Protocolo de hibridação

Todas as hibridações in situ foram efectuadas em amostras previamente seccionadas e montadas em lâminas. O material utilizado ao longo do processo foi previamente esterilizado por autoclavagem (121ºC durante 20 min) e mantido em condições de

Tabela 10 – Processo de transcrição in vitro com oligonucleótidos marcados com Digoxigenina e Biotina. Transcrição in vitro com nucleótidos marcados com digoxigenina e biotina, respectivamente para os clones F3bR3 e 3oV1

- O processo de purificação de DNA decorreu como descrito na Tabela 9.

- Transcrever com T7 RNA polimerase para um volume final de 20µl: Tampão de transcrição 5× concentrado, 5µl; dTT 100mM, 1µl; digoxigenin RNA labelling mix (F3BR3) ou biotin RNA labelling mix (3OV1), 2µl; BSA 10mg/ ml, 0.2µl; RNA guard, 0.5µl; DNA (digerido e purificado como descrito anteriormente), 2µl para cada uma das duas sondas produzidas; T7 RNA polimerase, 1µl; água estéril para um volume final de 20µl.

- Incubação a 37ºC, durante 2h.

- Paragem da reacção no gelo com 2µl de EDTA DEPC 0,2M, durante 2min.

- Precipitação com cloreto de lítio (LiCl) 4M (1:10) e etanol 100% gelado (2.5vol) durante 1h a -70ºC. - Centrifugação a 12000rpm a 4ºC, 20min.

- Lavagem do pellet 2× com etanol gelado a 75% e repetir a centrifugação anterior. - Secagem do pellet em gelo na hotte após o último sobrenadante ter sido retirado. - Ressuspenção em 25µl de água sigma.

esterilidade até ser utilizado. Será descrito o protocolo utilizado para a sonda F3BR3, marcada com digoxigenina e serão ressalvadas todas as alterações de processo quando necessárias para a sonda 3OV1. O protocolo resumido é apresentado na Tabela 11.

Desparafinação e hidratação

Inicialmente as lâminas passaram por xilol para remover na totalidade a parafina em que os tecidos foram incluídos na preparação dos blocos. De seguida, os cortes foram re-hidratados numa série de decrescente concentração de etanol. Para terminar esta fase inicial, as amostras foram lavadas em PTW estéril (anexo I), ficando assim preparadas para a fase seguinte.

No caso da sonda 3OV1, em que o anticorpo se encontrava conjugado com peroxidase, após a lavagem das amostras com etanol a 70%, foi feito um passo adicional com 3% H₂O₂ (30vol), com o objectivo de inactivar a peroxidase endógena presente nos tecidos. As amostras foram depois lavadas em água tratada com DEPC, antes de serem colocadas em PTW e seguirem um processo idêntico ao descrito anteriormente.

Pré-hibridação e Hibridação

Substituiu-se a solução de PTW por solução de hibridação (anexo I) previamente aquecida a 58ºC permanecendo as amostras aproximadamente 5h à mesma temperatura numa estufa de hibridação. Este passo denomina-se de pré-hibridação e é crucial para equilibrar as amostras com a solução de hibridação, garantindo uma melhor penetração das sondas para que possa ocorrer a ligação com o mRNA, bem como para evitar interacções não específicas quando a sonda for adicionada.

A hibridação foi feita com solução de hibridação contendo sonda e com as lâminas colocadas na horizontal, ficando os cortes cobertos pelas respectivas soluções dentro de uma caixa estanque. A esta caixa foi adicionada uma toalha de papel embebida em 20×SSC (anexo I), estando o topo da caixa coberto também por uma toalha de papel e por uma tampa de

plástico, evitando desta forma que a evaporação excessiva danificasse ou condicionasse o processo. A caixa fechada foi colocada dentro da estufa de hibridação a 58°C.

A hibridação ocorreu durante a noite a 58ºC, tendo sido usada uma diluição de 1µl:200µl da sonda F3BR3 (2µg/ml) em solução de hibridação também pré-aquecida. Para garantir que não havia evaporação da sonda alterando a sua concentração, cada corte foi individualmente coberto por uma tira de parafilme.

Lavagens

Após a hibridação, foram feitas as lavagens de estringência, para remover os restos de sonda não hibridada e para remover as possíveis ligações não específicas.

Inicialmente foi removido o parafilme com 2×SSC (anexo I) previamente aquecido a 58ºC. Foram realizadas três lavagens com 2×SSC e duas lavagens adicionais de estringência mais elevada (1×SSC) (todas elas a 58ºC).

Em seguida as amostras foram tratadas com RNase A (1mg/ml em 2×SSC), para que fossem removidos possíveis restos de sonda não hibridada ou associada ao tecido através de interacções não específicas. Este procedimento não afecta as cadeias duplas de mRNA que se formaram na hibridação (Jowett et al., 1996).

Para remover por completo a RNase A utilizada no passo anterior, as amostras foram lavadas em 2×SSC e 2% CHAPS, seguido de 2×SSC:PTW (1:1). A terminar este conjunto de lavagens, as amostras foram colocadas em PTW.

Reacções de bloqueação e de anticorpo

Esta reacção ocorreu com as lâminas na posição horizontal, estando cada corte coberto com a quantidade de solução necessária e suficiente para que ficassem completamente tapados. Deste modo, todas as secções presentes em cada lâmina estiveram cobertas por solução de bloqueação à qual se adicionou 10% de soro de ovelha (Sigma) (anexo I) durante 3h, antes de ser adicionado o anticorpo Anti-digoxigenine-FAB-fragments (Boheringer-

Maneihm), na proporção de 1:200 do stock original em solução de bloqueação e 10% de soro de ovelha. A incubação com o anticorpo ocorreu durante 1h:30min.

