4. MATERIAL E MÉTODOS
4.2 Métodos
4.2.1 Etapa 1: Caracterização dos lipídios carreadores e oleoresina de casca de canela
Nesta etapa do projeto foram avaliados o comportamento térmico das matrizes lipídicas utilizadas como agentes carreadores, o hábito polimórfico, bem como os pontos de fusão de suas misturas a fim de determinar quais formulações se encontravam na faixa de 45- 55 °C. Além disso, as gorduras foram caracterizadas quanto ao perfil de ácidos graxos e triacilgliceróis. Nesta etapa foi realizada também a otimização da extração dos compostos voláteis presentes na oleoresina de casca de canela (OC). Uma análise da concentração inibitória mínima (MIC) da oleoresina de canela em relação a bolores e leveduras, e bactérias Gram-negativas foi realizada para determinar a concentração de ativo a ser adicionada na partícula.
4.2.1.1. Caracterização do óleo e hardfat
4.2.1.1.1. Identificação composição de ácidos graxos e triacilgliceróis
O método Ce 1-62, da “American Oil Chemists’ Society” (AOCS -2009) foi utilizado para esterificação das amostras com BF3 (trifluoreto de boro) como reagente. Os
ésteres metílicos de ácidos graxos foram separados de acordo com as normas da "American Oil Chemists' Society" (2009), método Ce 2-66.
Um cromatógrafo gasoso com detector por ionização em chama (FID) equipado com coluna capilar DB-23 Agilent (50 % cianopropil – metilpolissiloxano, com 60 m de comprimento, diâmetro interno de 0,25 mm e espessura do filme de 0,25 μm) foi utilizado nas seguintes condições de operação: fluxo na coluna de 1,00 mL/min e velocidade linear de 24 cm/s. As temperaturas do detector e do injetor foram mantidas em 280 °C e 250 °C, respectivamente. A programação de temperatura na coluna iniciou-se em 110 ºC (mantida por 5 minutos), posteriormente foi aquecida até 215 ºC (5 °C/min) e permanecendo nesta temperatura durante 24 minutos, resultando em um tempo total de corrida de 48 minutos. Hélio foi utilizado como gás de arraste com razão split de 1:50 e volume de amostra injetado de 1µL . A identificação dos compostos presentes nas amostras foi realizada a partir da comparação dos tempos de retenção dos picos com os respectivos padrões para ácidos graxos.
A análise de composição em TAGs foi realizada no mesmo equipamento descrito acima de acordo com o método Ce 5-86 (AOCS, 2009). Uma coluna capilar cromatográfica DB-17HT Agilent Catalog 122-1811 (50% fenil-metilpolisiloxano, com comprimento de 15
m, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,15 μm de espessura de filme) sendo as condições de operação: injeção split, razão de 1:100; temperatura da coluna: 250 ºC, programada até 350 ºC à razão de 5 ºC/min; gás de arraste: hélio, em vazão de 1,0 mL/min; temperatura do injetor: 360 ºC; temperatura do detector: 375 ºC; volume injetado: 1,0 µL; concentração da amostra: 100 mg/5 mL de tetrahidrofurano. A identificação dos TAGs foi realizada através da comparação dos tempos de retenção. A análise foi realizada em duplicata para cada amostra.
4.2.1.1.2. Comportamento térmico
O comportamento térmico das matrizes lipídicas foi determinado por calorimetria diferencial de varredura (DSC) em um calorímetro modelo 2920 (TA Instruments, Pennsylvania, USA) de acordo com o método Cj 1-94 da AOCS (2004). Foram pesadas 5 mg de amostra (carreadores puros e em mistura) em cápsulas de alumínio, hermeticamente seladas. Uma cápsula de alumínio vazia foi utilizada como referência. O seguinte programa de temperatura foi utilizado: estabilização em 25 °C e aumento de temperatura a uma taxa de aquecimento de 10 °C/min até 70 °C. As amostras foram então resfriadas a uma taxa de 10 °C/min até –70 °C. Após 30 minutos de estabilização, as amostras foram novamente aquecidas até 70 °C a uma taxa de 5 °C/min e posteriormente estabilizadas a 25 °C. Os termogramas obtidos foram avaliados utilizando o software Universal Analysis 2000 (TA Instruments).
