Dinâmica molecular de celulases : estudos de reconhecimento de substrato e propriedades conformacionais

Texto

(1)IVANA STANKOVIC. ˆ DINAMICA MOLECULAR DE CELULASES: ESTUDOS DE RECONHECIMENTO DE SUBSTRATO E PROPRIEDADES CONFORMACIONAIS. CAMPINAS 2014. i.

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(3) UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA. IVANA STANKOVIC. ˆ DINAMICA MOLECULAR DE CELULASES: ESTUDOS DE RECONHECIMENTO DE SUBSTRATO E PROPRIEDADES CONFORMACIONAIS. ˜ SKAF ORIENTADOR: PROF. DR. MUNIR SALOMAO. TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA ˜ DO TÍTULO DE DOUTORA EM CIENCIAS. ˆ OBTENC ¸ AO. ` VERSAO ˜ FINAL DA TESE DEFENDIDA POR IVANA STANKOVIC, E ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE A ˜ SKAF. ORIENTADA PELO PROF. DR. MUNIR SALOMAO. ASSINATURA DO ORIENTADOR. CAMPINAS 2014. iii.

(4) Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química Danielle Dantas de Sousa - CRB 8/6490. St24d. Stankovic, Ivana, 1986StaDinâmica molecular de celulases : estudos de reconhecimento de substrato e propriedades conformacionais / Ivana Stankovic. – Campinas, SP : [s.n.], 2013. StaOrientador: Munir Salomão Skaf. StaTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química. Sta1. Dinâmica molecular. 2. Celulases. 3. Seletividade. 4. Propriedades conformacionais. I. Skaf, Munir Salomão. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.. Informações para Biblioteca Digital Título em outro idioma: Molecular dynamics of cellulases : study of substrate recognition and conformational properties Palavras-chave em inglês: Molecular dynamics Cellulases Selectivity Conformational properties Área de concentração: Físico-Química Titulação: Doutora em Ciências Banca examinadora: Munir Salomão Skaf [Orientador] Hubert Karl Stassen Fabio Marcio Squina Rogério Custodio Nelson Henrique Morgon Data de defesa: 20-02-2014 Programa de Pós-Graduação: Química. iv. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org).

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(6) Agradecimentos ˜ os meus agradecimentos as ` seguintes Quero aqui expressar de coraçao ˜ pessoas e instituiçoes: ˜ Skaf por • No primeiro lugar ao meu orientador Prof. Dr. Munir Salomao ˜ e oportunidade de aprenter me aceitado como aluna. Pela orientaçao ´ der uma area completamente nova para mim e pela grande vontade de providenciar sempre recursos para os projetos de pesquisa. ˜ me separando dos • A` Universidade por ter me aceitado no doutorado, nao alunos brasileiros em nenhum sentido. ˆ • Ao meu grupo de pesquisa que me ensinou toda a base de dinamica ´ de como ser uma pesquisadora. molecular e tambem • Ao CNPq pelo apoio financeiro durante o doutorado. ˜ Carlos da Universidade • Ao grupo colaborador do Instituto de F´ısica de Sao ˜ Paulo. de Sao ˜ do trabalho. • Aos professores do Instituto de Qu´ımica pelas discussoes • Ao Prof. Dr. Edvaldo Sabadini pela minha primeira pesquisa brasileira. ˜ • A toda a comunidade cient´ıfica de qu´ımica computacional pela distribuiçao ˜ e software. gratuita de informaçao. vii.

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(8) Curriculum Vitae. ˜ • Informac ¸ oes Pessoais Nome:. Ivana Stankovic. Data de nascimento:. 27/10/1986. ˜ Universitaria ´ • Formac ¸ ao F´ısico-Qu´ımica, Per´ıodo: 10/2005 a` 04/2010. Faculdade de F´ıciso-Qu´ımica, Universidade de Belgrado ˜ da funçao ˜ de partiçao ˜ e Monografia: A abordagem geral para a derivaçao ˜ termodinamicas ˆ funçoes com base na teoria de ensemble de Gibbs. Orientadora: Profa. Dra. Ljiljana Kolar-Anić. Per´ıodo: 02/2010 a` 04/2010.. • Doutorado ˆ Dinamica Molecular de Celulases: Estudos de Reconhecimento de Substrato e Propriedades Conformacionais. Orientador: Prof. Dr. Munir S. Skaf, Instituto de Qu´ımica, UNICAMP. Ingresso: 03/08/2010, Defesa: 20/02/2014, Bolsa CNPq. ˆ ˜ • Premios e Distinçoes ix.

