C OnstruçãO dOs banCOs de C dna de CérebrO e de OVáriO de tiláPia

Foram construídos dois bancos de cDNA a partir de mRNA do ovário e do cérebro de O. mossambicus. Foi utilizado o vector UNI-ZAP XR (Stratagene, La Jola, CA) que permite a clonagem direccional do cDNA o que se revela vantajoso para a caracterização e sequenciação dos clones isolados a partir destes bancos. A produção dos bancos foi feita a partir de cDNA obtido por transcrição inversa de RNAm poly(A)+ _{de ovários de 5 fêmeas (banco do ovário)}

e de cérebros de seis machos dominantes (banco de cérebro). O processo foi idêntico para ambos os bancos de cDNA e a síntese de cDNA iniciou-se com 5µg de mRNA, usando o kit UNI-ZAP XR cDNA cloning synthesis (Stratagene, La Jolla, CA). A reacção de síntese da primeira cadeia do cDNA foi feita num tubo Eppendorff estéril de 1.5ml de capacidade num volume total de reacção de 50µl com os seguintes componentes: 5µl de tampão 10x concentrado para a síntese de primeira cadeia (composição não fornecida pelo fabricante – first-strand buffer), 3µl de mistura para a primeira cadeia de metil nucleótidos, 2µl de primer-linker (5’-GAGAGAGAGAGACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’; 1.4µg/µl), 1µl de inibidor de RNase (40U/µl), água tratada com DEPC (anexo I). Antes da adição do mRNA os reagentes foram misturados após o que foram brevemente centrifugados para que se concentrassem no fundo do tubo. O RNAm (5µg) foi ressuspendido em água- DEPC, desnaturado durante 10min a 65ºC e cuidadosamente adicionado à reacção, pipetando repetidas vezes para facilitar a mistura. Após 10min à temperatura ambiente para permitir a ligação do primer ao mRNA foi adicionado 1.5µl da enzima MMLV-RT (50 U/µl). A reacção de síntese da primeira cadeia de cDNA decorreu durante uma hora a 37ºC, após o que a reacção foi interrompida colocando o tubo no gelo.

Para a síntese da segunda cadeia de cDNA, foram adicionados 45µl da reacção de síntese da primeira cadeia num Eppendorf em gelo, seguidos de 20µl de tampão 10x concentrado específico para a síntese da segunda cadeia (second-strand buffer, cuja composição não

foi fornecida pelo fabricante), 6µl de mistura de metil nucleótidos para a segunda cadeia, 116µl de água estéril, 2µl de RNase H (1.5 U/µl) (com o objectivo de remover o RNAm) e 11µl de DNA polimerase I (9U/µl). Após a adição de todos os componentes, o tubo foi agitado num vórtex e centrifugado para concentrar a reacção no fundo do tubo. Seguiu-se incubação a 16ºC durante 2.5h após o que o tubo foi de novo colocado em gelo.

Para o blunting das terminações do cDNA foram adicionados ao volume total da reacção anterior, 23µl de mix de dNTP para blunting e 2µl de pfu DNA polimerase recombinante (2.5U/µl) decorrendo a incubação durante 30min a 72ºC. Os produtos de reacção foram extraídos com 200µl de uma solução de fenol básico/clorofórmio (1:1) e a fase aquosa transferida para um novo tubo estéril de 1.5ml. Uma segunda extracção foi feita adicionando 200µl de clorofórmio à fase aquosa e centrifugando durante 2min a 12000rpm. A fase aquosa (sobrenadante) foi de novo recolhida para um tubo estéril idêntico e precipitada durante a noite a -20ºC com 20µl de acetato de sódio 3M e 400µl de etanol absoluto previamente arrefecido a -20o_{C. O DNA foi recuperado por centrifugação durante 60min}

a 4ºC, o sobrenadante removido e o resíduo (pellet) seco ao ar até não existir qualquer vestígio de etanol. Depois de seco, o pellet foi ressuspendido numa solução contendo adaptadores para a enzima EcoR-I (0.4µg/µl) e incubado a 4ºC durante 30min.

