Avaliação da bateria de microssatélites utilizados

Neste trabalho pretendeu-se desenvolver e optimizar um painel de microssatélites que possa, de forma simples, precisa e eficaz, ser utilizado em estudos de diversidade genética na espécie suína.

Assim sendo, utilizou-se um protocolo de preparação das amostras e extracção de DNA (Kawasaky, 1990) muito simples e que não necessita de purificação do DNA presente nas amostras de sangue.

Para além disso, seguindo-se as recomendações da FAO/ISAG, pretendeu-se agrupar e simplificar as reacções de amplificação (multiplex) e leitura dos marcadores para que se consiga um maior rendimento do trabalho de caracterização genética.

No final do trabalho laboratorial descartaram-se os marcadores CGA e S0386, dada a dificuldade de amplificação e respectiva leitura para não se correr o risco de chegar a conclusões erradas no conjunto análise. Também Laval et al. (2000) referem a

dificuldade de utilização do marcador S0386 e da dificuldade de amplificação do microssatélite CGA pelos grandes fragmentos que produz. A par disso, e depois da análise estatística propriamente dita, resolveu-se excluir da análise de diversidade genética das populações e sua diferenciação os microssatélites S0218, SW951 e SW72. O primeiro devido ao facto de se localizar no cromossoma sexual (X) e como tal ser de difícil interpretação, em conjunto com os restantes marcadores, para além de não poderem ser considerados em conjunto os machos e fêmeas. Este facto também foi considerado por Laval et al. (2000) e Martinez (2001). Os marcadores SW951 e SW72 foram excluídos já que os valores obtidos na análise não se apresentaram coerentes, com valores de FIS muito elevados e completamente desequilibrados, o que iria interferir com a análise do conjunto dos marcadores. Possivelmente estes dois marcadores poderão estar ligados a caracteres funcionais, sendo alterados por selecção e não se apresentando neutros como inicialmente se pressuponha, o que altera a sua interpretação (Vega-Pla, 2005, comunicação pessoal). Desta forma, e em relação ao estudo dos alelos detectados para cada marcador e respectivas frequências, foram considerados 25 loci. Quando se referem os estudos de diversidade genética dos microssatélites, diferenciação e diversidade genética das populações, equilíbrio HW, distâncias e árvores genéticas, discriminação e análise factorial das diferentes populações, foram considerados somente 22 loci, por serem os mais adequados e informativos para o trabalho.

V.4.3. Alelos detectados

Desde a selecção desta bateria de marcadores moleculares pelos peritos da FAO/ISAG, já foram identificados alelos nulos para alguns dos microssatélites utilizados. É o caso do marcador S0215 (Moser et al. citado por Martinez, 2001) ou de estudos de Rohrer et al. (1994) que indicam, para outros microssatélites, alelos não amplificados. No entanto, Laval et al. (2000), num estudo sobre a diversidade genética de onze raças porcinas europeias, para o mesmo painel de marcadores, não detectam a existência de alelos nulos.

Para se tentar reduzir ao máximo a ocorrência de alelos nulos e/ou não amplificação, todas as amostras com dificuldades de amplificação e/ou leitura foram repetidas e se, mesmo assim continuavam a ser problemáticas, eram excluídas da análise.

Em relação aos alelos detectados para cada marcador, os valores obtidos apresentam alguma consistência com os observados por Archibald et al. (1995), Rohrer

et al., (1994) e Martinez (2001). Segundo Lemús-Flores et al. (2001), para um estudo sobre o porco crioulo Mexicano, o NTA detectados para um número inferior de microssatélites avaliados (10) é, regra geral, superior, apresentando, no entanto, também o marcador S0005 como sendo o que possui maior nº de alelos.

Deve, no entanto, referir-se algumas diferenças importantes entre os alelos encontrados, para os marcadores S0215 e S0355, neste estudo e no de Martinez (2001) que detectou muito menor número (4 e 5 versus os 9 e 14 deste estudo). Este facto poderá ser explicado visto o trabalho de Martinez (2001) focar as variedades de porco Ibérico, com muito poucos alelos para estes marcadores, tal como encontrámos para a raça Alentejana (2 e 3, respectivamente). Se considerarmos os valores para raças exóticas, neste trabalho, os resultados já são muito idênticos aos de Archibald et al. (1995). Assim sendo, estes marcadores não são muito bons para caracterizar a variabilidade genética dentro do tronco Ibérico, mas seriam muito interessantes para estudos de comparação destas populações com outras raças.

De referir ainda que, neste estudo, os marcadores S0068 (com 19 alelos) e SW857 (com 13) apresentaram alelos diferentes em número superior aos referidos por Archibald et al. (1995), Rohrer et al., (1994), Laval et al. (2000) e Martinez (2001), pelo que se revelaram úteis para estudar a variabilidade.