(9) x 1. Best Poster of Congess, para o trabalho “Substrate Length Selectivity of the Endoglucanase from Xanthomonas campestris pv. campestris”, concedido por XXXVIII Congress of Theoretical Chemists of Latin Expression, 2012. • Artigos publicados 1. PRATES, E. T. ; STANKOVIC, I. ; SILVEIRA, R. L. ; LIBERATO, M. V. ; HENRIQUE-SILVA, F. ; NEI PEREIRA, Jr. ; POLIKARPOV, I. ; SKAF, M. S . X-ray Structure and Molecular Dynamics Simulations of Endoglucanase 3 from Trichoderma harzianum: Structural Organization and Substrate Recognition by Endoglucanases That Lack Cellulose Binding Module. Plos One, v. 8, p. e59069, 2013. 2. STANKOVIC, I. ; MARKOVIC, V. M. ; KOLAR-ANIC, L. Z. System with Variable Energy, Volume and Number of Particles: Evaluation of Partition Function and Thermodynamic Quantities. Russian Journal of Physical Chemistry, v. 85, p. 2257-2263, 2011.. ˜ • Artigos em preparac ¸ ao 1. Substrate Length Selectivity of the Endoglucanase from Xanthomonas campestris pv. campestris: a Molecular Dynamics study 2. Molecular Dynamics of Pro-Thr linker of the Endoglucanase from Xanthomonas campestris pv. campestris 3. Application of the Molecular Dynamics Flexible Fitting on the SAXS structure of the Endoglucanase from Xanthomonas campestris pv. campestris • Resumos publicados em anais de congressos.

(10) xi 1. STANKOVIC, I. ; PRATES, E. T. ; LIBERATO, M. V. ; POLIKARPOV, I. ; SKAF, M. S. . Oligossaccharide Interactions With Endoglucanases That Lack the Cellulose Binding Domain: Molecular Dynamics Sim˜ ulations of Endoglucanase III from Trichoderma Harzianum. In: Sao Paulo School of Advanced Science, 2012, Campinas. Agrochemical & Drug Design, 2012. p. 40-40.. ˜ na pos-graduaçao ˜ • Formac ¸ ao ˜ Geral 1. 2011/2S - Exame de Qualificaçao ´ Tema: Mecanismos de Hidrolise Enzimatica de Polissacar´ıdeos, ´ ´ ´ Banca: Prof. Dr. Rogerio Custodio, Prof. Dr. Fabio Gozzo e Prof. Dr. Nelson Morgon, Conceito: Aprovado. 2. 2011/1S - F´ısica Estat´ıstica I, Ministrado por: Prof. Dr. Alex Antonelli, Conceito: B ˜ a` Qu´ımica Quantica ˆ 3. 2010/2S - Introduçao e Espectroscopia, Ministrado por: Prof. Dr. Pedro Vazquez, Conceito: A. ˜ Complementar • Formac ¸ ao ˜ ao FORTRAN 90, Centro Nacional de Processamento de 1. Introduçao ´ Alto Desempenho - SP, Carga horaria: 15h, 2010 ˜ ao C, Centro Nacional de Processamento de Alto Desem2. Introduçao ´ penho - SP, Carga horaria: 15h, 2010.