A ligação dos adaptadores da EcoR-I foi desempenhada utilizando 8µl do cDNA ressuspenso na mistura referida anteriormente aos quais foram adicionados 1µl de tampão específico para a ligase (500mM tris-HCl, pH 7.5, 70mM MgCl₂, 10mM DDT), 1µl de ATP (10mM) e 1µl da enzima T4 DNA ligase (4U/µl). A reacção foi incubada a 4ºC durante 18h, no fim das quais a T4 DNA ligase foi inactivada pelo calor durante 30min (a 70ºC). No fim deste período, o tubo foi colocado à temperatura ambiente para arrefecer lentamente durante 5min e posteriormente centrifugado para depositar a solução no fundo do tubo.

Os terminais dos adaptadores EcoR-I foram fosforizados por adição 1µl de tampão de ligação (ligase buffer), 2µl de ATP (10mM), 6µl de água estéril e 1µl de T4 Polinucleotide Kinase (10U/µl), perfazendo um volume final de reacção de 21µl e incubação durante 30min a 37ºC. Depois de arrefecer à temperatura ambiente (aproximadamente 24ºC), o cDNA fosforilado foi digerido adicionando 3µl da endonuclease de restrição XhoI e 28µl

de tampão específico para esta enzima (cuja composição não foi fornecida pelo fabricante) no volume total da reacção anterior por incubação a 37ºC durante 1.5 horas. O volume total da reacção foi ajustado a 120µl adicionando 68µl de tampão STE 1x (0.1M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM EDTA) e o cDNA foi extraído com idêntico volume de fenol/clorofórmio, sendo a fase aquosa transferida para um tubo novo.

A purificação do cDNA com os adaptadores EcorI/XhoI foi efectuada utilizando colunas Sephacryl® (Pharmacia Biotech) previamente preparadas equilibrando a resina com 2 ml de solução tampão 1x STE. A solução tampão foi aplicada no topo da coluna e a eluição por centrifugação da coluna a 400g durante 2min. O processo foi repetido duas vezes. Após a segunda centrifugação, a coluna foi inserida num tubo Falcon de 15ml, estéril, e o volume total da reacção aplicado no topo da matriz, eluíndo o cDNA por centrifugação também a 400g durante 2min. O cDNA foi misturado em diferentes quantidades com 1µg de vector UniZap-XR, para que diferentes proporções de vector e de cDNA estivessem presentes em cada mistura, com o objectivo de optimizar as proporções destes componentes para uma ligação ideal. A reacção foi completada para um volume final de 32µl, utilizando para o efeito diferentes quantidades de 1x STE para cada mistura. As diferentes misturas de cDNA e vector foram co-precipitadas utilizando 1µl de 3M NaAc e 60µl de etanol gelado absoluto e em seguida colocadas a -70ºC durante 2 horas. O precipitado foi recuperado por centrifugação (10000g durante 10min a 4ºC) e o pellet ressuspendido em 3.5µl de água estéril a que foram adicionados 0.5µl de tampão de ligação 10x concentrado, 0.5µl de ATP 10mM e 0.5µl de T4 DNA ligase (4U/µl) para completar a reacção de ligação. O processo decorreu durante a noite a 12ºC.

Para o empacotamento (packaging) do cDNA ligado ao vector, foi usado o Kit de clonagem Gigapack® III Gold (Stratagene). Cada ligação (4µl) foi adicionada a um extracto de packaging rapidamente descongelado e misturado com auxílio da ponta da pipeta. A reacção foi incubada durante 1h45min à temperatura ambiente e a reacção foi então terminada adicionando 500µl de tampão SM (anexo II) e 20µl de clorofórmio. Após um vórtex e uma centrifugação rápida (30s), o sobrenadante foi recuperado e transferido para um novo tubo e utilizado para a titulação e amplificação do banco de cDNA.