No caso da população MA os marcadores que apresentaram maior número de alelos foram o S0355, o S0068 e S0226, pelo que se revelam informativos para avaliar a variabilidade genética desta população.

Em alguns casos, as diferentes populações apresentam alelos distintos, de maneira que o NTA é muito superior ao NMA, como acontece com Martinez (2001). Como exemplo temos o locus S0178, com NTA de 13 mas NMA de 5,5 e o locus S0101 com NTA de 8 mas NMA de 3,5.

O NMA estimado neste trabalho é semelhante ao obtido por Martinez (2001) e Laval et al. (2000) mas inferior ao referenciado por Lemus-Flores et al. (2001), Li et al. (2000), Kim et al. (2005) e Fredholm et al. (1993) citado por Lemus-Flores et al. (2001).

Também Laval et al. (2000) apresentam marcadores (S0215 e S0225) com um NMA muito baixo (sendo mesmo monomórficos em algumas raças), em concordância com os resultados deste trabalho. Nesta análise, também o S0101 e S0227 apresentaram um baixo NMA, revelando-se pouco informativos.

O comprimento dos alelos detectados (Tabela IV.15.) está, regra geral, de acordo com os tamanhos esperados e referenciados pela FAO/ISAG (FAO, 1998), existindo, no entanto, alguns marcadores com um intervalo de valores obtidos mais alargado (SW936, S0155, SW911, S0225, S0228 e S0227).

Neste estudo a raça Alentejana foi a que apresentou mais alelos privados (sete) seguida da Bísara com quatro. A acrescentar ainda o facto de dois dos sete alelos referidos para a raça Alentejana, serem também os mais frequentes, o que sugere que existe alguma especificidade da raça em questão. Contudo, estes resultados devem ser analisados cuidadosamente, já que os alelos privados detectados dizem respeito a uma amostra de dimensão reduzida. Também Li et al. (2004) e Paszek et al. (1998) referem a ocorrência de alelos privados em populações suínas estudadas mas, segundo aqueles autores, deve considerar-se a natureza de variação dos microssatélites, com elevadas taxas mutacionais e os erros de leitura e interpretação que possam ocorrer nas análises, antes de concluir definitivamente pela existência de um alelo privado.

V.4.4. Análise da diversidade genética dos marcadores

A heterozigotia e o PIC reflectem o polimorfismo detectado para cada marcador nas populações estudadas e o seu valor obtido depende, essencialmente, do número de alelos detectados e das suas frequências.

Seria de esperar uma relação directa entre o número de alelos e o PIC e H, pois quando aumentam os alelos encontrados também aumenta, proporcionalmente, o PIC e H. Contudo, este aspecto nem sempre acontece, devido ao desequilíbrio que ocorre na distribuição das frequências alélicas.

Os marcadores que se revelaram menos informativos nesta análise foram o S0215, o S0225 e o S0227, com valores de H e PIC inferiores a 0,50. Algo similar ocorreu com Martinez (2001) para as variedades do porco Ibérico, igualmente com os marcadores S0215 e S0225. No entanto, ocorre um facto interessante com os marcadores S0215 e S0225 que, ainda que tenham valores baixos de H e PIC, apresentam um valor considerável de GST (de 25 e 34%) pelo que teriaminteresse para definir a diferenciação entre as populações.

Contrariamente, os marcadores que se revelaram mais informativos e com maior poder discriminante foram o S0068, SW632, S0002, S0005, SW857 e SW122, com valores de H e PIC superiores a 0,70. Também Laval et al. (2000) apresentam valores semelhantes, coincidindo o marcador com maior valor de PIC (S0005) encontrado por

estes autores para onze raças europeias, com o deste trabalho, para sete populações suínas. Deste modo, estes marcadores e outros com valores aceitáveis de H e PIC (>0,50) seriam aconselhados para estudos de caracterização genética de populações suínas.

Em relação ao GST, com uma média global de 17,61% indica algum grau de diferenciação entre os grupos populacionais, já que é superior ao valor de 10%, normalmente aceite como mínimo (Martinez e Vega-Pla, 2002). Este valor é, no entanto, muito inferior ao referido por Cardellino (2003), que indica que as diferenças entre raças rondam os 50%.

Em relação ao estudo da probabilidade de exclusão combinada (PEC), e como se considera um bateria extensa de marcadores (22 loci), o seu valor é bastante elevado (próximo de 1) pelo se conseguem efectuar, com enorme fiabilidade, testes de paternidade com este painel de microssatélites.