carreadores puros e em mistura) em cápsulas de alumínio, hermeticamente seladas. Uma cápsula de alumínio vazia foi utilizada como referência. O seguinte programa de temperatura foi utilizado: estabilização em 25 °C e aumento de temperatura a uma taxa de aquecimento de 10 °C/min até 70 °C. As amostras foram então resfriadas a uma taxa de 10 °C/min até –70 °C. Após 30 minutos de estabilização, as amostras foram novamente aquecidas até 70 °C a uma taxa de 5 °C/min e posteriormente estabilizadas a 25 °C. Os termogramas obtidos foram avaliados utilizando o software Universal Analysis 2000 (TA Instruments).
4.2.1.1.3. Polimorfísmo
As formas polimórficas das amostras de gordura foram determinadas pelo método AOCS (2004) Cj 2-9527. As amostras foram analisadas em um difratômetro de Raios-X (Phillips - modelo X´Pert-MPD
)
utilizando a geometria de Bragg - Bretano (θ:2θ) com radiação Cu-Kα(k=1.5418 Å, tensão de 40 KV e corrente de 30 mA). As medidas foram tomadas com intervalo em ângulo 2θ de 5 a 40°, com tamanho de passos de 0,02° a cada 2 segundos. As formas polimórficas foram identificadas a partir dos short spacings característicos.4.2.1.2. Seleção de mistura lipídica hard fat:gordura de palma
Para a obtenção de partículas fisicamente estáveis através da técnica de spray
chilling é necessário que a matriz lipídica apresente temperatura de fusão superior a 45 °C
ao equipamento e, consequentemente, um maior rendimento de processo. Cinco formulações com diferentes proporções de hardfat:óleo de palma foram avaliadas em relação ao comportamento térmico de fusão de acordo com metodologia descrita no item 4.2.1.1.2. A Tabela 4.1 apresenta a composição de cada uma das formulações.
Tabela 4.1. Composição das misturas lipídicas avaliadas.
Amostra Proporção hardfat:óleo de palma H100P0 100:0 H90P10 90:10 H80P20 80:20 H70P30 70:30 H60P40 60:40
4.2.1.3. Caracterização da oleoresina de casca de canela
4.2.1.3.1. Otimização da extração dos compostos voláteis
Para identificação e extração dos compostos voláteis presentes na oleoresina de casca de canela foi realizada uma otimização através da técnica de microextração em fase sólida (SPME- solid phase microextraction) em headspace (HS) por cromatografia gasosa com espectrometria de massas (CG-EM).
Foram escolhidas três variáveis independentes para a otimização de extração de voláteis: temperatura de extração, tempo de extração e tempo de exposição da fibra. Um planejamento experimental delineado e casualizado foi utilizado como estratégia multivariada e a Tabela 4.2 mostra o intervalo testado de cada parâmetro. Na primeira etapa da otimização, foram utilizadas cinco fibras Supelco (Sigma Aldrich) para avaliar a eficiência de extração de compostos voláteis: 100 µm polidimetilsiloxano (PDMS), 65 µm polidimetilsiloxano/divinilbenzeno (PDMS/DVB), 75 µm carboxen/polidimetilsiloxano
(CAR/PDMS), 85 µm poliacrilato (PA) and 50/30 µm
divinilbenzeno/carboxen/polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS). A OC foi diluída em etanol a uma concentração de 2000 ppm, Cada uma das fibras avaliadas foi exposta ao headspace de
tempo de extração (30 min). O número de picos detectados e a área total de picos foram utilizados para avaliar a eficiência de extração. Cada teste foi feito em duplicata.
Tabela 4.2. Variáveis dependentes utilizadas para planejamento experimental 2³.
