Caracterização da oleoresina de casca de canela

5.1.3.1 Otimização da extração e identificação dos compostos voláteis da oleoresina de casca de canela

A microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME) é um método comum e eficaz utilizado para a extração e caracterização dos compostos voláteis em amostras de alimentos. Alguns fatores podem interferir nos resultados, tais como: tipo de fibra, temperatura de extração, tempo de extração e tempo de exposição da fibra (Yu et al., 2008). Esta técnica, em combinação com um cromatógrafo a gás com espectrometria de massa (GC- MS), vem sendo utilizada para a análise quantitativa e qualitativa de compostos voláteis em diferentes matrizes de alimentos, como as bebidas (Zhang e Zhang, 2008; Ye et al., 2012; Arisseto et al. 2013; Ma et al 2017), frutas (Verzera et al. 2011; Vandendriessche e Nicolai

2013; Mesquita et al., 2017) entre outras como massas e molhos (Mariani et al., 2014; Feng et al., 2017).

Não foram encontrados na literatura trabalhos que tenham utilizado esta técnica para caracterização do perfil aromático de oleoresina de casca de canela. Echegoyen & Nerín (2015) acompanharam a liberação dos compostos voláteis de óleo essencial de canela presentes em embalagens ativas através da técnica de HS-SPME. Eles utilizaram 5 minutos para o condicionamento a uma temperatura de 40°C, 5 minutos para exposição da fibra e 2 minutos de dessorção no equipamento. Testes realizados anteriormente pelo grupo de pesquisa para outros tipos de oleoresina e óleo essencial utilizaram tempos maiores de análise. Sendo assim, optou-se por realizar um planejamento experimental de 3 fatores com o objetivo de encontrar as melhores condições para extração dos compostos voláteis da oleoresina de casca de canela.

O tipo de coluna utilizada nas análises foi o primeiro parâmetro a ser avaliado neste estudo. A escolha baseou-se na afinidade dos compostos presentes na oleoresina de casca de canela. Testes preliminares mostraram que mais compostos foram identificados usando a coluna DBWAX em comparação com a HP-5MS.

O tipo de revestimento da fibra utilizada na extração dos compostos voláteis que apresentou maior afinidade pelos componentes da oleoresina foi o segundo parâmetro a ser avaliado, através de um método univariado. Analisando a Figura 5.6 (a) e (b), percebemos que a fibra recoberta com polidimetilsiloxano/dininilbenzeno (PDMS/DVB) detectou o maior número de picos, mas uma área total baixa. Os dois melhores resultados foram obtidos com as fibras revestidas por carboxen/polidimetilsiloxano/dimetilbenzeno (CAR/PDMS/DVB) e poliacrilato (PA). Embora a fibra CAR/PDMS/DVB tenha apresentado maior área total e número de picos detectados do que PA, esta segunda apresentou uma melhor representatividade dos compostos majoritários, como mostrado na Figura 5.7. A soma de Cinamaldeído (Cn), O-metoxi-cinamaldeído (OmCn) e Cumarina (Co) representaram 94,2 e 89,4% da área total detectada por PA e CAR/PDMS/DVB, respectivamente. Em vista disso, a fibra PA foi escolhida para dar continuidade aos ensaios de otimização. Mesquita et al. (2017) realizaram o mesmo procedimento na seleção da melhor fibra para extração dos compostos voláteis presentes em cultivares de Pitanga (Eugenia uniflora L.).

Figura 5.6. Influência do tipo de revestimento das fibras na eficiência de extração de compostos voláteis da

oleoresina de canela pela técnica de HS-SPME, considerando: (a) número de picos e (b) área total dos picos. PA – poliacrilato; DVB – divinilbenzeno; CAR – carboxen; PDMS – polidimetilsiloxano.

Figura 5.7. Representatividade dos compostos majoritários em cada fibra. PA – poliacrilato; DVB –

divinilbenzeno; CAR – carboxen; PDMS – polidimetilsiloxano.

