Avaliação sensorial

A avaliação sensorial por painéis laboratoriais treinados é freqüentemente usada para caracterizar o odor de macho e/ou medir a sua incidência em populações de machos suínos inteiros. Estes resultados podem ser úteis para propósitos comparativos (comparar duas populações de animais ou dois tratamentos), mas os resultados obtidos com diferentes painéis não podem ser comparados entre si. De fato, a caracterização e a classificação do odor sexual é uma tarefa muito difícil e varia muito com a sensibilidade dos painelistas, seu nível de treinamento e na metodologia usada para preparar e avaliar as amostras de carne. Em um estudo envolvendo 7 painéis sensoriais, Dijkterhuis et al. (2000) fizeram o maior esforço possível para harmonizar a metodologia. Ainda assim, os autores concluíram que era "muito difícil harmonizar diferentes painéis sensoriais analíticos devido a uma série de fatores, incluindo “cultura, conotação de termos, nível de treinamento e detalhes no manuseio e na preparação do material”.

5.2

Métodos laboratoriais para medir compostos mal–cheirosos

Uma série de diferentes métodos imunológicos, cromatográficos e colorimétricos tem sido desenvolvida para medir os níveis de escatol e de androstenona nas

carcaças. Os métodos imunológicos utilizam anticorpos que devem se ligar especificamente aos compostos a serem testados e não a outros. A quantidade de anticorpos ligados é então medida usando radioisótopos em radioimunoensaio (RIA) ou uma enzima que produz um produto colorido na enzima ligada a ensaio imuno- específico (ELISA). Foram desenvolvidos RIAs para androstenona (Andresen, 1979; Uzu e Bonneau, 1980) e ELISAs para escatol (Singh et al., 1988) e androstenona (Abouzied et al., 1990; Claus et al., 1988). Os métodos imunológicos podem ser limitados pelo longo tempo necessário para desenvolver o equilíbrio da ligação do anticorpo e a necessidade da extração cuidadosa de amostras de gordura. Estes fatores também introduzem uma quantidade significativa de variação nestes ensaios, sendo comum encontrar coeficientes de variação de mais de 10%. Foi desenvolvido um método rápido de extração de androstenona da gordura para ser usados em imuno-ensaios (Claus et al., 1997).

Foram relatados métodos cromatográficos que utilizam cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou cromatografia gasosa (CG) para medir escatol e androstenona. A análise de escatol em HPLC utiliza colunas de fase reversa eluídas com sistemas de solventes isocráticos ou gradientes e usam detecção por ultravioleta ou fluorescência (Garcia-Regueiro e Diaz, 1989; Lin et al., 1991; Hansen-Møller, 1992; Tuomola et al., 1996). A análise da androstenona em HPLC envolve a conjugação a um cromóforo para detecção, uma vez que a androstenona não tem forte fluorescência ou absorve muito na região ultravioleta. Está sendo desenvolvido um método combinado para a análise de androstenona, escatol e indol (Hansen-Møller, 1994). A análise do escatol e da androstenona por CG tem sido descrita por detector de ionização de chama (Porter et al., 1989), detector de capturador de elétrons (de Brabander e Verbeke, 1986), detector termo-iônico específico (Peleran e Bories, 1985) e espectrofotometria de massa (Garcia-Regueiro et al., 1989; Edelhaeuser, 1989; Kwan et al., 1992). A extração cuidadosa das amostras é necessária para a análise cromatográfica, tanto para assegurar boa resolução das amostras, como para manter a vida útil da coluna. A androstenona também foi medida por espectrofotometria de massa depois da extração do fluido supercrítico (Tuomola et al., 1998). Foram desenvolvidos métodos para a extração de amostras de gordura para a análise do escatol por HPLC (Hansen-Møller, 1992; Dehnhard e Claus, 1992). Os métodos cromatográficos têm a vantagem de medir uma série de compostos relacionados ao mesmo tempo e geralmente são bastante específicos, não sendo afetados por compostos que podem interferor. No entanto, podem ser demorados, tecnicamente difíceis, caros e suscetíveis a falhas no equipamento. Por isso, geralmente são mais adequados para uso em análise experimental, e não para a análise de rotina de compostos de odor sexual na linha de abate.

