Uma caracter´ıstica geral da maioria das celulases ´e a estrutura modular, incluindo m ´odulo catal´ıtico CCD e m ´odulo de ligac¸ ˜ao ao carboidrato CBM. A func¸ ˜ao e o mecanismo de CBM s ˜ao ainda muito pouco compreendidos. Sabe- se que os CBMs t ˆem papel importante na afinidade da enzima pela celulose [16]. Por exemplo, a endoglucanase 2 e a endoglucanase 5 de Thermomonospora fusca expressa sem CBM exibe uma reduc¸ ˜ao significativa tanto na atividade quanto na capacidade de interagir com a celulose cristalina [17]. A atividade foi determinada incubando enzimas com o substrato e medindo a quantidade de ac¸ ´ucares redutores que s ˜ao produto da reac¸ ˜ao da hidr ´olise. Para os ensaios da capacidade de interac¸ ˜ao, soluc¸ ˜ao das enzimas foi misturada com a celulose cristalina e incubadas. Depois, a quantidade de enzima livre em soluc¸ ˜ao foi medida com os ensaios de atividade.
Acredita-se que CBM reconhece e liga-se `a superf´ıcie celul ´osica, separa uma cadeia da celulose disponibilizando para o CCD. Simulac¸ ˜oes de MD re- alizadas somente com CBM da celobiohidrolase I do fungo Trichoderma ree- sei mostram que o CBM movimenta-se livremente na superf´ıcie da celulose e muda de conformac¸ ˜ao quando encontra a extremidade redutora da celulose. Tr ˆes res´ıduos de tirosina formam interac¸ ˜oes hidrof ´obicas com a superf´ıcie da
celulose possibilitando movimentos em ambas as direc¸ ˜oes, perpendicular e par- alela, mas ao mesmo tempo sendo firmemente ligados `a superf´ıcie. Depois de uma torc¸ ˜ao da extremidade redutora do substrato, o CBM interage atrav ´es da quarta tirosina com a extremidade redutora. Supostamente, a mudanc¸a confor- macional do substrato ´e necess ´aria para reconhecimento pela enzima [55].
A vantagem de CBM verificou-se diminu´ıda pela reduc¸ ˜ao da quantidade de ´agua no sistema hidrol´ıtico [56]. Em uma soluc¸ ˜ao mais concentrada, a probabil- idade de contato enzima-substrato aumenta. Em baixas concentrac¸ ˜oes de sub- strato (1% w/w), CBMs foram mais importantes no desempenho catal´ıtico das celobiohidrolases I e II de Trichoderma reesei, em comparac¸ ˜ao com as endoglu- canases Cel5A e Cel7B. O aumento da concentrac¸ ˜ao do substrato, mantendo a proporc¸ ˜ao de enzima para substrato, aumenta a adsorc¸ ˜ao de Cel7A de Tricho- derma reesei, independente da presenc¸a do CBM. No caso da concentrac¸ ˜ao do substrato de 20% (w/w), o desempenho hidrol´ıtico de celulases sem CBM alcanc¸ou o das celulases com CBM. Este fen ˆomeno ´e provavelmente devido `a adsorc¸ ˜ao n ˜ao-produtiva de enzimas.
H ´a celulases que n ˜ao cont ˆem CBM e n ˜ao se conhece como elas s ˜ao ca- pazes de reconhecer, ligar-se e hidrolisar as cadeias celul ´osicas na aus ˆencia de um CBM. Neste trabalho feito em colaborac¸ ˜ao com outros alunos do grupo,
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Erica Teixeira Prates e Rodrigo Leandro Silveira, foi investigada uma dessas enzimas, a endoglucanase 3 de Trichoderma harzianum [PDB id: 4H7M, [57]] (aqui chamada de ThEG3) e aqui est ˜ao mostrados apenas os resultados mais importantes e da maior participac¸ ˜ao da autora da tese. O alvo ´e entender como a ThEG3 interage com o substrato celul ´osico, que parte da enzima ´e respons ´avel para a func¸ ˜ao de ligac¸ ˜ao `a celulose que ´e normalmente func¸ ˜ao do dom´ınio CBM.
