Conclus ˜ao - Dinâmica molecular de celulases : estudos de reconhecimento de substrato e propri

A endoglucanase 3 de Trichoderma harzianum (ThEG3) apresenta uma estrutura sem dom´ınio de ligaç ão ao carboidrato. Sabendo que este dom´ınio é importante na hidr ólise da celulose, o alvo deste trabalho foi entender que parte da estrutura é respons ável pela funç ão de um CBM. As simulaç ões de din âmica molecular foram realizadas com ThEG3 e o CBM da endoglucanase C de Cel- lulomonas fimi (CfCBM).

Os modelos da estrutura da ThEG3 complexada com a celotetraose e a celopentaose foram gerados usando estruturas cristalogr áficas de prote´ınas dispon´ıveis de enovelamento semelhante ligadas a estes substratos. As simulaç ões sugerem que a aus ência de um CBM na estrutura da ThEG3 é compensada pela presença de res´ıduos similares a res´ıduos de um CBM que reconhecem o

Figura 4.6. As estruturas alinhadas das endoglucanases da fam´ılia 12. Os nomes se referem aos nomes dos organismos que produzem as enzimas represen- tadas. Res´ıduos arom ´aticos representados como barras. A: As endoglucanases da

fam´ılia 12 com CBM.B: As endoglucanases da fam´ılia 12 sem CBM.

substrato.

Al ém da explicaç ão da atividade da ThEG3 na aus ência de CBM, aqui foi explicado porque esta enzima age em substratos de no m´ınimo cinco unidades glicos´ıdicas. A tr´ıade catal´ıtica é espacialmente longe dos res´ıduos arom áticos que mostram-se importantes na interaç ão enzima-substrato, e por isso o substrato precisa ter um comprimento m´ınimo. Este resultado fornece uma base molecular para a observaç ão experimental de que a enzima n ão hidrolisa efi- cientemente oligossacar´ıdeos curtos como a celotriose.

Cap´ıtulo 5

Seletividade da Endoglucanase de

Xanthomonas campestris pv.

campestris

5.1 Introduc¸ ˜ao

A seletividade das celulases é um ponto importante no mecanismo de hidr ólise destas enzimas. Ela pode ser exibida em relaç ão ao tipo de substrato, ramifi- cado ou n ão, cristalino ou sol úvel, etc. Quando se trata de substrato sol úvel, oligossacar´ıdeo, a seletividade pode ser exibida em relaç ão ao seu comprimento. As celulases que clivam uma faixa larga de comprimentos de substrato poderiam ser mais eficazes que as seletivas porque s ão capazes de promover hidr ólise de substrato e, em segu´ıda, de seus produtos em v ários passos consecutivos. Desta forma a mesma enzima é reaproveitada para a hidr ólise de substratos de comprimentos diferentes. Por outro lado, uma es- pecificidade pode ser a propriedade desejada na natureza ou nos processos in- dustriais. Por exemplo, as β-glicosidases s ão seletivas para aç ão em celobiose, o oligossacar´ıdeo de duas unidades, e atuam em sinergismo com as endo e exoglucanases concluindo o processo de produç ão de glicose na ind ústria de bioetanol.

Os estudos da base molecular da seletividade de comprimento do substrato referem-se principalmente à estrutura da enzima, ao arranjo dos amino ácidos dentro dos subs´ıtios de ligaç ão. Um exemplo foi apresentado no Cap´ıtulo 4 desta tese. A explicaç ão da seletividade foi o arranjo espacial relativo entre os subs´ıtios diferentes. O s´ıtio ativo é espacialmente longe dos res´ıduos arom áticos que mostram-se importantes na interaç ão enzima-substrato, e por isso o substrato precisa ter um comprimento m´ınimo de cinco unidades glicos´ıdicas.

Um estudo de atividade e cristalografia da glicosidase de Streptococcus mutans mostra que esta enzima liga-se aos substratos mais longos al ém da celobiose e mostra as diferenças estruturais entre ela e outras glicosidases da mesma fam´ılia [68]. A glicosidase de Streptococcus mutans n ão apresenta um impedimento est érico para a interaç ão com substratos longos realizado por um loop longo na entrada do bols ão catal´ıtico existente em outras enzimas da fam´ılia. Ela tamb ém apresenta um res´ıduo arom ático no subs´ıtio +2, W238, que é relacionado aos substratos longos. Os ensaios de atividade dos mutantes da regi ão do res´ıduo arom ático e tamb ém da regi ão do loop foram consistentes com as observaç ões estruturais. Ambos os mutantes, o que n ão cont ém o res´ıduo arom ático caracter´ıstico e o com o loop trocado por um maior exibiram atividade menor em substratos longos.

