Detecção de mutações pontuais por SNPs

Para o estudo da sensibilidade ao stress nos suínos amostrados foram determinados os genótipos (NN, Nn, nn) de todos os animais (n=249) por intermédio de uma metodologia inovadora, com a detecção da mutação pontual no gene RYR1, por análise de SNPs. Esta técnica foi optimizada a partir da experiência acumulada do Laboratório de Genética Molecular da EZN em metodologias semelhantes, tais como na despistagem da resistência genética ao scrapie (Gama et al., 2005) ou do gene da garupa dupla (miostatina) em bovinos (Carolino, M. I., 2005, comunicação pessoal).

Para que se consigam detectar mutações pontuais com SNPs, com leitura em sequenciador automático, é necessária a realização de duas reacções de PCR. A 1ª reacção de PCR irá permitir que se amplifique o fragmento de interesse (neste caso com 73 pb) onde se encontra incluída a mutação pontual e a 2ª reacção de PCR será para a detecção da mutação propriamente dita, pela amplificação de um fragmento que indica a mutação. Entre as diferentes reacções de amplificação e a entrada das amostras para leitura em sequenciador automático é necessária a realização de diversas etapas de purificação e limpeza do material de interesse.

De um modo geral, o método seguido para a genotipagem do gene RYR1 pode dividir-se nas seguintes etapas:

• Extracção do DNA (já efectuada para o estudo com microssatélites); • 1ª Reacção de PCR (amplificação do fragmento desejado com 73 pb);

• Confirmação do produto de PCR por meio de gel (realizado por amostragem de forma aleatória a alguns animais das populações em estudo);

• Purificação do 1º produto de PCR;

• 2ª Reacção de PCR (amplificação das mutações pontuais, com kit comercial ABI Prism Snapshot);

• Purificação do 2º produto de PCR;

• Preparação para electroforese em capilar (sequenciador);

• Análise no sequenciador (ABI Prism™ 310 Genetic Analyser Data Collection, versão 3.0.0);

• Análise dos resultados directamente pelo programa GeneScan (ABI Prism™ Genescan, versão 3.7) e interpretação posterior pelo programa Genotyper (ABI Prism™ Genotyper, versão 3.7 NT), se necessário.

Para a realização do 1º PCR preparou-se uma mistura com: 14 µl de água autoclavada

2,5 µl de tampão PCR 10X 2,5 µl de 25 mM MgCl2

0,2 µl de mistura de iniciadores (forward + reverse) a 0,16 µM (MBI Fermentas) desenhados por Fujii et al., (1991) (Tabela III.7.)

0,5 µl de 10mM dNTP mix 5 µl de DNA genómico

Em Hot Start adicionou-se 0,5 µl da enzima Taq DNA polimerase (MBI Fermentas EP 0405), o que perfez um volume total por reacção de 25,2 µl/amostra.

Programaram-se os termocicladores (Applied Biosystems, 9700 GeneAmp; Biometra, Tgradient) para as seguintes condições da reacção de PCR:

• Período inicial de 15 minutos à temperatura de 95ºC para desnaturar as cadeias de DNA genómico.

• 30 ciclos de: 45 segundos a 94ºC (desnaturação), 1 minuto e 30 segundos a 61ºC (annealing) e 1 minuto e 30 segundos a 72ºC (elongação das novas cadeias).

Fragmentos com 73 pb

• Um último período de 30 minutos a 72ºC (fase de elongação das cadeias de DNA neo-formadas), seguidos de uma temperatura de 4ºC mantida indeterminadamente de forma a manter o produto PCR estável até posterior manipulação.

Obteve-se, nestas condições, a amplificação de fragmentos com 73 pares de bases (pb), onde se encontra a mutação pontual.

A visualização e confirmação do produto de PCR realizou-se aleatoriamente em algumas das amostras, mediante electroforese em gel de agarose, com brometo de etídeo, e um padrão de pesos moleculares (Figura III.7.).

Após a amplificação, o produto resultante está em solução juntamente com todos os produtos que não foram totalmente utilizados na reacção anterior (iniciadores, dNTPs, etc.), que deverão ser retirados para evitar a sua participação nas reacções subsequentes.

Para a remoção deste material indesejável utilizamos uma mistura comercial (ExoSAP-IT, USB Corporation, #78201) de duas enzimas hidrolíticas, a fosfatase alcalina e a exonuclease.

Adicionaram-se 2 µl desta mistura a uma aliquota de 5 µl de produto de PCR, perfazendo um volume total de 7 µl, incubando no termociclador a 37ºC durante 60 minutos, seguidos de 15 minutos a 80ºC, para inactivação das enzimas utilizadas.