4.2.1.1.3. Polimorfísmo
As formas polimórficas das amostras de gordura foram determinadas pelo método AOCS (2004) Cj 2-9527. As amostras foram analisadas em um difratômetro de Raios-X (Phillips - modelo X´Pert-MPD
)
utilizando a geometria de Bragg - Bretano (θ:2θ) com radiação Cu-Kα(k=1.5418 Å, tensão de 40 KV e corrente de 30 mA). As medidas foram tomadas com intervalo em ângulo 2θ de 5 a 40°, com tamanho de passos de 0,02° a cada 2 segundos. As formas polimórficas foram identificadas a partir dos short spacings característicos.4.2.1.2. Seleção de mistura lipídica hard fat:gordura de palma
Para a obtenção de partículas fisicamente estáveis através da técnica de spray
chilling é necessário que a matriz lipídica apresente temperatura de fusão superior a 45 °C
ao equipamento e, consequentemente, um maior rendimento de processo. Cinco formulações com diferentes proporções de hardfat:óleo de palma foram avaliadas em relação ao comportamento térmico de fusão de acordo com metodologia descrita no item 4.2.1.1.2. A Tabela 4.1 apresenta a composição de cada uma das formulações.
Tabela 4.1. Composição das misturas lipídicas avaliadas.
Amostra Proporção hardfat:óleo de palma H100P0 100:0 H90P10 90:10 H80P20 80:20 H70P30 70:30 H60P40 60:40
4.2.1.3. Caracterização da oleoresina de casca de canela
4.2.1.3.1. Otimização da extração dos compostos voláteis
Para identificação e extração dos compostos voláteis presentes na oleoresina de casca de canela foi realizada uma otimização através da técnica de microextração em fase sólida (SPME- solid phase microextraction) em headspace (HS) por cromatografia gasosa com espectrometria de massas (CG-EM).
Foram escolhidas três variáveis independentes para a otimização de extração de voláteis: temperatura de extração, tempo de extração e tempo de exposição da fibra. Um planejamento experimental delineado e casualizado foi utilizado como estratégia multivariada e a Tabela 4.2 mostra o intervalo testado de cada parâmetro. Na primeira etapa da otimização, foram utilizadas cinco fibras Supelco (Sigma Aldrich) para avaliar a eficiência de extração de compostos voláteis: 100 µm polidimetilsiloxano (PDMS), 65 µm polidimetilsiloxano/divinilbenzeno (PDMS/DVB), 75 µm carboxen/polidimetilsiloxano
(CAR/PDMS), 85 µm poliacrilato (PA) and 50/30 µm
divinilbenzeno/carboxen/polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS). A OC foi diluída em etanol a uma concentração de 2000 ppm, Cada uma das fibras avaliadas foi exposta ao headspace de
tempo de extração (30 min). O número de picos detectados e a área total de picos foram utilizados para avaliar a eficiência de extração. Cada teste foi feito em duplicata.
Tabela 4.2. Variáveis dependentes utilizadas para planejamento experimental 2³.
Variáveis código -1,68 -1 0 1 1,68 Tempo de condicionamento (min) x1 30 34,05 40 45,95 50 Temperatura do banho (°C) x2 30 36,07 45 53,93 60 Tempo de exposição da fibra (min) x3 10 18,10 30 41,90 50
CG-EM: Um cromatógrafo a gás HP-7890A acoplado a um espectrômetro de massas HP-5975C (CG-EM / Agilent Technologies) foi utilizado para realização do experimento. Uma coluna capilar modelo DBWAX, fase estacionária polietileno glicol (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm) foi utilizada com gás de arraste hélio a 1,5 mL/min. As condições do cromatógrafo foram: temperatura de programação inicial de 50 °C por 2 min, com aumento a uma taxa de 5 °C/min até 220 °C, sendo mantido a esta mesma temperatura por mais 10 min; detector de espectro de massas (EM) com temperatura de 150 °C, com volume de injeção de 1 mL em modo splitless a uma taxa de 1:75 (NIRMALA-MENON et al., 2007; SING et al., 2008).
Para a identificação dos principais compostos voláteis na amostra foi utilizada a base de dados de espectros de massas NIST2012.
4.2.1.3.2. Determinação da concentração inibitória mínima da oleoresina de casca de canela
A determinação da concentração inibitória mínima da oleoresina de casca de canela teve por objetivo encontrar a quantidade de ativo a ser incorporado na partícula para que esta apresente atividade antimicrobiana.
Todas as culturas utilizadas neste estudo foram compradas ou doadas pela ATCC, IAL (Coleção de Cultura de Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil), Instituto de Biologia (IB) da Universidade de Campinas – UNICAMP – Brasil ou do Laboratório de Microbiologia Quantitativa de Alimentos (LMQA) da Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP.