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(12) ˆ DINAMICA MOLECULAR DE CELULASES: ESTUDOS DE RECONHECIMENTO DE SUBSTRATO E PROPRIEDADES CONFORMACIONAIS. ˜ enzimatica ´ ˜ de bioetanol e´ realA degradaçao da celulose para a produçao ˜ proizada por um conjunto de prote´ınas denominadas celulases, as quais sao ´ ´ ˜ duzidas por varios fungos e bacterias. O mecanismo molecular das interaçoes f´ısicas entre as celulases e a celulose e´ pouco conhecido. Para investigar ˜ ˆ estas interaçoes, bem como as propriedades conformacionais e dinamicas, ˜ por dinamica ˆ nesta Tese usamos simulaçoes molecular (MD). Abordamos duas celulases: a endoglucanase 3 de Trichoderma harzianum (ThEG3) e a endoglucanase de Xanthomas campestris pv. campestris (XccEG). O estudo dos ´ mecanismos de reconhecimento de substrato por ThEG3 em que falta o modulo ˜ a` celulose (CBM), revela que a ausencia ˆ de ligaçao de um CBM nesta estrutura e´ compensada pela presença de res´ıduos similares aos res´ıduos t´ıpicos de um CBM. O segundo estudo, sobre seletividade da XccEG, explica por que ´ esta enzima catalisa a hidrolise somente de oligossacar´ıdeos de quatro ou mais ˜ unidades. Nossas simulaçoes indicam que os quatro subs´ıtios caracter´ısticos ˜ ao substrato da XccEG precisam ser simultaneamente esda fenda de ligaçao ˜ ˜ efetiva tabilizados pelas interaçoes com substrato para promover uma ligaçao ˆ substrato-enzima. No terceiro estudo, investigamos as propriedades mecanicas do linker entre o dom´ınio catal´ıtico (CCD) e o CBM desta mesma enzima, com´ ´ posto por blocos de Thr e Pro, utilizando a tecnica de troca de replicas (REMD). Nossos resultados sugerem as bases moleculares da maior rigidez deste linker ˜ ao linker de celobiohidrolase 2 de Trichoderma reesei. Por fim, em comparaçao ´ ˆ adaptamos o metodo de ajuste flex´ıvel por dinamica molecular (MDFF) para ´ gerar modelos de estrutura terciaria a partir de dados de SAXS e o aplicamos para criar um modelo da estrutura intacta CCD-linker-CBM de XccEG.. xiii.

(13) xiv.

(14) MOLECULAR DYNAMICS OF CELLULASES: STUDY OF SUBSTRATE RECOGNITION AND CONFORMATIONAL PROPERTIES. The enzymatic degradation of the cellulose for the production of bioethanol is performed by a group of proteins called cellulases which are produced by various fungi and bacteria. The molecular mechanism of the physical interactions between the cellulases and a cellulose is not well understood yet. In this work we use molecular dynamics simulations (MD) to investigate these interactions as well as conformational and dynamic properties. We have studied two cellulases: the endoglucanase 3 from Trichoderma harzianum (ThEG3) and the endoglucanase from Xanthomas campestris pv. campestris (XccEG). The study of the mechanisms of substrate recognition by ThEG3 which lacks the cellulose binding module (CBM) shows that the absence of a CBM in this structure is compensated by the presence of residues similar to typical CBM residues. The second study, on the selectivity of XccEG, explains why this enzyme catalyses only the hydrolysis of oligosaccharides with four or more units. Our simulations indicate that the four characteristic subsites of the substrate binding cleft of XccEG need to be simultaneously stabilized by the interactions with the substrate to provide effective enzyme-substrate binding. In the third study, we investigated the mechanical properties of the linker between the catalytic domain (CCD) and CBM of the same enzyme, composed of Thr-Pro blocks, using the replica exchange molecular dynamics (REMD). Our results suggest the molecular basis of higher rigidity of this linker in comparison to the linker of cellobiohydrolase 2 from Trichoderma reesei. Finally, we have adapted the method of Molecular Dynamics Flexible Fitting (MDFF) to generate tertiary structure models from SAXS data and applied it to create a model of the intact structure CCD-linker-CBM of the XccEG.. xv.

(15) xvi.

(16) ´ Sumario. Lista de Abreviaturas. xxi. Lista de Figuras. xxiii. Lista de Tabelas. xxxi. ˜ Introduçao. 1. 1. 1.1. ˜ e importancia ˆ Celulases: Funçao . . . . . . . . . . . . . . . .. 2. 1.2. ´ Mecanismo qu´ımico: a hidrolise . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2. 1.3. Mecanismo f´ısico: reconhecimento de substrato . . . . . . . .. 7. 1.4. Estrutura modular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 8. 1.4.1. Sinergismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10. 1.4.2. Estrutura intacta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11. 2. Objetivos. 15. 3. ˆ Metodologia: Dinamica Molecular. 17. 3.1. ´ Fundamentos teoricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18. 3.2. ˜ e v´ınculos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Aproximaçoes. 3.3. ´ Analise de trajetoria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26. 3.4. Amostragem conformacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27. 3.5. ´ ´ Tecnica de Troca de Replicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28. 3.6. ˆ Modelagem estrutural por Dinamica Molecular . . . . . . . . . 33 xvii.