Variáveis código -1,68 -1 0 1 1,68 Tempo de condicionamento (min) x1 30 34,05 40 45,95 50 Temperatura do banho (°C) x2 30 36,07 45 53,93 60 Tempo de exposição da fibra (min) x3 10 18,10 30 41,90 50
CG-EM: Um cromatógrafo a gás HP-7890A acoplado a um espectrômetro de massas HP-5975C (CG-EM / Agilent Technologies) foi utilizado para realização do experimento. Uma coluna capilar modelo DBWAX, fase estacionária polietileno glicol (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm) foi utilizada com gás de arraste hélio a 1,5 mL/min. As condições do cromatógrafo foram: temperatura de programação inicial de 50 °C por 2 min, com aumento a uma taxa de 5 °C/min até 220 °C, sendo mantido a esta mesma temperatura por mais 10 min; detector de espectro de massas (EM) com temperatura de 150 °C, com volume de injeção de 1 mL em modo splitless a uma taxa de 1:75 (NIRMALA-MENON et al., 2007; SING et al., 2008).
Para a identificação dos principais compostos voláteis na amostra foi utilizada a base de dados de espectros de massas NIST2012.
4.2.1.3.2. Determinação da concentração inibitória mínima da oleoresina de casca de canela
A determinação da concentração inibitória mínima da oleoresina de casca de canela teve por objetivo encontrar a quantidade de ativo a ser incorporado na partícula para que esta apresente atividade antimicrobiana.
Todas as culturas utilizadas neste estudo foram compradas ou doadas pela ATCC, IAL (Coleção de Cultura de Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil), Instituto de Biologia (IB) da Universidade de Campinas – UNICAMP – Brasil ou do Laboratório de Microbiologia Quantitativa de Alimentos (LMQA) da Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP.
Os micro-organismos selecionados para as análises foram: Salmonella Enteritidis (S 2887),
Salmonella Typhimurium (IAL 2431), Escherichia coli (IAL 2064), Pseudomonas aeruginosa
(IAL 1853), Pseudomonas fluorescens (ATCC 13525), Candida pseudointermedia (LMQA HL264), Torulaspora delbrueckii (LMQA HL64), Zygosaccharomyces rouxii (LMQA HL48), Candida orthopsilosis (LMQA HL189), Candida apícola (LMQA HL134),
Penicillium paneum (LMQA 05) e Penicillium roqueforti (PR 11).
a) Preparação das culturas
As cepas de S. Enteritidis (S 2887), S. Typhimurium (IAL 2431), E. coli (IAL 2064), P. aeruginosa (IAL 1853) e P. fluorescens (ATCC 13525) foram crescidas em caldo nutriente (Kasvi, Itália) incubadas a 37°C durante 24h. O crescimento das cepas de C.
pseudointermedia (LMQA HL264), T. delbrueckii (LMQA HL64), Z. rouxii (LMQA HL48), C. orthopsilosis (LMQA HL189), C. apícola (LMQA HL134) foi realizado em caldo extrato
de malte (Formulado: 20g de Glicose (Vetec Química Fina, Brasil), 20 g de extrato de malte (Kasvi, Itália), 1 g de peptona (Kasvi, Itália) para 1 litro de água destilada) com incubação a 30 ºC durante 48h. Posteriormente, as células de todos os micro-organismos indicados acima foram centrifugadas (3829 g - Sorvall Legend XTR Thermofischer, Waltham, EUA) sob refrigeração (4 °C) durante 10 minutos e lavadas com solução 0,85% de cloreto de sódio (NaCl) três vezes subsequentes. Após o processo de lavagem das células de S. Enteritidis (S 2887), S. Typhimurium (IAL 2431), E. coli (IAL 2064), P. aeruginosa (IAL 1853) e P.
fluorescens (ATCC 13525) foi feito o ajuste de concentração em 0,5 da escala de McFarland
correspondendo a 1,5 x 108 UFC/mL através de um turbidímetro portátil modelo MCF 500 (MS TECNOPON, Brasil). Para as células de C. pseudointermedia (LMQA HL264), T. delbrueckii (LMQA HL64), Z. rouxii (LMQA HL48), C. orthopsilosis (LMQA HL189), C.
apícola (LMQA HL134) a concentração foi determinada pela contagem em Câmara de
Neubauer.
