Parâmetros de diferenciação genética entre e dentro das populações

Pela obtenção das estatísticas F (FIS, FIT e FST), para além do GST, obtêm-se dados de consanguinidade e de diferenciação de cada marcador que vão ser muito úteis para avaliar o comportamento de cada um deles, a par da análise da H e PIC.

Pelos seus diferentes valores, podemos escolher quais os marcadores mais adequados para serem incluídos neste estudo (que, como já foi referido anteriormente, levou a que fossem excluídos, de parte das análises realizadas, os marcadores SW951 e SW72) e obter informações sobre quais os mais indicados a incluir em estudos futuros sobre estas populações porcinas em Portugal.

Pela análise da tabela IV.19. deve, no entanto, referir-se a particularidade do marcador S0215 que, mesmo apresentando altos valores de FIS e FIT (idêntico ao que se passou com Laval et al., 2000), ter sido incluído na análise por ter a particularidade de indicar um bom grau de diferenciação das populações (FST= 0,33).

Outro marcador interessante é o S0225, pois, tal como acontece para Laval et al. (2000), mesmo apresentando um FIS reduzido, tem um grande poder para discriminar e detectar o grau de diferenciação entre os indivíduos, revelando o maior FST e GST encontrados (0,42 e 0,34, respectivamente). Deste modo, mesmo que não se apresente muito informativo em relação a H e PIC, é bastante bom para destrinçar populações. Segundo Moazami-Goudarzi et al. (1994), a informação fornecida pelo PIC não pode

ser suficiente para a eleição/rejeição do painel de microssatélites a utilizar, devendo ter- se em consideração outros factores.

Os valores médios obtidos das estatísticas F, para o conjunto dos 22 loci analisados, estão em concordância com alguns valores encontrados na bibliografia para outras raças e outros estudos (Tabela V.1.), existindo no entanto algumas variações de valores, consoante a raça, sua estrutura populacional, se sujeitas a consanguinidade ou fortes pressões de selecção (Lemús-Flores et al., 2001).

Tabela V.1. Comparação de diferentes valores de FIS, FIT e FST e Ho em raças suínas, segundo diferentes autores e neste estudo

População porcina Ho FST FIT FIS Fonte

Neste estudo 0,47 a 0,64 0,18 0,24 0,067 --

Raças Chinesas 0,46 a 0,66 0,14 0,38 0,28 Li et al., 2004

Raças Chinesas 0,47 a 0,52 0,18 0,34 0,19 Fan et al., 2002

Ibérico 0,46 a 0,64 0,13 0,18 0,059 Martinez et al., 2000

Crioulo Mexicano 0,33 a 0,51 0,11 0,36 0,28 Lemús-Flores et al., 2001

Coreia e China 0,50 a 0,73 0,26 0,31 0,067 Kim et al., 2005

Raça Chinesa e

comerciais 0,46 a 0,58 0,11

0,09 -

0,41 Yue e Wang, 2003

Raças Europeias 0,35 a 0,60 0,27 0,31 0,052 Laval et al., 2000

Os valores obtidos de GST, mesmo sendo calculados por um algoritmo distinto do FST, apresentam valores semelhantes e que oscilam na mesma direcção, pelo que representa um complemento para o estudo do comportamento e grau de informação dos marcadores. Um valor global de 18% de FST indica que cerca de 1/5 da variação entre animais é devida às diferenças entre raças, sendo os restantes 4/5 devidos a diferenças entre os indivíduos dentro da mesma raça (intra-populacional), algo que contradiz o que afirma Cardellino (2003) ao referir que as diferenças entre raças representam cerca de 50% da variabilidade total. Este valor obtido é intermédio aos referenciados por outros autores (Tabela V.1.), sendo no caso dos suínos muito superior ao referido para bovinos (6-9%, MacHugh et al., 1998; Carvalho, 2005; Ginja, 2002), ovinos e caprinos (2-4%, Bruno de Sousa, 2005, comunicação pessoal) ou equinos (Cañon et al., 2000).

