Posic¸ ˜ao e comprimento do substrato. Ap ´os as simulac¸ ˜oes realizadas com os quatro sistemas da ThEG3, a saber: sem substrato, com a celotetraose, com a celopentaose e com a celopentaose*, o comportamento dos substratos durante o tempo de simulac¸ ˜ao foi monitorado. A Figura 4.4 mostra a posic¸ ˜ao dos tr ˆes substratos em relac¸ ˜ao aos res´ıduos catal´ıticos e an ´eis arom ´aticos da ThEG3, Tyr7, Trp23 e Tyr112, como sobreposic¸ ˜ao de instantes da simulac¸ ˜ao. Na aus ˆencia do substrato (apo-ThEG3) os tr ˆes an ´eis arom ´aticos s ˜ao livres para
executarem movimentos de larga amplitude.
No complexo com a celotetraose (ThEG3-tt), a celotetraose est ´a adequada- mente posicionada em relac¸ ˜ao `a tr´ıade catal´ıtica (representada em amarelo), mas n ˜ao ´e longa o suficiente para interagir simultaneamente com os tr ˆes res´ıduos arom ´aticos. Neste sistema, dois dos tr ˆes res´ıduos arom ´aticos que n ˜ao inter- agem com a celotetraose executam movimentos de amplitude maior ainda do que no sistema apo-ThEG3.
No complexo com a celopentaose (ThEG3-pt), por outro lado, o substrato interage com os tr ˆes res´ıduos arom ´aticos na entrada da fenda, mas a ligac¸ ˜ao glicos´ıdica mais pr ´oxima ainda est ´a longe do s´ıtio ativo. Na simulac¸ ˜ao deste complexo, os res´ıduos arom ´aticos permanecem ligados ao substrato, mesmo quando o substrato afasta-se da tr´ıade catal´ıtica e quase sai da fenda da en- zima. Assim a import ˆancia dos an ´eis arom ´aticos na ligac¸ ˜ao ao substrato est ´a confirmada.
No complexo ThEG3-pt*, entretanto, a posic¸ ˜ao inicial e comprimento do sub- strato permite tanto a interac¸ ˜ao com os res´ıduos arom ´aticos quanto com os res´ıduos catal´ıticos. Percebemos que, para uma ligac¸ ˜ao enzima-substrato efe- tiva, a posic¸ ˜ao e o comprimento do substrato t ˆem papel determinante. O com- primento m´ınimo de substrato ´e de cinco unidades glicos´ıdicas. Tomando os dados experimentais da atividade catal´ıtica da TrEG3 como os dados faltantes da ThEG3, este comportamento concorda com a atividade hidrol´ıtica de TrEG3 - ela age apenas em oligossacar´ıdeos maiores que quatro unidades glicos´ıdicas [61]. Deste modo, as simulac¸ ˜oes sugerem que a efici ˆencia catal´ıtica da ThEG3 depende de um tamanho m´ınimo do substrato que permita uma posic¸ ˜ao ade- quada na fenda.
Func¸ ˜ao do CBM. An ´alises comparativas de estrutura e de simulac¸ ˜oes de MD dos complexos ThEG3-pt* e CfCBM-celopentaose foram realizadas na procura
Figura 4.4. Movimentos dos res´ıduos arom ´aticos e substratos est ˜ao apresen- tados por instantes sobrepostos das simulac¸ ˜oes coloridos em uma escala da vermelho
`a azul de acordo com o tempo de trajet ´oria.
de similaridades na interac¸ ˜ao com substrato e poss´ıvel explicac¸ ˜ao da ativi- dade da ThEG3 sem o dom´ınio CBM. Tanto a inspec¸ ˜ao da estrutura, quanto as an ´alises das simulac¸ ˜oes revelam que v ´arios res´ıduos da ThEG3 e CfCBM exibem pap ´eis similares na interac¸ ˜ao com o substrato. Uma an ´alise foi feita das interac¸ ˜oes n ˜ao-covalentes com substrato, considerando contatos hidrof ´obicos e ligac¸ ˜oes de hidrog ˆenio. A Figura 4.5 mostra os res´ıduos das duas prote´ınas que interagem hidrofobicamente (A) e hidrofilicamente (B) com o substrato com frequ ˆencia no tempo acima de 50% e 10%, respectivamente. O crit ´erio de ligac¸ ˜ao de hidrog ˆenio ´e geom ´etrico, como descrito na Sec¸ ˜ao 3.3 da Metodolo- gia e os contatos hidrof ´obicos foram considerados existentes se qualquer ´atomo
Figura 4.5. A: Res´ıduos em contato hidrof ´obico com substratos por mais
do que 50 % do tempo de simulac¸ ˜ao. B: Res´ıduos que interagem via ligac¸ ˜oes de
hidrog ˆenio com o substrato por, pelo menos, 10 % do tempo de simulac¸ ˜ao. C´ırculos de mesmas cores destacam res´ıduos em posic¸ ˜oes e pap ´eis correspondentes nas interac¸ ˜oes prote´ına-substrato nas duas prote´ınas, ThEG3 e CfCBM.
pesado de um res´ıduos de prote´ına encontra-se a dist ˆancia de 5 ˚A de qualquer ´atomo pesado do substrato. Os tr ˆes res´ıduos arom ´aticos da ThEG3 identifi- cados como importantes, Y7, W23, Y112, mimetizam os res´ıduos Y19, Y43 e Y85 em termos de posic¸ ˜ao e func¸ ˜ao na CfCBM e os res´ıduos N152 e E201 mimetizam N81 e R75.
Outras enzimas sem CBM. Este mecanismo de interac¸ ˜ao com substrato na aus ˆencia do dom´ınio CBM pode ser o mesmo para outras glicosidades da estru- tura terci ´aria similar `a estrutura da ThEG3, as glicosidases da fam´ılia 12, [66]. As estruturas de todas as glicosidades desta fam´ılia que t ˆem sua estrutura re- solvida com a resoluc¸ ˜ao at ˆomica, [18, 66] foram comparadas. Estas estruturas s ˜ao separadas em dois grupos: que cont ´em CBM e que n ˜ao cont ´em CBM.
Trata-se de endoglucanases em todos os casos, exceto a xilo-endoglucanase XEG de Aspergillus aculeatus, Figura 4.6B, que atua em substratos ramificados como xiloglucano, al ´em na celulose. Ap ´os alinhamento estrutural, foi procurado um padr ˜ao de res´ıduos arom ´aticos na mesma posic¸ ˜ao dos res´ıduos arom ´aticos que formam contatos com substrato com a maior frequ ˆencia na ThEG3, os res´ıduos Y112, Y23 e Y7. A Figura 4.6 mostra que as endoglucanases con- tendo CBM podem ou n ˜ao conter tamb ´em os tr ˆes res´ıduos arom ´aticos carac- ter´ısticos, mas no caso das endoglucanases sem CBM, elas sempre cont ˆem os tr ˆes res´ıduos arom ´aticos. A excec¸ ˜ao ´e a xilo-endoglucanase XEG de As- pergillus aculeatus, Figura 4.6B, que cont ´em dois dos tr ˆes res´ıduos arom ´aticos caracter´ısticos. Ela interage com substratos ramificados [67] e pode apresentar um mecanismo de ligac¸ ˜ao diferente. Para ligar aos substratos ramificados deve possuir mais s´ıtios de ligac¸ ˜ao, e assim conter v ´arios outros res´ıduos de ligac¸ ˜ao ao substrato al ´em dos dois res´ıduos arom ´aticos.