Alguns subs´ıtios de ligaç ão mostram-se mais importantes que outros, como no estudo combinado de cristalografia e atividade enzim ática da endoglucanase D de Clostridium cellulovorans [69]. Estudos de cromatografia de produtos da hidr ólise mostram que a enzima cliva preferencialmente substratos de quatro ou mais unidades glicos´ıdicas. Na estrutura cristalogr áfica do complexo enzima- celotriose, tr ês subs´ıtios da enzima no lado n ão-redutor s ão ocupados e os do lado redutor desocupados pelo substrato. Nesta posiç ão o substrato n ão é cli-

vado. Foi sugerido que estes tr ês subs´ıtios exibem alta afinidade por substrato e que, independentemente do comprimento do substrato, eles s ão sempre ocupados. Assim, um substrato precisa ter no m´ınimo quatro unidades de comprimento para alcançar os subs´ıtios do lado redutor, ou seja, realizar contato com o s´ıtio ativo e assim ser hidrolisado.

Neste cap´ıtulo, procuramos explicar o princ´ıpio da seletividade de uma endoglucanase da origem bacteriana, a Endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. campestris (XccEG). Esta enzima cliva preferencialmente substrato de quatro ou mais unidades glicos´ıdicas. Estudos utilizando eletroforese capilar [58] mostraram que a enzima é capaz de promover a hidr ólise de dois oligossacar´ıdeos formados por cinco e seis unidades de glicose. Inicialmente, os dois polissacar´ıdeos marcados anteriormente com a sonda fluorescente 8-aminopireno- 1,3,6- ácido trisulfonico (APTS) foram submetidos a hidr ólise enzim ática. Os seus produtos foram observados por espectroscopia de fluoresc ência atrav és de excitaç ão a 488 nm e as emiss ões coletadas a 520 nm. Podemos observar, Figura 5.1, que o polissacar´ıdeo contendo cinco glicoses foi hidrolisado liberando uma mol écula com duas unidades de glicose e a enzima n ão foi capaz de hidrolisar o substrato restante, com tr ês glicoses (C3). No caso que tem substrato formado por seis unidades de glicose, observamos o mesmo padr ão de hidr ólise (liberando C2), s ó que neste caso o substrato restante de quatro unidades de glicose (C4) ainda foi reduzido a C2. Por ém, a clivagem do C3, que tamb ém foi formado, n ão teve continuidade pela aç ão da enzima. Com o resultado da hidr ólise destes oligossacar´ıdeos, é poss´ıvel concluir que o substrato precisa ter no m´ınimo quatro unidades de glicose para ser hidrolisado pela enzima, j á que nos dois casos, quando o substrato foi reduzido a C3, este se manteve mesmo nos casos em que enzima e substrato ficaram incubados por tempos mais longos. Al ém disso, podemos observar que a XccEG cliva no

Figura 5.1. Espectros de Eletroforese capilar de oligossacar´ıdeos marcados com APTS: Hidr ólise completa de oligossacar´ıdeo formado por cinco (A) e seis (B) glicoses. Os dois oligossacar´ıdeos est ão marcados com APTS pela extremidade n ão- redutora e os s´ımbolos C6, C5, C4, C3 e C2 indicam o grau de polimerizaç ão dos olig ômeros de glicose.

m´ınimo duas unidades da extremidade do substrato. O esquema desta seletividade ´e representado na Figura 5.2.

5.2 Simulac¸ ˜oes

Para investigar ao n´ıvel molecular a seletividade da Endoglucanase de Xan- thomonas campestris pv. campestris (XccEG), simulaç ões de Din âmica Molec- ular foram feitas em complexos com substrato de comprimento m´ınimo para o qual a enzima é ativa, ou seja a celotetraose, e com substratos mais curtos, a celobiose e a celotriose. A estrutura cristalogr áfica da XccEG isenta de sub-

Figura 5.2. Esquema de seletividade de XccEG. A XccEG n ˜ao cliva cadeias menores que quatro unidades glicos´ıdicas e n ˜ao cliva uma unidade da extremidade de cadeia.

strato foi utilizada como ponto de partida para as simulaç ões. Modelos para a XccEG com substratos foram gerados por meio da docagem de celotetraose dentro da fenda atrav és do alinhamento com a enzima da mesma fam´ılia, a fam´ılia 5 de glicosidases, a Endoglucanase E1 de Acidothermus cellulolyticus (pdb: 1ECE, [70]), Figura 5.3A, atrav és do programa VMD [34]. O alinhamento estrutural das duas prote´ınas foi feito por minimizaç ão do valor de RMSD entre as duas estruturas, usando o programa VMD [34].