V.4.6. Diversidade genética das populações

No que diz respeito ao estudo da diversidade das populações, e em relação ao NMA, podemos constatar que o seu valor é muito baixo para a raça Duroc, com 3,77 alelos (ainda que similar ao referido por Kim et al., 2005, com valor de 4,3). Este facto

pode ser explicado, possivelmente por problemas de amostragem, não sendo a amostra analisada representativa da população, ou ainda por ser uma população muito seleccionada, logo com perda de variabilidade (Vega-Pla, 2005, comunicação pessoal). Para as restantes populações suínas avaliadas, o valor do NMA (superior a 5) já é aceitável e está de acordo com o referido por outros autores (Martinez, 2001; Kim et al., 2005; Lemus-Flores et al., 2001; Li et al., 2004).

Relativamente à heterozigotia observada e esperada, os valores obtidos enquadram-se dentro dos parâmetros obtidos noutros estudos (Tabela V.1.), ainda que o valor obtido para a raça Duroc seja reduzido (inferior a 0,5), podendo admitir-se que o painel de marcadores se revela pouco informativo para o estudo desta população (Martinez, 2001).

Os valores obtidos para raças comerciais (e.g. Pietrain, LR, LW e Duroc) (Laval et al., 2000; Yue e Wang, 2003) são, regra geral, inferiores aos apresentados para raças chinesas ou de populações autóctones (Li et al., 2004; Lemus-Flores et al., 2001), visto estas últimas não estarem tão sujeitas à acção da selecção ou de acasalamentos consanguíneos (Lemus-Flores et al., 2001; Fang et al., 2005).

Destacam-se ainda as grandes diferenças obtidas entre He e Ho para as raças Alentejana e Bísara, dando origem ao um valor de FIS muito elevado e significativo nestas populações. O valor elevado de FIS no Bísaro poderá ser, em parte, explicado pela estruturação a que está sujeita a população, existindo pouca homogeneidade dentro da própria raça (Vega-Pla, 2005, comunicação pessoal). Este aspecto pode ser visualizado na árvore de indivíduos obtida (Figura IV.15) onde se separam claramente dois ramos distintos desta população. Não se pressupõe que, na raça Bísara, este resultado possa ser consequência de problemas de amostragem pois esta foi realizada criteriosamente pela ANCSUB, nem da análise laboratorial, senão ter-se-ia passado o mesmo para um maior número de populações. Posto isso, repetiram-se as análises da diversidade genética destas populações (a título experimental, não sendo apresentados aqui os resultados) mas considerando a separação da raça Bísara em dois grupos distintos, conforme sugerido pela árvore de indivíduos por partilha de alelos (DAS). Os valores de FIS, neste caso particular, baixaram ligeiramente para próximo de 0,10 nos dois sub-grupos da raça Bísara, ainda que se tenham mantido elevados. Este facto indica que a população está estruturada e apresenta indivíduos heterogéneos entre grupos, mas homogéneos dentro dos grupos.

No caso da raça Alentejana, o valor elevado de FIS obtido é de difícil explicação, possivelmente por ter sido a população com a mais reduzida amostragem, ou esta não ser representativa da raça e/ou os indivíduos amostrados serem aparentados entre si.

No caso do Malhado de Alcobaça, os valores obtidos do NMA, Ho e He apresentam-se intermédios aos referenciados para outras populações, mas mais próximos dos de raças comerciais (Tabela V.1.). Isto indica que esta é uma população sujeita a selecção e, com um valor de FIS próximo de zero, revela que os indivíduos que a constituem se apresentam homogéneos entre si. Algo de difícil discussão é a obtenção de um valor de FIS próximo de zero, indicando que este grupo de indivíduos não é consanguíneo pois, segundo a caracterização demográfica e as genealogias analisadas, o MA apresenta indivíduos com uma tendência positiva acentuada de aumento da consanguinidade (∆F/ano=0,76%) e um valor médio de Fx na população adulta reprodutora de 8,8% (2003-2004). Deste modo existe alguma contradição entre os dados demográficos e o perfil genético dos indivíduos.