(17) 4. 5. Endoglucanase sem CBM. 37. 4.1. ˜ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Introduçao. 4.2. ˜ Simulaçoes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41. 4.3. ˜ Resultados e discussoes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43. 4.4. ˜ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 Conclusao. Seletividade da Endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. campestris. 6. 7. 8. 49. 5.1. ˜ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 Introduçao. 5.2. ˜ Simulaçoes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52. 5.3. ˜ Resultados e discussoes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56. 5.4. ˜ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Conclusao. ˆ Propriedades mecanicas do linker da XccEG. 67. 6.1. ˜ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 Introduçao. 6.2. ˜ Simulaçoes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69. 6.3. ˜ Resultados e discussoes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73. 6.4. ˜ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 Conclusao. Modelagem com SAXS. 89. 7.1. ˜ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 Introduçao. 7.2. ˜ do sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 Preparaçao. 7.3. ˜ Resultados e discussoes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98. 7.4. ˜ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 Conclusao. ˜ Conclusoes gerais. 111. 8.1. Endoglucanase sem CBM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111. 8.2. Seletividade da Endoglucanase Xcc . . . . . . . . . . . . . . . 112. 8.3. ˆ Propriedades mecanicas do linker da XccEG . . . . . . . . . 112 xviii.

(18) 8.4. Modelagem com SAXS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113. ˆ ´ Referencias Bibliograficas. 129. xix.

(19) xx.

(20) Lista de Abreviaturas. CBH2. Linker da Celobiohidrolase 2 de Trichoderma reesei. CBM. ´ ˜ ao carboidrato Modulo de ligaçao. CCD. Dom´ınio catal´ıtico. CfCBM. CBM da Endoglucanase C de Cellulominas fimi. PCA. ´ Analise de Componentes Principais. (PT)12. Linker da Endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. campestris. MD. ˆ Dinamica Molecular. MDFF. ˆ Ajuste Flex´ıvel por Dinamica Molecular. REMD. ´ ´ Tecnica de Troca de Replicas. RMSD. ´ ´ Raiz do desvio quadratico medio. SAXS. ˆ Espalhamento de raios X de baixo angulo. ThEG3. Endoglucanase de Trichoderma harzianum. XccEG. Endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. campestris. xxi.

(21) xxii.

(22) Lista de Figuras. 1.1. ˜ das celulases na celulose. Açao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2. 1.2. ˜ β-1,4-glicos´ıdica, entre os atomos ´ Ligaçao C1 e O4’. . . . . . . . . .. 3. 1.3. ˜ anomericas ´ Duas configuraçoes da glicose. . . . . . . . . . . . . . .. 4. 1.4. ´ Mecanismos de hidrolise glicos´ıdica. . . . . . . . . . . . . . . . . .. 5. 1.5. ˆ topologias das celulases relacionadas a interaçao ˜ com substrato: Tres ˜ S´ıtio ativo esta´ representado em vermelho. . . . fenda, tunel e bolsao. ´. 1.6. 8. ˜ ao substrato de uma glicosidase ou unidades Subs´ıtios de ligaçao ´ ˜ denominados por numeros monomericas de polissacar´ıdeo sao pos´ ˜ a ligaçao ˜ glicos´ıdica. 9 itivos ou negativos dependendo do lado em relaçao. 1.7. Esquema da estrutura bimodal de celulase. O dom´ınio onde ocorre ˜ qu´ımica (CCD) e o dom´ınio menor que interage fisicamente a reaçao ´ com substrato (CBM). A terceira parte da molecula e´ um pept´ıdeo ´ sem estrutura terciaria definida, o linker.. 1.8. . . . . . . . . . . . . . . .. 9. ´ Estrutura cristalografica de uma celulose resolvidada separadamente para os dom´ınios CCD e CBM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12. 1.9. Estrutura de SAXS de uma celulase bimodal.. . . . . . . . . . . . . 12. 3.1. ˜ do estado α para o estado β trocando apenas a temperTransiçao atura. Temperatura e´ denominada por T e a energia total por E. . . . 29. 3.2. ˆ ˜ de probabilidade media ´ Numero de transito como funçao de troca. ´ ´ Os numeros indicando as retas representam numero de replicas. ´ ´ Adaptado de [52]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33. xxiii.