Como j á mencionado anteriormente, os subs´ıtios das enzimas onde se ligam as unidades glicos´ıdicas do carboidrato s ão enumeradas por inteiros positivos do lado redutor do ponto de clivagem e de n úmeros inteiros negativos do lado n ão-redutor do ponto de clivagem. No caso da celotetraose os subs´ıtios s ão: -2,-1,+1 e +2. Da mesma maneira s ão denominadas as unidades do substrato, Figura 5.3B. Os demais tr ês sistemas foram obtidos cortando a celotetraose: uma celobiose, uma celotriose na posiç ão -2-1+1 e uma celotriose na posiç ão -1+1+2.

foram realizadas: XccEG sem substrato, XccEG com celotetraose, XccEG com celotriose na posiç ão -2-1+1, XccEG com celotriose na posiç ão -1+1+2 e Xc- cEG com celobiose. Os sistemas foram tratados no ensemble NPT à temper- atura de 298K e press ão de 1atm. As interaç ões de curta alcance, de van der Waals, n ão foram consideradas acima de raio de 12 ˚A e a funç ão suavizante foi empregada a partir de 10 ˚A. De acordo com suas funç ões na cat álise [5], o catalisador ácido Glu182 foi considerado protonado, o nucle ófilo Glu303 desprotonado e o res´ıduo auxiliador Tyr263 protonado. Isso porque sabe-se que em sistema real existe uma ligaç ão de hidrog ênio entre o grupo -OH do catalisador ácido (glutamato ou aspartato) e o oxig ênio glicos´ıdico do carboidrato para garantir a doaç ão de pr óton. O nucle ófilo ataca o carbono anom érico do substrato e por isso é tratado como desprotonado, e o auxiliador forma ligaç ão de hidrog ênio com o nucle ófilo mantendo-o na posiç ão favor ável para cat álise [5]. Uma caixa de simulaç ão c úbica, de lado de 80 ˚A, foi constru´ıda, contendo uma mol écula de XccEG, substrato em casos de simulaç ões com substrato e 0.16M NaCl de densidade de 1g/cm3_{, usando o programa Packmol [71]. A dist ância}

entre o oxig ênio do grupo -OH do catalisador ácido Glu182 e o oxig ênio glicos´ıdico da celotetraose é 3.61 ˚A, Figura 5.3B, enquanto na estrutura original (1ECE.pdb) é 3.02 ˚A.

Para os sistemas com substrato, as partes de simulaç ão para c álculos de propriedades que se referem às interaç ões com substrato, como mobilidade de loops e energia de interaç ão, foram escolhidas assim que satisfaçam ambas as condiç ões - de valor RMSD atingir patamar, e de substrato ainda estar presente na fenda da prote´ına. A Figura 5.4 mostra a dist ância entre o oxig ênio do grupo -OH de Glu182 e o oxig ênio glicos´ıdico de substrato. A Figura 5.5 mostra o RMSD para todas as simulaç ões de todos os sistemas contendo substrato. A tabela 5.1 mostra os intervalos de tempo escolhidos para an álises com base

nos valores de RMSD e da dist ância entre o oxig ênio do grupo -OH de Glu182 e o oxig ênio glicos´ıdico. A energia de interaç ão enzima-substrato foi calculada

Figura 5.3. Docagem da celotetraose. A: XccEG (cor de laranja) alinhada

com a endoglucanase E1 de Acidothermus cellulolyticus (azul). O substrato cristalizado em complexo com a endoglucanase E1 de Acidothermus cellulolyticusB: Esquema da

posic¸ ˜ao da celotetraose dentro da fenda da XccEG.

como soma de energia potencial de van der Waals e a energia eletrost ´atica entre cada res´ıduo do substrato e cada res´ıduo da enzima.

Tabela 5.1. Trechos das simulaç ões usadas nos c álculos das propriedades m édias do sistema, determinadas com as an álises de RMSD e a dist ância entre o oxig ênio do grupo -OH de Glu182 e o oxig ênio glicos´ıdico de substrato.

sistema/simulac¸ ˜ao sim A sim B sim C

celobiose (8-15)ns (1-4)ns (6-10)ns

celotriose-2-1+1 (1-3)ns (8-13)ns (1-5)ns

celotriose-1+1+2 (8-13)ns (8-14)ns (1-3)ns

Figura 5.4. A evoluç ão temporas da dist ância entre o oxig ênio do grupo - OH de Glu182 e o oxig ênio glicos´ıdico de substrato para todos os sistemas simulados contendo substrato. Algumas curvas s ão interrompidas por falta de espaço no eixo y.