As suspensões de esporos de P. paneum (LMQA 05) e P. roqueforti (PR 11) foram preparadas em placas de petri com Agar dicloran-glicerol (DG18, Neogen, EUA) e incubadas a 25 ± 2 °C durante 7 dias. Em seguida, as suspensões foram lavadas com água estéril com 0,01% (v/v) de Tween 80 (Sigma–Aldrich, EUA) e filtradas com gazes estéreis para a retenção de fragmentos miceliais e de hifas. Após filtração, as suspensões foram centrifugadas (1500 g - Sorvall Legend XTR Thermofischer, Waltham, EUA) sob refrigeração (4 °C) durante 15 minutos e lavadas com água destilada estéril três vezes
subsequentes (SILVA et al., 2010; SANTOS, 2015). Após o processo de purificação da suspensão de esporos das espécies P. paneum (LMQA-JL002) e P. roqueforti (PR 11) a concentração foi determinada pela contagem em Câmara de Neubauer e plaqueamento em superfície em Agar Dicloran-Glicerol (DG18, Neogen, EUA) para contagem das colônias e confirmação da concentração das suspensões de esporos (PITT; HOCKING, 2009).
b) Concentração inibitória mínima (MIC)
Para determinação da concentração mínima inibitória (MIC) da oleoresina de casca de canela, realizou-se o método de diluição de acordo com Siddiqi et al.(2010), com alterações. A solução estoque de oleoresina pura foi padronizada em 25% (23,73 g/mL) com dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma–Aldrich, EUA). Em seguida, as diluições foram realizadas para obter 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 0.20, 0.10, 0.05, 0.02, 0.01, 0.006 e 0.003% (v/v) com os meios de cultivo adequado para cada micro-organismo, respectivamente. Utilizando uma placa estéril de 96 poços, para cada poço foi transferida uma alíquota de 100 μL de cada micro-organismo testado (105 UFC/mL). Em seguida, as placas foram separadas por temperatura de incubação: S. Enteritidis (S 2887), S. Typhimurium (IAL 2431), E. coli (IAL 2064), P. aeruginosa (IAL 1853) e P. fluorescens (ATCC 13525) foram incubadas a 37°C durante 24h; C. pseudointermedia (LMQA HL264), T. delbrueckii (LMQA HL64), Z. rouxii (LMQA HL48), C. orthopsilosis (LMQA HL189) e C. apícola (LMQA HL134) foram incubadas a 30 °C durante 48h e, finalmente, P. paneum (LMQA 05) e P. roqueforti (PR 11) foram incubados a 25 °C durante 5 dias. Após o período de incubação de cada grupo de micro-organismo as placas foram avaliadas macroscopicamente e o MIC foi determinado pela menor concentração capaz de inibir o crescimento visível dos micro-organismos testados.
4.2.2 Etapa 2: Produção e caracterização das micropartículas lipídicas carreadoras de oleoresina de casca de canela
4.2.2.1 Produção das micropartículas lipídicas sólidas
As micropartículas foram produzidas de acordo com as etapas apresentadas na Figura 4.2. O equipamento utilizado foi o spray chilling (mini Spray Dryer Büchi-291) de escala laboratorial, conforme apresentado na Figura 4.3. Os principais componentes do equipamento são um bico atomizador modelo duplo-fluido, diâmetro de bico de 0,7 mm, uma bomba peristáltica, uma câmara cilíndrica dentro da qual a amostra é atomizada, um ciclone
que separa o ar de exaustão das partículas, um filtro externo, um aspirador que impulsiona o ar no sistema e um desumidificador para resfriamento do ar da câmara.
Figura 4.2. Etapas para a produção das micropartículas lipídicas.
Figura 4.3. Equipamento no modo spray chilling (mini Spray Dryer Buchi – 291).
As matrizes lipídicas foram pesadas e posteriormente fundidas a 85 °C. Após a completa fusão dos materiais de parede, a oleoresina de casca de canela foi adicionada e homogeneizada utilizando um agitador magnético. A mistura foi então bombeada utilizando uma bomba peristáltica (0,6 kg/h) e pulverizada dentro da câmara resfriada através de um bico atomizador duplo-fluido (0,7 mm diâmetro), mantido a 85 °C. O sistema de aspiração do
Caracterização das Micropartículas Lipídicas
(Polimorfismo, Tamanho, Morfologia, Retenção dos voláteis)
Atomização
(spray chilling)
Homogeneização e agitação (Agitador magnético)
Incorporação da oleoresina à matriz lipídica Fusão da matriz lipídica a 85 °C
(Estufa)