Os micro-organismos selecionados para as análises foram: Salmonella Enteritidis (S 2887),
Salmonella Typhimurium (IAL 2431), Escherichia coli (IAL 2064), Pseudomonas aeruginosa
(IAL 1853), Pseudomonas fluorescens (ATCC 13525), Candida pseudointermedia (LMQA HL264), Torulaspora delbrueckii (LMQA HL64), Zygosaccharomyces rouxii (LMQA HL48), Candida orthopsilosis (LMQA HL189), Candida apícola (LMQA HL134),
Penicillium paneum (LMQA 05) e Penicillium roqueforti (PR 11).
a) Preparação das culturas
As cepas de S. Enteritidis (S 2887), S. Typhimurium (IAL 2431), E. coli (IAL 2064), P. aeruginosa (IAL 1853) e P. fluorescens (ATCC 13525) foram crescidas em caldo nutriente (Kasvi, Itália) incubadas a 37°C durante 24h. O crescimento das cepas de C.
pseudointermedia (LMQA HL264), T. delbrueckii (LMQA HL64), Z. rouxii (LMQA HL48), C. orthopsilosis (LMQA HL189), C. apícola (LMQA HL134) foi realizado em caldo extrato
de malte (Formulado: 20g de Glicose (Vetec Química Fina, Brasil), 20 g de extrato de malte (Kasvi, Itália), 1 g de peptona (Kasvi, Itália) para 1 litro de água destilada) com incubação a 30 ºC durante 48h. Posteriormente, as células de todos os micro-organismos indicados acima foram centrifugadas (3829 g - Sorvall Legend XTR Thermofischer, Waltham, EUA) sob refrigeração (4 °C) durante 10 minutos e lavadas com solução 0,85% de cloreto de sódio (NaCl) três vezes subsequentes. Após o processo de lavagem das células de S. Enteritidis (S 2887), S. Typhimurium (IAL 2431), E. coli (IAL 2064), P. aeruginosa (IAL 1853) e P.
fluorescens (ATCC 13525) foi feito o ajuste de concentração em 0,5 da escala de McFarland
correspondendo a 1,5 x 108 UFC/mL através de um turbidímetro portátil modelo MCF 500 (MS TECNOPON, Brasil). Para as células de C. pseudointermedia (LMQA HL264), T. delbrueckii (LMQA HL64), Z. rouxii (LMQA HL48), C. orthopsilosis (LMQA HL189), C.
apícola (LMQA HL134) a concentração foi determinada pela contagem em Câmara de
Neubauer.
As suspensões de esporos de P. paneum (LMQA 05) e P. roqueforti (PR 11) foram preparadas em placas de petri com Agar dicloran-glicerol (DG18, Neogen, EUA) e incubadas a 25 ± 2 °C durante 7 dias. Em seguida, as suspensões foram lavadas com água estéril com 0,01% (v/v) de Tween 80 (Sigma–Aldrich, EUA) e filtradas com gazes estéreis para a retenção de fragmentos miceliais e de hifas. Após filtração, as suspensões foram centrifugadas (1500 g - Sorvall Legend XTR Thermofischer, Waltham, EUA) sob refrigeração (4 °C) durante 15 minutos e lavadas com água destilada estéril três vezes
subsequentes (SILVA et al., 2010; SANTOS, 2015). Após o processo de purificação da suspensão de esporos das espécies P. paneum (LMQA-JL002) e P. roqueforti (PR 11) a concentração foi determinada pela contagem em Câmara de Neubauer e plaqueamento em superfície em Agar Dicloran-Glicerol (DG18, Neogen, EUA) para contagem das colônias e confirmação da concentração das suspensões de esporos (PITT; HOCKING, 2009).
b) Concentração inibitória mínima (MIC)
Para determinação da concentração mínima inibitória (MIC) da oleoresina de casca de canela, realizou-se o método de diluição de acordo com Siddiqi et al.(2010), com alterações. A solução estoque de oleoresina pura foi padronizada em 25% (23,73 g/mL) com dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma–Aldrich, EUA). Em seguida, as diluições foram realizadas para obter 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 0.20, 0.10, 0.05, 0.02, 0.01, 0.006 e 0.003% (v/v) com os meios de cultivo adequado para cada micro-organismo, respectivamente. Utilizando uma placa estéril de 96 poços, para cada poço foi transferida uma alíquota de 100 μL de cada micro-organismo testado (105 UFC/mL). Em seguida, as placas foram separadas por temperatura de incubação: S. Enteritidis (S 2887), S. Typhimurium (IAL 2431), E. coli (IAL 2064), P. aeruginosa (IAL 1853) e P. fluorescens (ATCC 13525) foram incubadas a 37°C durante 24h; C. pseudointermedia (LMQA HL264), T. delbrueckii (LMQA HL64), Z. rouxii (LMQA HL48), C. orthopsilosis (LMQA HL189) e C. apícola (LMQA HL134) foram incubadas a 30 °C durante 48h e, finalmente, P. paneum (LMQA 05) e P. roqueforti (PR 11) foram incubados a 25 °C durante 5 dias. Após o período de incubação de cada grupo de micro-organismo as placas foram avaliadas macroscopicamente e o MIC foi determinado pela menor concentração capaz de inibir o crescimento visível dos micro-organismos testados.
4.2.2 Etapa 2: Produção e caracterização das micropartículas lipídicas