(23) 4.1. Estruturas de ThEG3 e TrEG3 alinhadas. As diferenças entre os ˜ destacadas. res´ıduos das fendas catal´ıticas sao. 4.2. . . . . . . . . . . . 39. Estrutura de CBM da endoglucanase C de Celulomonas fimi Cellulomonas fimi (CfCBM), e da celobiohidrolase I de Trichoderma reesei (TrCBM). A celulose e´ representada em cinza como uma cadeia ou ´ ˜ posicionacomo cristalina. Res´ıduos aromaticos (em amarelo) sao dos diferentemente, dependendo do substrato em que agem [62]. . . 41. 4.3. ˜ Posiçoes iniciais dos substratos inseridos na fenda da ThEG3. A ˜ representados em tr´ıade catal´ıtica, Glu117, Glu201 e Asp100, estao ´ vermelho e os res´ıduos aromaticos na boca da fenda em amarelo. . . 42. 4.4. ´ ˜ apresenMovimentos dos res´ıduos aromaticos e substratos estao ˜ tados por instantes sobrepostos das simulaçoes coloridos em uma ´ escala da vermelho a` azul de acordo com o tempo de trajetoria. . . . 45. 4.5. ´ A: Res´ıduos em contato hidrofobico com substratos por mais do ˜ que 50 % do tempo de simulaçao. B: Res´ıduos que interagem via ˜ ˆ ligaçoes de hidrogenio com o substrato por, pelo menos, 10 % do ˜ C´ırculos de mesmas cores destacam res´ıduos tempo de simulaçao. ˜ e papeis ´ correspondentes nas interaçoes ˜ prote´ına-substrato em posiçoes nas duas prote´ınas, ThEG3 e CfCBM. . . . . . . . . . . . . . . . . . 46. 4.6. As estruturas alinhadas das endoglucanases da fam´ılia 12. Os nomes se referem aos nomes dos organismos que produzem as enzimas ´ representadas. Res´ıduos aromaticos representados como barras. A: As endoglucanases da fam´ılia 12 com CBM. B: As endoglucanases da fam´ılia 12 sem CBM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48. xxiv.

(24) 5.1. Espectros de Eletroforese capilar de oligossacar´ıdeos marcados com ´ APTS: Hidrolise completa de oligossacar´ıdeo formado por cinco (A) ˜ marcados com e seis (B) glicoses. Os dois oligossacar´ıdeos estao ˜ APTS pela extremidade nao-redutora e os s´ımbolos C6, C5, C4, C3 ˜ dos oligomeros ˆ e C2 indicam o grau de polimerizaçao de glicose.. 5.2. . . 52. ˜ cliva cadeias Esquema de seletividade de XccEG. A XccEG nao ˜ cliva uma unidade menores que quatro unidades glicos´ıdicas e nao da extremidade de cadeia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53. 5.3. Docagem da celotetraose. A: XccEG (cor de laranja) alinhada com a endoglucanase E1 de Acidothermus cellulolyticus (azul). O substrato cristalizado em complexo com a endoglucanase E1 de Acidothermus ˜ da celotetraose dentro da fenda cellulolyticus B: Esquema da posiçao da XccEG. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55. 5.4. ˜ temporas da distancia ˆ ˆ A evoluçao entre o oxigenio do grupo -OH de ˆ Glu182 e o oxigenio glicos´ıdico de substrato para todos os sistemas ˜ interrompidas simulados contendo substrato. Algumas curvas sao por falta de espaço no eixo y. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56. 5.5. RMSD para todos os sistemas simulados contendo substrato. . . . . 57. xxv.