Foram descritos métodos colorimétricos para a análise do escatol e dos esteróides 16-androstenos. O teste para escatol (Mortensen e Sorensen, 1984) envolve a extração da amostra de gordura com tris-acetona e a mistura do extrato filtrado como um reagente colorido que consiste de 4-dimetilaminobenzilaldeído em ácido sulfúrico e etanol. A intensidade da cor é então medida num espectrofotômetro a 580 nm. Os limites de detecção do ensaio são de aproximadamente 0,02 ppm e o coeficiente de variação para 0,25 ppm foi de±4%. No entanto, outros compostos como o indol, que não contribuem para o odor, são detectados pelo ensaio e os reagentes e produtos de reação são um pouco instáveis.

Foi desenvolvido um método para a análise colorimétrica dos esteróides 6- androstenos em carcaças (Squires, 1990; Squires et al., 1991, Squires et al., 1993). Neste método, estes esteróides são extraídos de amostras de gordura ou da glândula salivar, concentrados em cartuchos de fase sólida e depois eluídos das colunas e sofrem reação com um reagente de cor que consiste de resorciladeído e ácido sulfúrico em ácido acético glacial (Brooksbank e Haselwood, 1961). Todos os 16-androstenos produzem cor neste teste, e assim os resultados são expressos como equivalentes de 5α-androstenona para amostras de gordura e como equivalentes de 5α-androsten-3α-ol para a glândula salivar. O coeficiente de variação neste método, usando glândula salivar, é menos de 4%. Foram encontradas boas correlações (r=0,8) entre os escores sensoriais de odor e sabor desagradáveis de um painel sensorial treinado e os níveis totais de esteróides 16-androstenos na gordura ou na glândula salivar medidos por este método.

Poucos deste métodos são práticos o suficiente para serem usados na linha de abate, pois envolvem complicados procedimentos de extração ou o uso de equipamentos sofisticados e caros, de materiais caros, ou são muito demorados ou capazes de lidar com um grande número de amostras.

5.3

Potenciais métodos “on–line”

O uso de machos inteiros na produção de carne suína requer que os procedi- mentos de controle de qualidade estejam estabelecidos para assegurar que a carne com odor sexual não chegue ao consumidor. São necessários métodos confiáveis e rápidos para detectar o odor sexual para uso on–line nos abatedouros.

O método de espectrofotometria para medir escatol desenvolvido na Dinamarca (Mortensen e Sorensen, 1984) tem sido usado para identificar carcaças no abatedou- ro. No entanto, o equipamento é muito caro, não consegue analisar mais que 180 amostras por hora e mede apenas um dos compostos envolvidos.

Apesar de ter havido avanços importantes, que tornam a medição de androstenona (Claus et al., 1988, 1997) ou dos 16-androstenos totais (Squires, 1990) mais rápida e mais fácil, ainda estamos muito longe de ter um método industrial disponível.

A detecção instantânea na linha de abate de compostos que causam odor que usam algum tipo de sonda seria a situação ideal. Pode ser possível o uso de sondas com algum tipo de sensor imunológico, eletrônico ou químico. Os imunosensores ligam as reações antígeno-anticorpo a um sinal eletrônico gerado por um transdutor. No imunosensor de ressonância do plasmon de superfície (SPR), a reação antígeno- anticorpo causa uma mudança no índice de refração na interface líquido-metal que é detectada por uma mudança na intensidade de um raio laser refletido. Os sensores eletrônicos são compostos de semicondutores orgânicos cujas características mudam quando uma substância em particular é adsorvida na superfície. Este sensor (nariz eletrônico) foi usado para detectar os gases das trufas (Persaud, 1990). O uso de sensores de gás (Van Dijk, 1995; Berdagué et al., 1995) e a espectrometria de pirólise-massa (Berdagué et al., 1996) estão sendo pesquisados atualmente em diversos laboratórios. Recentemente, vários tipos de sensores eletrônicos foram investigados para a detecção de odor sexual, e foi demonstrado que os narizes artificiais simulam a resposta de um painel laboratorial ao odor sexual (Bourrounet

desenvolver sensores mais rápidos, sensíveis e robustos e para avaliar a viabilidade da técnica em condições industriais.