5.3 Resultados e discuss ˜oes

Seletividade confirmada nas simulaç ões. As simulaç ões mostram que os subs´ıtios curtos perdem contato com a fenda catal´ıtica e consequentemente poderiam perder a chance de serem hidrolisados. O substrato foi considerado presente na fenda da prote´ına quando a dist ância entre o oxig ênio do grupo -OH do catalisador ácido Glu182 e o oxig ênio glicos´ıdico de substrato fosse menor que 4 ˚A [8]. Esta dist ância foi escolhida como a soma da dist ância necess ária para o catalisador formar ligaç ão de hidrog ênio com o oxig ênio glicos´ıdico (3 ˚A)

Figura 5.5. RMSD para todos os sistemas simulados contendo substrato.

e uma amplitude de flutuaç ões temporais (1 ˚A). A docagem da celotetraose feita por alinhamento com a estrutura 1ECE.pdb, Figura 5.3B, fornece uma posiç ão favor ável para o ataque à ligaç ão glicos´ıdica pelo catalisador ácido [5]. Durante as simulaç ões com a celotetraose, esta dist ância flutua ao redor do valor inicial, Figura 5.6A, o que mostra a presença da celotetraose dentro da fenda catal´ıtica. Al ém disso, existe ligaç ão de hidrog ênio com a probabilidade de 28.3 % entre o catalisador ácido e o oxig ênio glicos´ıdico. Os esquemas dos substratos s ão mostrados de baixo dos gr áficos na Figura 5.6. No caso dos substratos curtos, esta dist ância enzima-substrato aumenta em tempo menor.

Figura 5.6. A: A dist ˆancia entre oxig ˆenio do grupo -OH de Glu182 e

oxig ênio glicos´ıdico de substrato durante as simulaç ões, para sistemas com celobiose, celotriose-2-1+1, celotriose-1+1+2 e a celotetraose. B: N úmero de átomos de cada

unidade de substrato a 4 ˚A de cada subs´ıtio, em relaç ão à estrutura inicial docada. Subs´ıtios foram definidos pelo crit ério de energia de < -5kcal/mol, Figura 5.7.C: RMSD

de cada substrato em relaç ão à estrutura inicial. As linhas vermelhas foram obtidas como a m édia de blocos de 20 pontos da curva que representa as propriedades m édias das tr ês simulaç ões. Algumas curvas s ão interrompidas por falta de espaço no eixo y.

Tamb ém foi feita uma contagem dos átomos de cada unidade de substrato a 4 ˚A ao redor de cada subs´ıtio ao longo do tempo, Figura 5.6B. A soma destes n úmeros para cada subs´ıtio foi dividida pela soma inicial, referindo-se à estrutura inicial docada. Primeiro, os subs´ıtios foram definidos pelo crit ério de energia de interaç ão com substrato de < -5kcal/mol. A Figura 5.7 mostra

Figura 5.7. Energia das interaç ões EGXc-celotetraose para cada um dos subs´ıtios. Est ão destacados loops compartilhados entre subs´ıtios diferentes.

a energia de interaç ão enzima-substrato entre a prote´ına e cada unidade da celotetraose. A energia da interaç ão entre a XccEG e cada um dos subs´ıtios da celotetraose foi calculada. Por exemplo, entre a unidade -2 da celotetraose e todos os res´ıduos da enzima. Esta analise foi feita somente para o sistema em equil´ıbrio contendo a celotetraose, Tabela 5.1. O crit ério de energia foi es- colhido com base nas energias calculadas de modo que cada um dos subs´ıtios contenha pelo menos um res´ıduo. A hip ótese é que os subs´ıtios ocupados pe- los substratos curtos interagem da mesma maneira que os respectivos subs´ıtios com a celotetraose. A energia calculada representa energia de interaç ão n ão- covalente entre cada res´ıduo da enzima e cada unidade de substrato, como m édia no tempo de simulaç ão. Os res´ıduos relevantes s ão aqueles cuja energia de interaç ão com substrato é negativa. Escolhendo os res´ıduos da prote´ına que representam a energia de interaç ão menor que -5kcal/mol com uma certa

unidade de substrato, o subs´ıtio da prote´ına que refere-se a esta unidade de substrato foi localizado. Assim o n úmero de átomos do substrato ao redor do subs´ıtio identificado foi determinado. A celotetraose mantem inalternado o n úmero de res´ıduos interagentes com os subs´ıtios da enzima.