Para a reacção de amplificação das mutações pontuais (reacção Snapshot) foi utilizado um kit comercial (Applied Biosystems, # 4323154) seguindo as indicações do fornecedor.

Nesta etapa pretende-se detectar uma alteração (mutação pontual - SNP) de um nucleótido no locus 1843 do cromossoma 6, onde ocorre a substituição de uma citosina (C) por uma timina (T), conduzindo a uma alteração na codificação proteica, de uma

Figura III.7. Gel de agarose para confirmação de amplificação de fragmentos com 73 pb.

Utilizou-se um iniciador específico que permite amplificar a posição alvo, (mutação pontual) desenhado pelo Laboratório de Genética Molecular (LGM) da Estação Zootécnica Nacional (EZN) (Tabela III.7.).

Tabela III.7. Sequência de primers a utilizar consoante a reacção da PCR Gene

RYR1 Fonte Primer Forward (5´-3´) Primer Reverse 1º PCR Fujii et al., (1991) GTTCCCTGTGTGTGTGCA ATGGTG GCCAGGSAGCAAGTTCTC AGTAAT 2º PCR LGM - EZN ATATGTGCAATGGTGTG_GCCGTG

LGM - EZN – Laboratório de Genética Molecular da Estação Zootécnica Nacional

S – combinação, em partes iguais, de Guanina (G) e Citosina (C)

Cada iniciador une-se ao seu troço complementar de DNA, na presença de ddNTPs marcados com fluorescência e da enzima DNA polymerase. A enzima estende o iniciador num nucleótido adicionando um único ddNTP na sua extremidade 3’.

A identificação consegue-se através da marcação dos fragmentos obtidos com bases unidas a um fluorocromo nas zonas em que há a mutação pontual.

O procedimento laboratorial foi executado de acordo com as indicações do fabricante (Applied Biosystems, #4323357)

Para a 2ª reacção de PCR preparou-se uma mistura com 5 µl de Snapshot comercial, 0,6 µl dos iniciadores, a uma concentração de 0,024 µM e 4,4 µl de água autoclavada. A esta mistura adicionou-se 3 µl de produto da 1ª PCR de cada animal, perfazendo um volume final por amostra de 10 µl e levou-se ao termociclador.

O termociclador foi programado com uma temperatura inicial de 96ºC durante 10 minutos seguida de 25 ciclos de 96 ºC durante 10 s e 60 ºC durante 35 s, finalizando com 4º C até ao tratamento pós extensão.

Figura III.8. Sequência nucleotídica da região com a mutação pontual do gene RYR1 (C ou T no locus 1843). Adaptado de Fujii et al., (1991).

NN

Nn

nn

Para evitar que os ddNTPs remanescentes migrem juntamente com os fragmentos de interesse é necessário remover os grupos fosforilos 5, o que se consegue mediante tratamento com fosfatase. Neste processo de purificação do produto da 2ª PCR, utilizou- se uma fosfatase alcalina (Shrimp Alkaline Phosphatase – SAP, USB Corporation #70092Z) proposta pela Applied Biosystems.

Diluiu-se a SAP com o tampão de reacção comercial na proporção de 1:1 e adicionou-se 2 µl à mistura do passo anterior. Seguidamente a mistura foi incubada no termociclador durante uma hora a 37ºC e, de seguida, inactivada durante 15 minutos a 75 ºC.

A electroforese capilar permite a separação dos fragmentos obtidos nas etapas anteriores e determinar que tipo de base nucleotídica foi incorporada através da detecção da luz emitida pelo fluorocromo.

A preparação da amostra para o sequenciador inclui a adição de 9,8 µl de formamida HI-DI (Applied BioSystems, # 4311320) e de 0,2 µl de um padrão interno (LIZ 120, Applied Biosystems) a 1 µl do produto da 2ª reacção de PCR (Snapshot) que permita a análise automática pelo programa GeneScan. O padrão comercial utilizado (LIZ), foi desenhado para determinar o tamanho de pequenos fragmentos, especificamente para utilizar com o kit de Snapshot. Seguidamente provoca-se a desnaturação das amostras no termociclador durante 5 min a 95 ºC, ficando aptas a ser introduzidas no sequenciador. Após cada corrida o programa GeneScan permite visualizar os resultados, diferenciando-se os picos correspondentes a cada base pela sua cor e que podem ser importados para o software Genotyper que procede à sua interpretação directa de acordo com as definições introduzidas previamente. Se tiver havido incorporação da base azotada C ocorre

a emissão de flurescência preta relativa ao genótipo normal (NN). No caso de ser incorporado o nucleótido T há emissão de flurescência vermelha, correspondente ao genótipo mutante (nn). Se existirem duas bandas (preta e vermelha) o animal em questão é portador heterozigótico, com o genótipo Nn (Figura III.9.).