6

Metabolismo da androstenona e do escatol

O acúmulo de androstenona e de escatol nas carcaças é controlado por um equilíbrio entre os processos que produzem estes compostos e os que estão envolvidos na sua degradação e remoção. A androstenona é sintetizada nos testículos e a síntese aumenta quando o suíno se aproxima da maturidade sexual. O escatol é produzido pela degradação bacteriana do escatol no intestino, sendo absorvido para a corrente sanguínea e metabolizado no fígado.

6.1

Androstenona e compostos relacionados

Os esteróides 16-androstenos (incluindo a androstenona) são sintetizados nos testículos a partir da pregnenolona em uma reação que é catalizada pelo citrocromo P450C17 junto com o citocromo b5 e as redutases associadas (Meadus et al., 1993). O citocromo b5 foi clonado de uma série de espécies e, recentemente, do suíno (VanderMark e Steggles, 1997). Foram identificadas duas formas imunorreativas do citocromo b5 nos testículos pela análise de Western, uma forma de baixo peso molecular e uma de alto peso molecular (Davis e Squires, 1999). Os níveis da proteína de baixo peso molecular do citocromo b5 e mRNA total do citocromo b5 foram correlacionados com as concentrações de androstenona na gordura. Isto sugere que os níveis desta proteína nos testículos podem ser usados como marcador para reduzir o odor sexual.

A androstenona é metabolizada no fígado, com dois metabólitos principais produzidos por incubações in vitro com microssomas hepáticos (Babol et al., 1999). Neste sistema, o metabolismo hepático da androstenona e do escatol parecem estar relacionados e podem ocorrer via algumas enzimas comuns. No entanto, são necessários mais estudos para caracterizar o metabolismo hepático da androstenona e seu papel no clearance de androstenona.

6.2

Escatol e compostos relacionados

O escatol é produzido por bactérias no intestino grosso, que degradam o triptofano disponível de ração não digerida ou do turnover de células intestinais do suíno. O escatol é absorvido do intestino e metabolizado principalmente no fígado (Jensen

et al., 1995). Fatores genéticos também afetam o acúmulo de escatol na carcaça.

Um estudo preliminar sugere que um gene recessivo Ska1 está ligado a altos níveis de escatol, especialmente quando a produção de escatol no intestino é alta (Lundström et al., 1994). Isto provavelmente se deva a efeitos sobre o metabolismo hepático do escatol, já que o metabolismo de escatol é baixo em alguns machos suínos intactos (Friis, 1995; Squires e Lundström, 1997; Babol et al., 1998a, 1998b). Estudamos bastante o metabolismo hepático do escatol em suínos e identificamos os principais metabólitos que são formados na Fase I do metabolismo (Diaz et al., 1999). São o 6-hidroxiescatol (chamado anteriormente de pro-MII), 5-hidroxiescatol,

indol-3-carbinol, 3-hidróxi-3-metiloxindol ou HMOI, 3-hidróxi-3-metilindolenina (HMI), 3-metiloxindol (3MOI) e 2-amino-acetofenona (2-AM). Verificamos que, in vitro, o HMI é produzido em maior quantidade (45%), seguido do 3MOI a 28%, HMOI a 19%, 6-hidroxiescatol a 5% e os outros em menor quantidade. A produção de 6-hidroxiescatol e de HMOI foi negativamente correlacionada com o acúmulo de escatol na gordura, enquanto a produção de HMI teve correlação positiva com os níveis de escatol na gordura.

Demonstramos que as enzimas CYP2E1 (Squires e Lundström, 1997), CYP2A6 (Diaz e Squires, 2000a) e aldeído oxidase (Diaz e Squires, 2000b) são enzimas-chave na Fase I do metabolismo do escatol. Também verificamos que a Fase II do metabolismo dos metabólitos do escatol por sulfotransferase está relacionada ao clearance de escatol no fígado (Babol et al., 1998a, 1998b). Suínos com altos níveis destas enzimas têm baixos níveis de escatol na gordura, uma vez que o escatol é rapidamente metabolizado e removido do corpo. Animais com baixos níveis destas enzimas têm altos níveis de escatol na gordura se a quantidade de escatol absorvida do intestino ou do ambiente for alta. São necessários marcadores genéticos que possam identificar os animais que expressam altos níveis de enzimas-chave no metabolismo do escatol.

