Transcrição in vitro

O mRNA no tecido alvo encontra-se em cadeia simples no sentido sense que lhe permite ser traduzido nos ribossomas. Assim, para detectar com a técnica de hibridação in situ, a sonda é formada por uma cadeia simples complementar ao mRNA presente no tecido,

Tabela 7 – Protocolo detalhado dos dotblots realizados para confirmação da especificidade das sondas.

doTbLoTs

- Utilização de 1μl das minipreps 3OV1 e F3BR3 cada uma em duplicado. - Desnaturação das minipreps a 95ºC durante 5min.

- Colocar no gelo durante 5min.

- Transferir os plasmídeos desnaturados para duas membranas Hybond Nylon. Cada uma das minipreps foi colocada em ambas as membranas.

- Fixar o DNA às membranas por cross-linking, expondo as membranas a luz ultravioleta (5min). - Secar as membranas ao ar (15min).

- Lavar as membranas em PTW (2× 5min).

- Pré-hibridação em solução de pré-hibridação (30min).

- Hibridação de cada uma das membranas com uma das sondas durante 1:20h a 56ºC. - Lavagem das membranas em 2×SSC (2×3min a 56ºC).

- Lavagem das membranas em 1×SSC (3min a 56ºC). - Lavagem com SSC:CHAPS (3min à temperatura ambiente). - Lavagem com SSC:PTW (3min à temperatura ambiente). - Lavagem com PTW (3min à temperatura ambiente).

- Reacção de bloqueação com 10×sheep serum: 2% Bloking solution (20min à temperatura ambiente). - Reacção com os anticorpos específicos na concentração de 1:5000 em BS (30min à temperatura ambiente). - Lavagem com NaCl:Tris (2× 3min à temperatura ambiente).

- Revelação do sinal em tampão de coloração (15min à temperatura ambiente).

permitindo hibridação entre este e a sonda (sentido anti-sense). Só desta forma será possível que ambos os fragmentos possam hibridar um com o outro produzindo uma cadeia dupla de RNA que poderá ser posteriormente detectada pelos anticorpos.

Tabela 8 – protocolo de linearização das sondas.

Linearização da sonda F3bR3 Linearização da sonda 3oV1

DNA 150ng

Solução Tampão: Buffer J 10x (Promega) SMA I

Incubar durante 1h:30m a 37ºC

DNA 150ng

Solução Tampão: Buffer H 10x (Promega) ECOR I

As sondas de RNA foram produzidas por transcrição in vitro, tendo início nos fragmentos específicos de cDNA já referidos, inseridos no vector pBluescript, que contém regiões com promotores específicos para T7 RNA polimerase e T3 RNA polimerase. Para produzir RNA anti-sense, e devido às características de ambas as sondas, os fragmentos foram cortados apenas numa das extremidades de forma a permanecerem ligados ao vector na região do promotor T7, ficando lineares na extremidade 5’ do cDNA (transcrição run off). O vector recombinante F3BR3 foi linearizado com SmaI e o 3OV1 com EcoRI, de acordo com o protocolo indicado na Tabela 8. Após a digestão, o produto da reacção foi purificado como descrito na Tabela 9.

Inicialmente, para confirmar a qualidade e quantidade do DNA usado na transcrição in vitro, as reacções foram efectuadas utilizando diversas concentrações de DNA linear e nucleótidos (NTPs) não marcados.

Tabela 9 – Preparação do DNA e transcrição in vitro com oligonucleótidos não marcados.

TRAnsCRição in ViTRo CoM os oLiGonUCLEóTidos dE RnA não MARCAdos

- Digestão dos clones F3BR3 e 3OV1 com as enzimas de restrição SmaI e EcoRI, respectivamente, para um volume final de reacção de 20µl, durante 1h:30m a 37ºC.

- Após a reacção foram adicionados 100µl de água estéril.

- A reacção foi misturada com 100µl de fenol-cloroformio equilibrado com tampão tris e agitada num vórtex. Permaneceu à temperatura ambiente durante 35min.

- A solução foi centrifugada a 1000rpm durante 10min, à temperatura ambiente, para separação das duas fases. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo estéril.

- O DNA foi precipitado com acetato de sódio (NaAc) a 3M, pH-5.2 (1:10 do volume da reacção) e com etanol gelado a 100% na proporção de 2.5× o volume da solução (aproximadamente 120µl). Decorreu durante 1h a -70ºC. - A solução foi centrifugação a 10000rpm durante 25min

- Após retirar o sobrenadante, o pellet foi lavado com etanol gelado 75% 2× e centrifugar de cada vez. - O pellet foi seco ao ar e ressuspenso em 40µl de água ultra pura (Sigma).

- Transcrição com T7 RNA polimerase para um volume final de 20µl: Tampão de transcrição 5× concentrado, 5µl; dTT 100mM, 1µl; NTPmix, 5µl; BSA 10mg/ml, 0.2µl; RNA guard, 0.5µl; DNA (digerido e purificado como descrito anteriormente), 2µl e 4µl para cada uma das duas misturas testadas; T7 RNA polimerase, 1µl; água estéril para um volume final de 20µl.

- Incubação durante 2h a 37ºC

- Paragem da reacção no gelo com 2µl de EDTA DEPC 0.2M, durante 2 min.

- Precipitação com cloreto de lítio (LiCl) 4M (1:10) e Etanol 100% gelado (2.5vol) durante 1h a -70ºC. - Centrifugar a 12000rpm a 4ºC, 20min.

- Lavagem do pellet 2× com etanol gelado a 75% com centrifugação de cada vez. - Secagem do pellet, mantendo-o em gelo, após retirado o sobrenadante. - Ressuspenção em 25µl de água ultra pura (Sigma).

Após a transcrição inicial feita com NTPs para optimizar as condições de síntese, os nucleótidos foram substituídos por uma mistura de NTPs que inclui UTP marcado com digoxigenina (digoxigenin RNA labelling mix - Roche) para a sonda do cérebro (F3BR3) e por biotina (biotin RNA labelling mix - Roche) para a sonda do ovário (3OV1).

Figura 30 – Vector pBluescript II SK (+/-) utilizado na construção dos bancos de cDNA. Na figura é indicado o multiple cloning site e a cinzento é identificado o local de inserção do inserto.

pBluescript II SK (+/-) (2958 bp) n T7 Kpn I Apa I Xho I Sal I Cla I Hind III EcoR V EcoR I Pst I Sma I BamH I Spe I Xba I Not I Eag I BstX I Sac II Sac I l T3

A síntese foi feita usando a enzima T7-RNA polymerase e incubada durante duas horas a 37°C. Após terminada a reacção, a ribossonda foi precipitada e o pellet obtido foi ressuspendido em 25µl de água ultra pura (Sigma) de acordo com o protocolo descrito na Tabela 10.

A avaliação da qualidade e da quantidade de ambas as sondas foi feita por electroforese num gel de agarose (Promega) a 0.8% em tampão TBE preparado com água DEPC, a uma corrente constante de 70 volts. Este processo de visualização permite obter uma avaliação qualitativa da concentração de ambas as sondas, essencial na avaliação da quantidade de sonda a usar durante a hibridação. Todo o material utilizado na electroforese foi previamente lavado em 1% SDS durante 20 min, tendo depois sido lavado com água DEPC, para garantir a completa eliminação de possíveis RNases.