(25) 5.6. ˆ ˆ ˆ A: A distancia entre oxigenio do grupo -OH de Glu182 e oxigenio ˜ glicos´ıdico de substrato durante as simulaçoes, para sistemas com celobiose, celotriose-2-1+1, celotriose-1+1+2 e a celotetraose. B: ˚ ´ Numero de atomos de cada unidade de substrato a 4 A ´. de cada. ˜ a` estrutura inicial docada. Subs´ıtios foram definidos subs´ıtio, em relaçao ´ pelo criterio de energia de < -5kcal/mol, Figura 5.7. C: RMSD de ˜ a` estrutura inicial. As linhas vermelhas cada substrato em relaçao ´ foram obtidas como a media de blocos de 20 pontos da curva que ´ ˆ simulaçoes. ˜ representa as propriedades medias das tres Algumas ˜ interrompidas por falta de espaço no eixo y. curvas sao. 5.7. . . . . . . . 58. ˜ EGXc-celotetraose para cada um dos subs´ıtios. Energia das interaçoes ˜ destacados loops compartilhados entre subs´ıtios diferentes. . . 59 Estao. 5.8. ˜ representados em Mobilidade dos loops da fenda. Os substratos sao nuvens brancas. A- sem substrato, B- celobiose, C- celotriose-2-1+1, ´ D- celotriose-1+1+2, E- celotetraose. . . . . . . . . . . . . . . . . . 61. 5.9. XccEG possui somente 4 subs´ıtios para ligar a` celulose. . . . . . . . 62. 5.10. ˜ XccEG-celotetraose para cada um dos subs´ıtios. Energia de interaçao A primeira docagem (azul) e a docagem alternativa (vermelho), onde ˆ ´ ˆ a distancia entre o atomo de oxigenio do grupo-OH do catalisador ´ ˆ ˜ 3,61 A˚ e acido Glu182 e o oxigenio glicos´ıdico da celotetraose sao ˚ respectivamente. 3,05 A,. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 xxvi.

(26) 5.11. ´ Enzimas da fam´ılia 5 que possuem um analogo ao loop5 e que foram cristalizadas com substratos. Os nomes se referem aos nomes dos organismos que produzem as enzimas representadas. Substratos ˜ representados em barras e as fendas (o loop e a extremidade) estao em tubos. Todas possuem loop do tipo loop5 da XccEG e fenda de tamanho parecido. A extremidade das fendas de cada enzima foi ´ determinado como conjunto de atomos de enzima a 7A˚ ao redor do ´ ´ ultimo atomo de substrato do lado redutor, o atomo O1. . . . . . . . . 65 ´. 6.1. ˜ de autocorrelaçao ˜ da energia potencial normalizada, para A funçao ambos os linkers, (PT)12 e CBH2.. 6.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72. ˜ reduzido a duas componentes principais A: Espaço de conformaçao ˜ de sistema no espaço de conformaçao ˜ a 298K. Cada ponto e´ posiçao ˜ ˜ de parametro ˆ em um instante de simulaçao. B: Distribuiçao de or˜ apresenta mudanças abruptas ao longo do tempo de dem R nao ˜ simulaçao.. 6.3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74. ˜ da distancia ˆ Perfil de energia livre em funçao ponta-a-ponta R, para os 2 linkers, (PT)12 (vermelho) e CBH2(preto). As linhas finas representam o ajuste a` lei de Hook. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75. 6.4. ˜ ao raio de giro Rg , para os 2 linkers, Perfil de energia livre em relaçao (PT)12 (vermelho) e CBH2(preto). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77. 6.5. ˆ Angulos torcionais da cadeia principal, φ e ψ. . . . . . . . . . . . . . 78. 6.6. ˜ de probabilidade dos angulos ˆ A distribuiçao torcionais da cadeia prin˜ no eixo x e´ cipal, vermelho para (PT) 12 , preto para CBH2. A funçao ˜ 6.8. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 definida pela equaçao. 6.7. Estrutura da prolina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78. 6.8. ˜ de hidrogenio ˆ Ligaçao (amarelo) entre a cadeia lateral da Thr e os res´ıduos vizinhos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79. xxvii.