Depois de selecionar a melhor fibra, um planejamento experimental 2³ foi utilizado para avaliar a influência de três variáveis independentes: Tempo de condicionamento (X1), Temperatura de condicionamento (X2) e Tempo de exposição da fibra (X3).

A eficiência de extração dos compostos voláteis pode ser influenciada por diversos fatores: tempo de condicionamento, tempo de exposição da fibra, presença de sal, volume de amostra, entre outros. Esses fatores podem ser avaliados em experimentos univariados, onde as condições de cada variável são testadas separadamente, ou em

experimentos multivariados, onde todas as variáveis são testadas simultaneamente e os efeitos das interações entre elas podem ser também estudados.

A escolha de uma estratégia multivariada nesse estudo teve por objetivo avaliar o efeito das condições experimentais em conjunto. A área total dos cromatogramas e a porcentagem de cinamaldeído detectado em cada um deles foram as respostas escolhidas para avaliar a influência de cada uma das variáveis testadas.

Analisando primeiramente a área total, ao nível de 5% de significância (p< 0,05), apenas a temperatura de condicionamento foi estatisticamente significativa com p-valor de 0,0004. O aumento da temperatura ocasionou uma maior área total detectada provocando então em um efeito positivo. Tal efeito pode ser explicado justamente pela alta volatilidade dos compostos presentes na oleoresina, onde temperaturas mais elevadas favorecem a liberação desses compostos para o headspace. Os resultados obtidos podem ser observados na Tabela 5.7.

Tabela 5.7. Coeficientes de regressão para a resposta Área Total (a.u).

Através da análise de variância (ANOVA) podemos avaliar se o modelo se ajusta bem aos dados. Para isso, Fcalculado(Fcalc) deve ser maior que o Ftabelado(Ftab) e o coeficiente de

regressão satisfatório. A ANOVA, apresentada na Tabela 5.8, mostra que ambas as condições foram obedecidas. Para gerar uma superfície de resposta são necessários no mínimo dois

Estimativas por Intervalo (95%)

Efeito Erro

Padrão p-valor Limite Inferior Limite Superior

Média 1,02E+10 3,23E+09 0,0160 2,56E+09 1,78E+10 X1 (L) 7,85E+08 3,03E+09 0,8034 -6,39E+09 7,96E+09 X1 (Q) 3,16E+09 3,34E+09 0,3754 -4,73E+09 1,11E+10 X2 (L) 1,89E+10 3,03E+09 0,0004 1,18E+10 2,61E+10 X2 (Q) 3,27E+09 3,34E+09 0,3605 -4,63E+09 1,12E+10 X3 (L) 4,46E+08 3,03E+09 0,8872 -6,73E+09 7,62E+09 X3 (Q) -1,03E+09 3,34E+09 0,7666 -8,92E+09 6,86E+09 X1X2 8,47E+08 3,96E+09 0,8369 -8,52E+09 1,02E+10 X1X3 2,24E+09 3,96E+09 0,5892 -7,13E+09 1,16E+10 X2X3 -7,36E+08 3,96E+09 0,8580 -1,01E+10 8,64E+09

fatores significativos. Como apenas uma das variáveis avaliadas apresentou esse efeito, somente o gráfico de Pareto foi gerado (Figura 5.8).

Tabela 5.8 ANOVA para a resposta Área Total.

Fonte variação Soma de

quadrados

Graus de liberdade

Quadrado

médio Fcalc p-valor

Regressão 1,30E+21 9 1,45E+20 4,61 0,0282

Resíduos 2,20E+20 7 3,14E+19 - -

Falta de Ajuste 2,02E+20 5 4,04E+19 4,50 0,1917

Erro Puro 1,79E+19 2 8,97E+18 - -

Total 1,52E+21 16 - - -

R² = 0,86; Ftabelado = 3,39.

Figura 5.8. Gráfico de Pareto.

O aumento da área total provocado pelo aumento da temperatura de condicionamento foi acompanhado de um maior número de compostos detectados. Porém, muitos desses compostos eram provenientes da fibra e não fazem parte dos componentes da oleoresina, ocasionando cromatogramas mais poluídos.