No que diz respeito ao EHW (Tabela IV.20.), em todas as populações estudadas verificou-se que frequentemente não se atinge esse equilíbrio, existindo sempre entre 2 e 9 loci que não estão em EHW para dois níveis diferentes de significância (p<0,05 e p<0,01). Este facto pode ser explicado visto serem populações fechadas (portanto consanguíneas), sujeitas a selecção artificial intensa, não sendo cumpridos os pressupostos de base da lei de HW, estando os resultados de acordo com os de outros autores (Yue e Wang, 2003; Fang et al., 2005; Kim et al., 2005). Outro aspecto que permite justificar este desequilíbrio é baseado no efeito de Wahlund, admitindo que possam existir sub-populações dentro de cada raça (Lemus-Flores et al., 2001; Fang et al., 2005; Li et al., 2004).

Desta forma, e pelo estudo de excesso/défice de heterozigotia, se conclui que, regra geral, existe uma deficiência de heterozigotos para os marcadores, apresentando- se muito menor número de loci com excesso de heterozigotia.

V.4.7. Distâncias genéticas entre populações e respectivas árvores

As distâncias genéticas foram concebidas para serem usadas com um tipo diferente de marcadores genéticos, como são os grupos sanguíneos ou os polimorfismos bioquímicos de proteínas. As taxas de mutação destes marcadores são muito diferentes das apresentadas pelos microssatélites, não sendo também tão frequente o fenómeno da homoplasia e da não amplificação alélica por problemas laboratoriais (Martinez, 2001).

Presentemente, têm sido desenvolvidos novos modelos de análise, mais adequados para o tratamento de resultados de polimorfismos de microssatélites.

As distâncias genéticas são calculadas a partir das frequências alélicas, e apresentam propriedades matemáticas com um significado biológico (Nei, 1978). Ainda que não exista um consenso geral sobre qual a metodologia mais adequada para a análise de populações (Eding e Laval, 1998; Martinez, 2001), a mais utilizada tem sido a distância standard de Nei (DS) (Martinez, 2001). Diferentes autores já se debruçaram sobre o estudo dos diferentes tipos de distâncias genéticas, sua relação e diferenças entre elas (Laval et al., 2002; Nagamine e Higuchi, 2001).

Consoante o estudo das populações suínas em questão, diferentes autores utilizam diferentes tipos de distâncias, como por exemplo a DS por Laval et al. (2000), Lemús- Flores et al. (2001), Li et al. (2000, 2004), Yue e Wang (2003), a DRey por Laval et al. (2000), a DA por Martinez (2001), Fang et al. (2005) e Kim et al. (2005).

Regra geral, as correlações entre as diferentes medidas são elevadas (Nei, 1983), em especial quando se aplicam a populações locais e com curtos períodos evolutivos (Martinez , 2001).

O mais aconselhado será calcular diferentes distâncias, e tentar escolher aquela cujos resultados melhor se adequam (Martinez, 2001) e sejam mais coerentes com os registos históricos documentados de determinada raça ou população (Vega-Pla, 2005, comunicação pessoal). Por isso, neste estudo, calcularam-se três tipos diferentes de distâncias (DS, DA e DRey). As duas distâncias que apresentaram maiores analogias entre si, com maior coerência e semelhança para a elaboração das respectivas árvores, foram a DS e a DRey pelo que se optou por estas para a apresentação gráfica das árvores de distâncias genéticas das populações. De notar que, para os diferentes tipos de distâncias, o par de populações mais próximos entre si foi o Malhado e o LR, sendo o Malhado também aquele o que se apresentou mais distante do Duroc. Desta forma, sai reforçada a ideia que o MA está bastante próximo geneticamente da população LR, devendo ter tido uma influência desta raça num passado recente.