(27) 6.9. ˜ de hidrogenio ˆ ˜ de tempo. . . . . . 81 Numero total de ligaçoes em funçao ´. 6.10. Mobilidade estimada por RMSF por blocos de 100ps para dois modos ´ R1 , R2 , R1 e R2 e a barreira. A ordem da mobilidade crescente e: ´ barreira. As linhas horizontais representam a media de RMSF por res´ıduos.. 6.11. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82. ˆ Mudança relativa dos parametros do ajustamento da energia livre a` ˆ lei de Hook, constante de força k e a distancia ponta-a-ponta R0 , com aumento de temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83. 6.12. ˜ espacial das ligaçoes ˜ ˆ A distribuiçao de hidrogenio em (PT)12 . Os ˆ ˜ de hidrogenio ˆ pontos pretos representam existencia das ligaçoes en˜ tre um par de res´ıduos. A` temperatura mais alta, permanecem ligaçoes ˜ perto a` diagonal do grafico). ´ entre res´ıduos vizinhos (as ligaçoes. 6.13. . . 84. ˜ do linker (PT)12 sobrepostos, cada 1ns. A: Instantes na simulaçao ˜ ao atomo ´ Alinhamento dos instantes foi feito em relaçao central do ˆ ˜ de cadeia prinlinker, o nitrogenio do res´ıduo Thr15. Representaçao ´ cipal em cores de escala de tempo. B: Mapa volumetrico com iso` 298K, o linker percorre maior espaço. 86 ˆ valor de ocupancia igual a 4%. A. 7.1. ˜ de perspectiva. . . . . . . 90 Envelope SAXS da XccEG. Representaçao. 7.2. ´ A estrutura cristalografica do d´ımero de chiquimato quinase I de Escherichia coli (esquerda) e o seu envelope SAXS (direita). . . . . . . 93. 7.3. ´ Valores de χ, porcentagem dos atomos pesados dentro do envelope ˜ a` estrutura cristalografica ´ e RMSD em relaçao para cada uma das ˜ de docagem. O eixo x apresenta numero ˜ combinaçoes de combinaçao ´ ˆ ˆ de docagens de dois monomeros, o primeiro d´ıgito e´ de um monomero ˆ e o segundo e´ de outro monomero. As oito estruturas com o menor ˜ representadas em barras vermelhas e o m´ınimo valor de χ estao global esta´ enquadrado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94. xxviii.

(28) 7.4. ´ Estrutura cristalografica do d´ımero do chiquimato quinase I de Escherichia coli (PDBid: 1KAG) e oito estruturas modeladas de menor valor de χ. Os numeros indicam numeros de docagens da Tabela ´ ´ ˜ alinhados em relaçao ˜ a um dos monomeros ˆ 7.1. Os modelos estao ˆ (o monomero da parte de baixo do d´ımero). Bolinha vermelha repreˆ ˆ senta o in´ıcio da sequencia de cada monomero.. 7.5. . . . . . . . . . . . 95. ´ ˆ Mapa volumetrico de densidades eletronicas obtidas por SAXS. A: ´ Envelope SAXS representado como isovalor 0,8 do mapa volumetrico. ´ B: Fatia do mapa volumetrico que inclui imagem de esferas equidis´ tantes. C: Fatia do mapa volumetrico com os valores do mapa truncados no 0,8, cada valor de menor que 0,8 foi substitu´ıdo por 0,8. . . 97. 7.6. Modelos feitos pela docagem dos dom´ınios separadamente. Res´ıduos ´ ˜ representados em vercatal´ıticos e res´ıduos aromaticos do CBM sao melho. A: O loop5 nao impede a sa´ıda do substrato. B: O loop5 impede a sa´ıda do substrato. C: Enzimas da fam´ılia 5 de glicosidases ´ ˜ ultrapassam possuem um analogo ao loop5 e substratos que nao esta barreira.. 7.7. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100. ˆ Concordancia com a curva SAXS experimental durante o tempo de ˜ MDFF. As curvas vermelhas representam simulaçao ˜ a` 1000K simulaçao de temperatura em que somente o linker foi livre para movimentos. . . 101. 7.8. Durante o procedimento de modelagem por MDFF, estruturas inter˜ preservadas, que mostra valor baixo de RMSD nas dos dom´ınios sao ´ e a porcentagem dos atomos pesados dentro do envelope cresce ate´ 82%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102. 7.9. Sem v´ınculos de envelope, o sistema e´ capaz de manter χ em torno ´ de 3,3 enquanto o RMSD e a porcentagem de atomos pesados den´ tro do envelope exibiram patamar de valores razoaveis. . . . . . . . . 103. xxix.