Para tentar alcançar uma superfície de resposta com as condições otimizadas, outro planejamento estratégico com tempos menores para as variáveis que não foram significativas foi realizado, fixando a temperatura em 54°C. Porém, ambas continuaram não

sendo significativas e a ANOVA mostrou resultados insatisfatórios, indicando que esse novo modelo não se ajustou bem aos dados. Sendo assim, optou-se por selecionar a temperatura de condicionamento que ofereceu uma maior área total e porcentagem dos compostos majoritários no planejamento demonstrado acima, sendo esta 53,93°C. As outras variáveis foram mantidas em seus limites inferiores: 30 min de condicionamento e 10 min de exposição da fibra. As condições otimizadas estão apresentadas na Tabela 5.9. A utilização da estratégia de otimização fez com que fossem diminuídos 20 minutos do tempo inicial de análise.

Tabela 5.9. Condições ótimas para extração e identificação dos compostos voláteis.

Variável Condição otimizada

Temperatura de condicionamento 54 °C Tempo de condicionamento 30 min Tempo de exposição da fibra 10 min

A Figura 5.9 apresenta o cromatograma obtido, com as condições ótimas, para a oleoresina de casca de canela. Notam-se 4 picos de maior intensidade, representando os compostos majoritários. Na Tabela 5.10 estão identificados os compostos voláteis presentes na amostra de oleoresina de casca de canela.

Tabela 5.10. Identificação dos compostos voláteis da oleoresina de canela.

Número

Composto Tempo de Retenção

(min) Área relativa (%) 1 α-Copaeno 15,27 0,27 2 Cariofileno 17,79 0,11 3 γ-Muuroleno 19,92 0,12 4 α-Muuroleno 20,73 0,30 5 δ-Cadineno 21,46 0,58 6 Hidroxi-cinamaldeído 21,91 0,48 7 Cassia aldeído 24,38 0,34 8 Álcool feniletílico 24,81 0,92 9 O-Anisaldeído 25,77 0,69 10 (E)-Cinamaldeído 27,81 74,73 11 Éster cinâmico 29,49 3,19 12 Eugenol 20,72 0,05 13 O-Metoxi-Cinamaldeído 34,61 7,85 14 Cumarina 34,77 4,68 15 Ácido hidrocinâmico 37,65 0,05 Total 94,36

Através da otimização da técnica de microextração em fase sólida por headspace foi possível identificar 94,36 % dos compostos voláteis presentes na oleoresina de casca de canela. A composição da oleoresina de casca de canela pode variar dependendo da região de cultivo, clima ou de qual parte da planta foi extraído o óleo essencial. Além disso, o método utilizado na identificação dos componentes também pode influenciar os resultados. Normalmente, óleos essenciais provenientes da casca da canela apresentam o cinamaldeído como composto majoritário. O mesmo foi identificado por Echegoyen e Nerín (2015) que avaliaram o efeito de embalagens ativas contendo óleo essencial de canela na qualidade de cogumelos.

5.1.3.2 Determinação da concentração inibitória mínima da oleoresina de casca de canela

A avaliação da concentração inibitória mínima (MIC) da oleoresina de casca de canela contra bolores, leveduras e bactérias gram-negativas teve como objetivo definir a

quantidade mínima de ativo a ser adicionado na partícula, para que essa tivesse ação antimicrobiana. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 5.11.

Tabela 5.11. Concentração inibitória mínima (MIC) da oleoresina de canela.