Para o caso da sonda 3OV1 utilizou-se o anticorpo Anti-biotin-whole-molecule conjugado com peroxidase, na proporção de 1:125 do stock original em solução de bloqueação e 10% de soro de ovelha. Após este passo, a única diferença que ocorre para a sonda 3OV1 está relacionada com o processo de revelação.

Revelação

Após terminado o período de incubação com anticorpo, as amostras foram lavadas em PTW e depois imersas em tampão de coloração (anexo I). A coloração ocorreu utilizando NBT e BCIP em conjunto, diluídos em tampão de coloração. A reacção ocorreu no escuro e com agitação, durante aproximadamente sete horas. No final do período de revelação, as amostras passaram por uma lavagem breve em PTW e foram fixadas em formol 4% em PTW (anexo I).

No caso das amostras tratadas com sonda marcada com biotina (3OV1), o tampão de coloração foi substituído por tris 50mM pH=7.2, quer na lavagem anterior à coloração, quer durante a revelação, em que 1.5 ml de DAB (1mg/ml) e 30µl de H₂O₂ (30vol.) foram adicionados a 30 ml de tris 50mM pH=7.2. Esta reacção ocorreu também no escuro e com agitação, durante aproximadamente cinco horas. Neste caso não foi feita fixação com formol a 4%, como indicado para a sonda F3BR3.

Tabela 11 – Principais passos do protocolo para a hibridação in situ

sonda F3bR3 sonda 3oV1

- Desparafinação e hidratação das amostras (Xilol - 2× 10min + 5min; 100% EtOH - 2× 5min; 96% EtOH - 1× 5min; 70% EtOH - 1× 5min).

- Lavagens em PTW - 2× 10min.

- Desparafinação e hidratação das amostras (Xilol - 2× 10min + 5min; 100% EtOH - 2× 5 min; 96% EtOH - 1× 5 min; 70% EtOH - 1× 5min).

- inactivação da peroxidase endógena (3% H2O2 (30vol) numa solução de 70% PBS:30% metanol - Lavagens em PTW - 2× 10min.

- Pré-hibridação com solução Hibridação previamente aquecida a 58ºC durante 5h.

- Hibridação – A solução de hibridação foi substituída por uma fresca a que foi adicionada 1µl da sonda F3BR3 e incubou-se durante a noite.

- Pré-hibridação com solução Hibridação previamente aquecida a 58ºC durante 5h.

- Hibridação – A solução de hibridação foi substituída por uma fresca a que foi adicionada 1µl da sonda 3OV1 e incubou-se durante a noite.

- Lavagens para remoção do excesso de sonda (2× SSC a 58ºC – 3 × 5min; 1×SSC a 58ºC – 2 × 5min) - Tratamento das amostras com Rnase A (1mg/ml em 2× SSC) durante 30 min.

- Lavagens para remoção dos restos de RNase A (2×SSC e 2% CHAPS – 2 × 10min + 5min; 2×SSC: PTW (1:1) – 5min; PTW – 5min)

- Lavagens para remoção do excesso de sonda (2× SSC a 58ºC – 3 × 5min; 1×SSC a 58ºC – 2 × 5min) - Tratamento das amostras com Rnase A (1mg/ml em 2× SSC) durante 30 min.

- Lavagens para remoção dos restos de RNase A (2×SSC e 2% CHAPS – 2 × 10min + 5min; 2×SSC: PTW (1:1) – 5min; PTW – 5min)

- Reacção de bloqueação (Solução de bloqueação + 10% soro de ovelha – 3h)

- Reacção de anticorpo (Solução de bloqueação + 10% soro de ovelha + Anti-digoxigenine-FAB-fragments – prop. 1:200 do stock original – 1h:30min

- Lavagens para remoção dos restos do anticorpo (PTW – 2× 10min)

- Lavagem em tampão de coloração (1× 10min)

- Reacção de bloqueação (Solução de bloqueação + 10% soro de ovelha – 3h)

- Reacção de anticorpo (Solução de bloqueação + 10% soro de ovelha + Anti-biotin-whole-molecule – prop. 1:200 do stock original – 1h:30min

- Lavagens para remoção dos restos do anticorpo (PTW – 2× 10 min)

- Lavagem em tris 50mM pH=7.2 (1× 10 min) - Coloração com NBT/BCIP em tampão de coloração

– 7h

- Coloração em 1.5 ml DAB (1mg/ml)/30µl de H2O2 (30vol.) em 30 ml de tris 50mM pH=7.2 – 5h - Lavagem em PTW – 5min

Reacção de contra coloração e preparação definitiva

Para a contra coloração as amostras foram passadas em PTW (2×5min) e de imediato colocadas em verde de metilo a 0.1% durante 12 minutos. Este corante marca especificamente o núcleo das células. Cada lâmina foi rapidamente passada por água destilada, cuidadosamente limpa e ligeiramente seca antes de colocada em 100% etanol durante aproximadamente 30 segundos para uma rápida desidratação. Para melhorar a transparência das lâminas e para preparar os tecidos para a preparação definitiva, estas passaram por duas lavagens em xilol com duração de 10 minutos cada e de seguida montadas em DPX (Fluka).

Durante a observação ao microscópio, as zonas que exibiam sinal positivo foram identificadas e fotografadas com uma câmara digital (Olympus - DP11) acoplada a um microscópio (Olympus - BH2).