Figura 4.1. Estruturas de ThEG3 e TrEG3 alinhadas. As diferenc¸as entre os res´ıduos das fendas catal´ıticas s ˜ao destacadas.
relac¸ ˜ao a endoglucanase 3 de Trichoderma reesei (TrEG3) [PDB id: 1H8V, [59]] e apresenta o mesmo tipo da estrutura terci ´aria, o sandu´ıche de folhas β, e por isso foi escolhida como refer ˆencia de dados experimentais faltantes para a ThEG3, Figura 4.1. S ˜ao poucas as diferenc¸as entre as estruturas da ThEG3 e TrEG3. Os res´ıduos da fenda catal´ıtica que diferem s ˜ao destacados na Figura 4.1. A ThEG3 possui um res´ıduo carregado, Asp96, na posic¸ ˜ao de um res´ıduo polar na TrEG3, Asn95. Os outros res´ıduos que diferem pertencem ao mesmo tipo de amino ´acidos. O alinhamento estrutural das duas estruturas foi feito por minimizac¸ ˜ao do valor de RMSD entre as duas estruturas, usando o programa VMD [34].
Para comparar as interac¸ ˜oes com a celulose, foi escolhida a endoglucanase C de Cellulomonas fimi (CfCBM) [PDBid:1GU3, [60] ], Figura 4.2, porque esta
age principalmente em oligossacar´ıdeos e celulose amorfa, similarmente `a TrEG3, que interage muito fracamente com substratos cristalinos [61]. A estrutura do CfCBM apresenta um arranjo de res´ıduos arom ´aticos similar ao da ThEG3, e esta ´e a outra raz ˜ao para usar CfCBM nos estudos comparativos da interac¸ ˜ao com substrato.
Sabe-se que os res´ıduos arom ´aticos s ˜ao importantes para reconhecimento e ligac¸ ˜ao ao substrato celul ´osico. Cadeias laterais de tirosina, triptofano ou feni- lalanina emparelham-se aos an ´eis glicos´ıdicos de carboidrato [62]. Um estudo de simulac¸ ˜oes de MD e an ´alise de modos normais foram usados para exami- nar o papel funcional de res´ıduos arom ´aticos no t ´unel da celobiohidrolase 2 de Trichoderma reesei [63]. A enzima cont ´em tr ˆes triptofanos que interagem com substrato e cada um deles foi mutado computacionalmente para alanina. Os c ´alculos de energia livre de interac¸ ˜ao com a celulose foram feitos para a enzima nativa e para tr ˆes prote´ınas mutantes. A mudanc¸a de energia livre foi positiva nos casos das tr ˆes prote´ınas mutantes em relac¸ ˜ao `a prote´ına nativa. Ent ˜ao, os res´ıduos arom ´aticos associados `a aquisic¸ ˜ao de substrato e estabilizac¸ ˜ao de produto t ˆem maior influ ˆencia sobre a energia livre de ligac¸ ˜ao e, portanto, s ˜ao propensos a ter um grande impacto sobre a atividade da enzima. Os resultados consistentes foram obtidos com ensaios experimentais de NMR que mostraram proximidade espacial maior entre substrato e res´ıduos arom ´aticos do que entre substrato e outro tipo de res´ıduo no caso da prote´ına mutada [64].
A estrutura do CfCBM apresenta tr ˆes res´ıduos arom ´aticos caracter´ısticos posicionados na boca da fenda, o que ´e uma caracter´ıstica geral das celulases que clivam preferencialmente a celulose amorfa ou oligossacar´ıdeos sol ´uveis enquanto existe outro tipo de CBM com res´ıduos arom ´aticos alinhados em paralelo que age preferencialmente na celulose cristalina [62]. Um exemplo ´e o CBM da celobiohidrolase I de Trichoderma reesei (TrCBM), Figura 4.2. A
Figura 4.2. Estrutura de CBM da endoglucanase C de Celulomonas fimi Cellulomonas fimi (CfCBM), e da celobiohidrolase I de Trichoderma reesei (TrCBM). A celulose ´e representada em cinza como uma cadeia ou como cristalina. Res´ıduos arom ´aticos (em amarelo) s ˜ao posicionados diferentemente, dependendo do substrato em que agem [62].
disposic¸ ˜ao dos res´ıduos na regi ˜ao da ligac¸ ˜ao facilita acesso ao substrato. A forma de fenda interage com uma cadeia da celulose, enquanto a regi ˜ao pla- nar contendo res´ıduos arom ´aticos alinhados interage mais facilmente com a superf´ıcie da celulose cristalina.
O arranjo dos res´ıduos arom ´aticos da ThEG3 est ´a representada em amarelo na Figura 4.3. Da mesma forma que os res´ıduos arom ´aticos na estrutura do CfCBM, estes res´ıduos formam a entrada da fenda.