O RMSD de cada substrato foi calculado durante as simulaç ões em relaç ão às estruturas iniciais docadas. Em cada sistema, a prote´ına foi alinhada com ela mesma ao longo do tempo ao fim de calcular o RMSD do substrato, Figura 5.6C. Os substratos curtos, a celobiose e as duas celotrioses, mudam consider- avelmente a posiç ão, enquanto a celotetraose exibe RMSD de valor baixo, em torno de 1 ˚A, durante a maior parte do tempo.

Com base nos resultados da Figura 5.6, a celotetraose mant ém a dist ância da enzima mais curta, o n úmero de átomos dentro da fenda maior e o valor de RMSD mais baixo em comparaç ão com os substratos mais curtos. Aparente- mente, a celotetraose exibe a menor tend ência de perder contato com a enzima. Os substratos mais curtos, independentemente da posiç ão, afastam-se do s´ıtio ativo. Aparentemente, a exist ência simult ânea das interaç ões nos dois subs´ıtios -2 e +2 é importante para a fixaç ão do substrato à fenda catal´ıtica da XccEG. Aqui, os resultados te óricos concordam com os experimentais quanto a ligaç ão ao substrato que é a condiç ão necess ária para a hidr ólise. Os substratos mais curtos que quatro unidades perdem contato com a enzima. Se- gundo nossas simulaç ões, a celotriose poderia ocupar igualmente a posiç ão -2-1+1 e a posiç ão -1+1+2. Em nenhum dos casos, a celotriose estaria em posiç ão de ser clivada corroborando os ensaios enzim áticos.

Mobilidade da fenda catal´ıtica. Os loops s ão regi ões de enzimas bastante importantes para interaç ão com substrato, sendo regi ões mais m óveis e capazes de mudar a conformaç ão de enzima para receber ou soltar o substrato. Normalmente encontram-se na superf´ıcie da prote´ına onde h á acesso f ácil para

o substrato. A fenda de ligaç ão ao substrato da XccEG consiste em seis loops. Calculando energia de interaç ão com a celotetraose, vemos que 84% desta energia pertence aos seis loops, Figura 5.7. No resto, s ão inclu´ıdos res´ıduos catal´ıticos, Glu303 e Tyr263, que normalmente encontram-se em regi ões menos m óveis da prote´ına.

A Figura 5.8 mostra a mobilidade dos seis loops da fenda da XccEG durante o tempo de simulaç ão e a escala de cores que se refere ao valor RMSF dos res´ıduos calculado por blocos de 300ps. Na medida que o n úmero de

Figura 5.8. Mobilidade dos loops da fenda. Os substratos s ˜ao representados em n ´uvens brancas. A- sem substrato, B- celobiose, C- celotriose-2-1+1, D- celotriose- 1+1+2, E- celotetraose.

subs´ıtios ocupados por substrato aumenta, a mobilidade dos loops diminui. Em outras palavras, os loops s ão estabilizados pelas interaç ões com substrato. É necess ário estabilizar os loops dos quatro subs´ıtios da fenda da enzima para o substrato permanecer interagindo com a enzima. Como a XccEG exibe atividade muito maior em celotetraose do que em substratos curtos, como mostram

Figura 5.9. XccEG possui somente 4 subs´ıtios para ligar `a celulose.

os dados de eletroforese capilar, estes resultados te óricos sugerem que é pre- ciso estabilizar os loops dos quatro subs´ıtios da fenda para estabilizar o substrato em posiç ão adequada para a hidr ólise.

Se observarmos a estrutura terci ária da XccEG, entenderemos porque é necess ário estabilizar exatamente quatro e n ão mais subs´ıtios da enzima, Figura 5.9: a enzima é composta por quatro subs´ıtios de ligaç ão à celulose. Em lugar do hipot ético subs´ıtio -3 encontra-se o loop5 que por meio da sua posiç ão bloqueia entrada do substrato na fenda, ou seja, ele forma a extremidade da fenda. No outro lado, em lugar do hipot ético subs´ıtio +3 n ão existem interaç ões com substrato, sendo este lugar o final da fenda da enzima. A XccEG poderia catalisar hidr ólise de cadeias mais longas que quatro unidades glicos´ıdicas. No lado positivo da fenda n ão existe impedimento espacial para substratos longos e no lado negativo um substrato longo poderia interagir com a enzima em uma conformaç ão curvada de forma que evite a barreira espacial do loop5.

Para entender como a mobilidade dos subs´ıtios desocupados por substrato

No documento Dinâmica molecular de celulases : estudos de reconhecimento de substrato e propriedades conformacionais (páginas 78-121)