Micro-organismo (105 UFC/mL) MIC (% v/v) MIC (mg/mL) Gram - n egativas S. Enteritidis 0,05 11,58 S. Typhimurium 0,10 23,17 E. coli 0,05 11,58 P. aeruginosa 0,10 23,17 P. fluorescens 0,10 23,17 B olore s e le ve d u ras Candida pseudointermedia 0,02 _5,79 Torulaspora delbrueckii 0,02 _5,79 Zygosaccharomyces rouxii 0,01 _2,90 Candida orthopsilosis 0,01 _2,90 Candida apícola 0,01 _2,90 Penicilium roqueforti 0,05 _11,58 Penicilium paneum 0,05 _11,58

A concentração inibitória mínima (MIC) é citada pela maioria dos pesquisadores como uma medida do desempenho antibacteriano de óleos essenciais e oleoresinas. Porém, os resultados são apresentados de maneiras bem diferentes por distintos autores, o que acaba dificultando a comparação entre os estudos. Em alguns trabalhos, os resultados são apresentados como concentração bactericida mínima (MBC), termo que pode ser considerado como sinônimo para MIC (BURT, 2004).

A atividade antimicrobiana de óleos essenciais e oleoresinas é atribuída à mistura complexa de compostos que apresentam, sendo os compostos fenólicos considerados como os de maior importância (COSENTINO et al., 1999). A oleoresina de casca de canela é composta principalmente de cinamaldeído, o qual apresenta compostos fenólicos em sua estrutura.

Através dos resultados de MIC para a OC livre, nota-se que ela apresentou um bom desempenho na inibição do crescimento microbiano. Foram testadas cinco cepas de bactérias Gram-negativas, S. Enteritidis, S. Typhimurium, E. coli, P. aeruginosa e P.

fluorescens; cinco leveduras, Candida pseudointermedia, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces rouxii, Candida orthopsilosis e Candida apícola e dois bolores, Penicilium roqueforti and Penicilium paneum. O objetivo foi testar, dentre as culturas

disponíveis no laboratório, uma maior variedade de micro-organismos contaminantes em alimentos.

As bactérias Gram-negativas apresentaram-se mais resistentes à oleoresina que os bolores e leveduras. Tal resultado pode ser explicado devido à membrana fosfolipídica externa que apresentam, a qual transporta os componentes estruturais de lipopolissacarídeos (BURT, 2004). S. Typhimurium, P. aeruginosa and P. fluorescens apresentaram os maiores valores de MIC enquanto Zygosaccharomyces rouxii, Candida orthopsilosis e Candida

apícola foram os microrganismos mais sensíveis.

Para obtenção dos resultados em mg/mL as concentrações obtidas em porcentagem foram multiplizadas pela densidade da oleoresina de casca de canela, assim como descrito por Andrade et al. (2014). Esses mesmos autores avaliaram a atividade antimicrobiana de óleos essenciais contra S. aureus, E. coli e P. aeruginosa. A concentração inibitória mínima obtida para o óleo essencial de canela (25 mg/mL) contra P. aeruginosa foi semelhante à MIC de oleoresina de canela avaliada nesse estudo. Em relação ao microrganismo E. coli, o óleo essencial apresentou-se mais eficaz, com MIC de 2 mg/mL.

De acordo com Burt (2004), a característica hidrofóbica dos compostos voláteis presentes em óleos essenciais e oleoresinas permite que eles se infiltrem entre os lipídios constituintes da membrana celular bacteriana e das mitocôndrias, perturbando a estrutura e tornando-as mais permeáveis.

A partir dos resultados, foi observado que com uma concentração de cerca de 0,1 % (v/v) da oleoresina de casca de canela inibe o crescimento de todos os microrganismos testados. É de interesse desse estudo que, posteriormente, essas partículas possam ser adicionadas em coberturas ou filmes comestíveis para promover a proteção do alimento sem que haja grande alteração de sabor do mesmo. Para isso, seria necessário a utilização de uma quantidade de partícula de baixa concentração de OC, mas que proporcione uma maior superfície de contato com o alimento, permitindo maior uniformidade na liberação do ativo. Considerando que pode haver perda de voláteis ao longo do processo, optou-se então por avaliar concentrações de 1 e 2% de oleoresina de casca de canela para a produção das MLS, obtendo as quantidades de 0,01 e 0,02 g de OC/g de partícula, respectivamente.

5.2 Etapa 2: Produção e caracterização das micropartículas lipídicas sólidas (MLS)