Técnicas de caracterização alélica com microssatélites

II.8.5.1. Extracção de DNA

O protocolo a seguir para a extracção dos ácidos nucleicos depende essencialmente do tipo de material biológico de que se dispõe (sangue, sémen, pêlos, músculo, ossos, fezes, etc), bem como da utilização posterior que queremos dar ao material extraído.

A maior parte dos protocolos de extracção de DNA clássicos tendem a ser laboriosos e algo complexos, se se pretender obter material de grande qualidade, com enorme pureza e alto peso molecular, com grande utilidade em biologia molecular. No entanto, já existem alguns protocolos de extracção mais simplificados e menos morosos, mas com obtenção final de DNA de menor qualidade.

De qualquer modo, estas metodologias permitem obter grandes quantidades de DNA, a partir de uma amostra inicial pequena, e conservar o material resultante por longos períodos de tempo através de congelação.

Regra geral, os protocolos de extracção de DNA são compostos por duas etapas distintas: 1) provocar a lise celular, normalmente com recurso à proteinase K, com a solubilização do DNA e 2) eliminação, por métodos enzimáticos e/ou químicos, do remanescente de proteínas, RNA ou outras moléculas que tenham ficado em suspensão e consequente purificação das amostras (Serrano, 1998; Martinez, 2001; Matos, 2004).

Tem sido na segunda etapa do processo de extracção de ácidos nucleicos que a técnica mais tem evoluído pois, se inicialmente eram usados solventes orgânicos como o fenol e o clorofórmio (Maniatis et al., 1982; Blin e Stafford, 1976 citados por Martinez, 2001), mais recentemente os métodos evitam a utilização destes produtos e, em alternativa, a precipitação das proteínas é efectuada, por exemplo, pela adição de altas concentrações de sais (Miller et al., 1988 citado por Ferreira, 2004).

No caso de extracção de DNA para posterior amplificação através da técnica de PCR, os requisitos para essa extracção diminuem acentuadamente, dada a grande

especificidade dos iniciadores ou primers utilizados, pelo que tornam o protocolo de extracção a seguir mais simples. Um exemplo disso é o caso da metodologia empregue por Kawasaky (1990) e que consiste na digestão de uma amostra de sangue com muito poucos microlitros, com proteinase K, seguido pela utilização directa do produto obtido nesta digestão na amplificação de fragmentos pela técnica de PCR.

II.8.5.2. A reacção em cadeia da Polimerase (PCR)

Nos anos de 1985 e 1986, foi desenvolvida uma técnica para a amplificação específica de fragmentos pouco extensos de DNA e de sequência conhecida, in vitro, por intermédio da utilização de uma polimerase da DNA, desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs), DNA genómico e iniciadores específicos (primers) para essas sequências e que flanqueiam o fragmento a amplificar (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986)

Esta técnica revolucionou a biologia molecular, possibilitando novas estratégias de análise, sendo actualmente um processo automatizado de amplificação fácil, rápida e selectiva de fragmentos de DNA específicos (Videira, 2001).

A partir da descrição inicial desta metodologia ocorreu uma simplificação e optimização dos protocolos mediante o uso de uma polimerase de DNA termoestável, obtida a partir da bactéria Thermus aquaticus (Taq). Desta forma, e visto que esta bactéria permanece activa a temperaturas superiores a 90ºC, necessárias para desnaturar o DNA, foi possível melhorar e tornar muito menos complexa esta técnica de PCR (Martinez e Vega-Pla, 2002).

Uma reacção de PCR consiste numa série de ciclos, cada um dos quais envolve reacções efectuadas a temperaturas diferentes. Em cada ciclo ocorre a desnaturação do DNA, emparelhamento dos primers específicos que flanqueiam a região de interesse e síntese de DNA (Videira, 2001). Desta forma conseguimos que ocorra um aumento exponencial dos fragmentos que queremos amplificar.

As polimerases de DNA sintetizam uma cadeia complementar de DNA na direcção 5’→ 3’, usando um molde de cadeia simples. A PCR baseia-se no princípio da utilização de sequências de oligonucleótidos, denominadas de iniciadores, cada um complementar a uma região concreta do DNA molde e que flanqueiam a região a amplificar.

Os requerimentos para a reacção são simples: desoxinucleósidos trifosfatos que fornecem energia e nucleótidos para a síntese de uma nova cadeia, polimerase de DNA, iniciadores e um tampão adequados com sais, geralmente de magnésio (Martinez, 2001; Martinez e Vega-Pla, 2002; Matos, 2004)

Para que se possa realizar esta técnica é necessário um termociclador, ou seja, um aparelho capaz de efectuar rápidas e variadas oscilações de temperatura para a execução dos diferentes ciclos de PCR e amplificação do DNA.

A técnica da PCR apresenta uma diversidade de aplicações, desde a amplificação de DNA a ser clonado ou para ser directamente sequenciado. Pode ainda servir para mapeamento de genes, diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas, estudos forenses e moleculares de evolução. Aplica-se também para clonar genes codificantes de proteínas ou amplificar genes directamente a partir de mRNA e quantificar a expressão genética, para a preparação de produtos para sequenciação e processos de mutagénese (Videira, 2001; Martinez e Vega-Pla, 2002)

Com o desenvolvimento da técnica da PCR foi possível a realização de trabalhos experimentais em que se efectua a amplificação de diferentes sequências de DNA alvo numa mesma reacção, algo a que se chama de PCR Multiplex. Desta forma consegue-se rentabilizar muito mais o tempo, material e trabalho, com uma diminuição dos custos laboratoriais (Chamberlain et al., 1989 citado por Martinez, 2001).