As árvores que normalmente denominamos por filogenéticas deveriam ser mais correctamente referidas como árvores de distâncias genéticas, pois não são mais do que a representação gráfica da matriz das distâncias genéticas entre as populações (Eding e Laval, 1998). Deste modo, as árvores apresentadas neste estudo não são filogenéticas, pois não reflectem a filogenia das populações analisadas, nem informam sobre a

Na elaboração destes tipos de árvores ensaiaram-se duas metodologias distintas de reamostragem dos dados, UPGMA (Sneath e Sokal, 1973) e NJ (Saitou e Nei, 1987), tendo-se optado pelo NJ, que apresentou melhor definição e clareza na exposição gráfica das populações, e por ser o mais utilizado pelos diferentes autores já referenciados para estudos de diversidade genética porcina. Segundo Fang et al. (2005), o método de NJ tende a ser menos afectado pela presença de misturas entre populações, quando comparado com o UPGMA. No entanto, consoante o estudo em questão e a raça em análise têm sido descritos trabalhos com os dois tipos de metodologia, mas com um predomínio do uso do método NJ, e.g. em suínos Alves et al. (2003), Fang et al. (2005), Laval et al. (2000); em ovinos, Arranz et al. (2001); em bovinos, Mateus et al. (2004); em equídeos, Lopes et al. (2005) e Aranguren-Méndez et al. (2001). Por outro lado, outros autores utilizam o UPGMA, nomeadamente em suínos Martinez (2001), Li et al. (2004), Kim et al. (2002); em equinos, Achmann et al. (2004).

As árvores de distâncias genéticas obtidas (DS e DRey – Figuras IV.13 e IV.14) são bastante semelhantes mas apresentam valores de replicação baixos (de 27 a 60%), o que não permite extrair conclusões suficientemente fiáveis quanto ao distanciamento das populações. Algo que compensa esta falta de precisão na elaboração dos diferentes ramos das árvores é que, por intermédio de metodologias distintas de elaboração dos dendrogramas, estes se apresentam bastante homogéneos, o que transmite maior segurança quanto às conclusões.

Quando se avalia a disposição das populações nos dendrogramas, destacam-se das restantes as raças Duroc e Alentejana, estando mais próximas entre si as outras raças exóticas, conjuntamente com a Bísara e o MA. Assim se comprova, visualmente, a proximidade entre o LR e o MA, como sendo as duas populações menos distantes.

Para a realização da árvore de distâncias entre indivíduos (DAS) (Figura IV.15) foram incluídos todos os animais amostrados das sete populações (n=249). Desta forma, realizou-se um estudo de distância genética por intermédio de um algoritmo muito simples (Bowcock et al. 1994 citado por Martinez, 2001), onde se tenta agrupar os indivíduos em função dos alelos que partilham para cada marcador, representando-os graficamente numa árvore de distâncias.

Em relação à DAS obtida, também por NJ, podemos constatar que, de um modo geral, os indivíduos estão muito bem agrupados entre si, e segundo as suas populações de origem. Deve-se no entanto frisar o que já foi referido anteriormente da divisão da

raça Bísara em dois ramos distintos, explicada pela estruturação e falta de homogeneidade desta população.

A população MA, alvo de caracterização genética, apresenta-se homogeneamente agrupada, se bem que com diferentes clusters na árvore, podendo querer indicar diferentes linhas dentro do agrupamento populacional, ainda que muito semelhantes entre si. De ressalvar, no entanto, o aparecimento de dois indivíduos MA conjuntamente com indivíduos da raça Bísara. Mais uma vez a população MA aparece numa unidade taxonómica próxima de um cluster da raça LR, que se apresenta em dois clusters distintos mas contíguos.

Tal como nos resultados de Laval et al. (2000), num estudo sobre onze raças porcinas europeias, com um quase perfeito agrupamento dos indivíduos, também neste trabalho o agrupamento dos animais é bastante satisfatório, provando assim que esta bateria de microssatélites é adequada para este tipo de estudos.