3.2.7.1 Titulação dos bancos de cdnA

A titulação dos bancos de cDNA permite quantificar o número de fagos recombinantes presentes em cada banco. A presença de um inserto (cDNA) na região poly-linker do vector produz uma disrupção do gene lac Z dando origem a uma pfu (plaque forming unit) com gene de β-galactosidase inactivo. Se não existe nenhum cDNA inserido no vector, a região N-terminal da enzima β-galactosidase é expressa. Assim quando o banco é plaqueado em NZY agar contendo o substrato de β-galactosidase os pfu não recombinantes apresentam um tom azulado e os recombinantes são transparentes. Neste processo é esperado que as placas recombinantes sejam expressas numa ordem de grandeza que varie entre 10 a 100 vezes superior às das placas não recombinantes.

Os bancos de cDNA foram diluídos de 1:10 em tampão SM e volumes de 1 e 10µl foram cuidadosamente adicionados separadamente a 200µl de células hospedeiras de E. coli XL1-Blue MRF’ e incubados a 37ºC durante 10min. Após esta incubação, as células foram misturadas em 10ml de top agar (anexo II) contendo 15µl de IPTG (0.5M) e 50µl de X-Gal (250mg/ml) e plaqueadas em placas de petri quadradas (12x12cm) previamente preparadas com meio NZY (anexo II). Após incubação a 37ºC durante a noite, todas as placas transparentes e azuis foram contadas e o número total de pfu (unidades formadoras de placas) presentes nos bancos foram calculados da seguinte forma:

(

)

A percentagem de recombinantes presentes nos bancos foi determinada contando a proporção de placas transparentes (recombinantes) e azuis (não recombinantes):

(

)

Figura 20 – Vector pBluescript II SK (+/-) utilizado na construção dos bancos de cDNA indicando os sítios de restrição para clonagem.

pBluescript II SK (+/-) (2958 bp) n T7 Kpn I Apa I Xho I Sal I Cla I Hind III EcoR V EcoR I Pst I Sma I BamH I Spe I Xba I Not I Eag I BstX I Sac II Sac I l T3

3.2.7.3 Amplificação dos bancos de cDNA

Para amplificação dos bancos de cDNA, alíquotas de cada banco foram misturadas com 600µl de células hospedeiras XL1-blue e incubadas a 37ºC durante 15min. A mistura foi adicionada a 10ml de Top agar como descrito anteriormente e plaqueada em placas de petri quadradas contendo meio NZY. As placas foram incubadas durante 8 horas a 37ºC após o que cada placa foi coberta com 8ml de tampão SM e armazenadas a 4ºc durante a noite para permitir a difusão dos fagos para o tampão. A suspensão foi então recuperada para um frasco estéril e foram adicionados mais 2ml de tampão SM a cada placa, também 3.2.7.2 Avaliação da dimensão dos insertos do banco de cdnA

Para a determinação do tamanho médio dos insertos, foram recolhidas aleatoriamente 10 placas transparentes a partir das placas de NZY. O plasmídeo pBluesript SK(+/-) (Figura 20) foi excisado in vitro e em seguida digerido com EcoRI e XhoI libertando desta forma os insertos aí contidos que foram fraccionados em gel agarose 0.8% com marcador 1Kb para determinação do tamanho aproximado.

recolhidos para o mesmo recipiente. A esta solução foi adicionado clorofórmio a uma concentração final de 5%, misturado e incubado à temperatura ambiente durante 15 min. Os restos celulares foram removidos por centrifugação (500g durante 10min. à temperatura ambiente) e o sobrenadante contendo o banco de cDNA amplificado transferido para um novo recipiente estéril. Os bancos foram armazenados a 4ºC com 0.3% clorofórmio ou a -80ºC com 7% DMSO. A titulação final foi calculada como descrito anteriormente.