Neste caso, como numa mesma reacção de amplificação se vão introduzir vários conjuntos de primers (forward + reverse), por vezes em número superior a dez, a probabilidade de ocorrência de amplificações inespecíficas é maior pelo que será necessária uma optimização das metodologias empregues.

Sendo o sangue e pêlos as principais fontes de material biológico para a extracção de DNA, têm sido propostos vários métodos para a realização da técnica da PCR de amostras de sangue, sem uma prévia extracção de DNA para facilitar e tornar mais rápido todo o processo de estudo e investigação em biologia molecular (Mercier et al., 1990; Ohara et al., 1994 citados por Martinez e Vega-Pla, 2002). Também se têm descrito técnicas para amplificar sequências a partir de sangue e pêlo, utilizando resinas quelantes como o Chelex® 100 (Bio-Rad) para eliminar iões e metais (Walsh et al., 1991).

II.8.5.3. Concepção e escolha de primers

Os primers ou iniciadores são oligonucleótidos que flanqueiam a sequência de DNA que se pretende amplificar mediante a técnica da PCR. Desta forma a sua escolha representa um passo fundamental para que possa ocorrer a amplificação dos fragmentos, pelo que, se não for adequada, não haverá síntese de DNA (Martinez e Vega-Pla, 2002).

A concepção de iniciadores mais adequados deve basear-se em dois objectivos principais que são: especificidade e eficiência de amplificação.

A especificidade define-se como a frequência com que ocorrem erros de ligação com a sequência de DNA complementar e é directamente influenciada pelo comprimento e a sequência de nucleótidos do primer, a duração das diferentes etapas de amplificação e a temperatura a que se realizam. Uma baixa especificidade tende a produzir amplificações indesejadas e inespecíficas.

A eficiência é, geralmente, controlada pela longitude do iniciador e pela temperatura de hibridação da PCR (Martinez, 2001).

Se os oligonucleótidos apresentam entre 18 e 24 bases, usualmente, são bastantes específicos se a temperatura de hibridação for 5 a 10ºC abaixo da temperatura de fusão (tm – temperatura de melting) do iniciador, definida como a temperatura de desligamento do conjunto iniciador-DNA molde (Sugss et al., 1981 citado por Martinez, 2001).

Outro aspecto a ter em conta é a composição da extremidade 3´ dos iniciadores, pois a sua estabilidade afecta directamente a especificidade da reacção.

Por outro lado, é necessário analisar se os iniciadores não são complementares uns com os outros, pois se isso ocorre poderá dar-se uma amplificação dos primers sobre si mesmos, com abaixamento do rendimento da reacção (Martinez e Vega-Pla, 2002).

Um factor importante para se seleccionar um par de iniciadores (forward e reverse) é o comprimento do produto de PCR obtido, pois vai influenciar a eficiência da amplificação. Quanto maior for o comprimento do fragmento a amplificar melhor deverá ser a qualidade e integridade do DNA a utilizar, e a reacção também será mais longa, pela acção da polimerase na síntese de produto, bem como haverá um maior consumo de nucleótidos (Rychlik et al., 1990 citado por Martinez, 2001).

A escolha de um conjunto de iniciadores e dos respectivos marcadores, para estudos de caracterização genética em suínos, encontra-se recomendada por um

conjunto de peritos, especialistas nesta área e avalizada pela FAO/ISAG (FAO, 2004: Barker et al., 1998).

II.8.5.4. Detecção de fragmentos de DNA através do uso de fluorocromos e sequenciação automática em capilar

Na maioria dos trabalhos publicados no início dos anos 90, a análise de microssatélites era efectuada mediante electroforese, marcação radioactiva e posterior radiografia (Moazami-Goudarzi, 1995; Weber, 1990 citados por Ferreira, 2004; Moore et al., 1991 citado por Martinez, 2001; entre outros). Um pouco mais tarde começam a surgir, em diversos trabalhos, as técnicas com fluorocromos em sequenciadores automáticos, nomeadamente para estudos de genética de populações (Moazami- Goudarzi et al., 1997; Martinez, 2001) e identificação de amostras (Williams et al., 1997), essencialmente usando sequenciadores que utilizam a electroforese em géis de agarose.

A utilização de um sequenciador capilar permite, de forma automatizada, a análise das sequências e do tamanho de fragmentos amplificados anteriormente pela técnica da PCR, através da quantificação de fluorescência emitida por iniciadores ou dNTPs marcados com fluorocromos. Os fluorocromos emitem fluorescência quando são excitados por um laser, tendo cada um deles o seu máximo de emissão dentro de um determinado intervalo de valores de comprimento de onda. Este processo de excitação dos fluorocromos é possível uma vez que os fragmentos marcados são submetidos a uma migração por electroforese ao longo de um capilar disposto em frente do laser. Esta técnica de marcação permite identificar em simultâneo fragmentos que, embora possuam diferentes naturezas, se sobrepõem em termos de peso molecular. Para tal, basta utilizar um grupo de fluorescências diferentes (em geral quatro ou cinco, consoante o estudo em questão) para que fragmentos de igual tamanho surjam com cores distintas, que normalmente se traduzem em quatro ou cinco cores consoante a metodologia aplicada.

A introdução dos sequenciadores automáticos veio contribuir para um grande acréscimo da eficiência deste tipo de análise, já que tornou todo o processo de detecção de sequências genéticas bastante menos moroso, além de que eliminou o risco para a segurança dos investigadores e técnicos que representava a utilização de marcadores

radiactivos. No entanto, um sequenciador automático é um equipamento que nem sempre está dentro das possibilidades dos laboratórios, já que se trata de equipamento de grande valor monetário e manutenção dispendiosa.