7

Fatores que afetam o odor sexual

Os resultados da avaliação sensorial de painéis sensoriais geralmente são inconsistentes demais para permitir que se façam conclusões firmes. Portanto, deve ser dado enfoque aos fatores de variação nos níveis de androstenona ou de escatol.

7.1

Fatores de variação nos níveis de androstenona

Nos pesos usuais de abate, os níveis de androstenona na gordura são muito variáveis entre animais e seguem uma distribuição log-normal. Por exemplo, a distribuição dos níveis de androstenona na gordura de 4293 machos suínos inteiros criados em 6 países europeus está apresentada na Fig. 3. As proporções de animais com níveis de androstenona ≤0.2, entre 0,2-0,5; 0,5-1,0; 1,0-2,0; 2,0-5,0 e >5,0 ppm foram 7, 24, 28, 22, 14 e 5%, respectivamente. Todas as 220 fêmeas contemporâneas exibiram níveis de androstenona≤00,2 ppm sendo que 98% delas tiveram≤00,1 ppm. A intensidade da síntese de androstenona é baixa no leitão e depois aumenta estavelmente durante o estabelecimento da puberdade, junto com o aumento da produção de outros esteróides, andrógenos e estrógenos testiculares, que são responsáveis pelo melhor desempenho dos machos inteiros. Como os mesmos sistemas regulatórios parecem controlar a síntese de todos os esteróides testiculares, é muito difícil diminuir a androstenona sem também afetar os andrógenos e os estrógenos.

A grande variação no teor de androstenona resulta de dois mecanismos diferentes: diferenças na maturidade sexual são responsáveis por diferenças na idade em que ocorre elevação nos níveis de esteróides na gordura, enquanto que diferenças no potencial para a produção de androstenona são responsáveis pela magnitude da elevação (Bonneau et al., 1987a, b). Ambos mecanismos são geneticamente

A nd ros ten on a 0 5 10 15 20 0 1 2 3 4 5 N ív el an dr o steno na go r du ra (p pm) % d a p o p u la ç ã o E scatol 0 5 10 15 20 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 N ív el escatol go rdu ra (p pm ) % d a p o p u la ç ã o

Figura 3 — Distribuição de níveis de androstenona e de escatol em

4293 machos suínos inteiros criados em 6 países europeus (adaptado de Walstra et al., 1999).

determinados e isto explica a alta herdabilidade do teor de androstenona na gordura, com herdabilidades estimadas entre 0,25 e 0,87 (revisão de Willeke, 1993). Os níveis de androstenona variam entre raças suínas, sendo que o Duroc tem níveis bem mais altos que o Yorkshire, Landrace ou Hampshire (Xue et al., 1996; Squires e Lou, 1995) e o Large White tem níveis mais altos que o Landrace (Willeke, 1993). Foi proposto um efeito significativo de diferentes haplotipos do Antígeno de Linfócito Suíno (SLA) e do marcador de microsatélite S0103 sobre o nível de androstenona na gordura (Bidanel et al., 1997). Isto sugere que um loci de característica quantitativa (QTL) para androstenona está localizado no cromossoma 7 entre estes dois marcadores. Outro estudo, baseado em um experimento de seleção para baixa androstenona, propôs que um gene principal de dois alelos afeta os níveis de androstenona na gordura (Fouilloux et al., 1997). Este modelo sugere que o alelo “baixa androstenona” é completamente dominante em relação ao “alta androstenona”. Não há evidência de ligação deste gene com o sistema SLA. Assim, parece que há pelo menos dois efeitos genéticos importantes sobre o acúmulo de androstenona na gordura. Um deles pode estar relacionado com a expressão do citocromo b5 e o potencial de produção de androstenona, enquanto que o outro pode estar relacionado a outros fatores como o desenvolvimento da maturidade sexual. São necessárias mais pesquisas para caracterizar completamente estes QTL para baixa androstenona para que possam ser usados em programas de seleção genética para suínos com baixo odor sexual.