(29) 7.10. A estrutura inicial (a` esquerda) e final (a` direita) da modelagem da ˜ XccEG intacta em soluçao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104. 7.11. ´ ˜ em vermelho. As O modelo final. Os res´ıduos aromaticos estao linhas vermelhas representam os eixos de CCD e CBM. . . . . . . . 104. 7.12. A: O modelo final da modelagem da XccEG posicionado em cima da celulose cristalina. B: O modelo de CBM da celobiohidrolase I de ´ simulaçao ˜ (vermelho). Trichoderma reesei [92] inicial (azul) e apos ´ CBM desenhado como faixa e os res´ıduos aromaticos como barras. . 105. 7.13. ˜ do CBM da endoglucanase de Xantomonas campestris pv. Posiçao ´ campestris em cima da camada da celulose, inicial (azul) e apos ˜ (vermelho). CBM desenhado como faixa e os 40ns de simulaçao ´ res´ıduos aromaticos como barras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106. 7.14. ˆ Diferenças estruturais (RMSF) e dinamicas (RMSFblocos) entre o ´ ajuste com SAXS e cristalografico ´ modelo apos do CCD da XccEG. ´ ´ A unidade simetrica cristalografica (direito). . . . . . . . . . . . . . . 107. 7.15. ˜ MDFF de 1ns, partindo do O instante inicial e final de uma simulaçao modelo do CBM paralelo a` fenda do CCD. Eixo do CCD e res´ıduos ´ ˜ representados em vermelho. . . . . . . . . . 108 aromaticos do CBM sao. xxx.

(30) Lista de Tabelas. 1.1. ˆ Distancia entre res´ıduos catal´ıticos para quatro tipos de glicosidases, adaptado de [7]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 5.1. 7. ˜ usadas nos calculos ´ ´ Trechos das simulaçoes das propriedades medias ´ ˆ do sistema, determinadas com as analises de RMSD e a distancia ˆ ˆ entre o oxigenio do grupo -OH de Glu182 e o oxigenio glicos´ıdico de substrato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55. 6.1. ˆ Sequencia do linker da celobiohidrolase 2 de Trichoderma reesei. ´ ˆ ˜ representados pelo codigo ´ Aminoacidos da sequencia sao de uma letra.. 6.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69. ˜ do linker CBH2. Aminoacidos ´ ˆ ˜ repGlicosilaçao da sequencia sao ´ resentados pelo codigo de uma letra e unidades manos´ıdicas pelo ˙ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 s´ımbolo O.. 6.3. ˆ ˜ de distancia ˆ Parametros das curvas de perfil de energia livre em funçao ponta-a-ponta ajustados a` lei de Hook, para os dois linkers, (PT)12 e CBH2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76. 6.4. ˆ ˜ de raio Parametros das curvas de perfil de energia livre em funçao de giro ajustadas a` lei de Hook, para os dois linkers, (PT)12 e CBH2. . 76. xxxi.

(31) 6.5. ˆ ˜ de hidrogenio ˆ ˜ de Frequencia de ligaçoes no linker (PT)12 em funçao ˆ ˆ distancia entre res´ıduos na sequencia. l e p denominam a cadeia latˆ eral e principal, respectivamente. Por simplicidade, as frequencias de ˜ estao ˜ mostradas na tabela. A maior frequencia ˆ baixo de 0,01% nao e´ entre Thr e primeiro(Pro) ou segundo res´ıduo vizinho (Thr). . . . . . 80. 6.6. ˜ de hidrogenio ˆ Porcentagem das ligaçoes para os dois linkers, (PT)12 e CBH2, no total, e apenas da cadeia lateral da Thr. . . . . . . . . . 80. 7.1. Docagens escolhidas pelo valor m´ınimo de χ. A porcentagem dos ´ ˜ a` estrutura atomos pesados dentro do envelope e RMSD em relaçao ´ ˜ representados para cada docagem. . . . . . . . 93 cristalografica estao. xxxii.

(32) Cap´ıtulo 1. ˜ Introduçao. ˜ de significante parcela do mundo em desacelerar um Com a preocupaçao ˜ poss´ıvel aquecimento global e reduzir as emissoes de gases resultantes da ´ queima de combust´ıveis fosseis, aumentou consideravelmente o interesse na ˜ do bioetanol como uma fonte energetica ´ utilizaçao menos poluente e produzida ´ ´ de uma fonte renovavel. No Brasil, um aumento significativo e sustentavel na ˜ de bioetanol poderia ser alcançado com o melhor aproveitamento produçao do bagaço da cana-de-açucar. A celulose, principal componente do bagaço, ´ ´ e´ um material insoluvel em agua, composto de longas cadeias formadas por ´ ´ ˜ moleculas de glicose unidas por ligaçoes β-1,4-glicos´ıdicas. A principal difi˜ eficiente da celulose esta´ na sua grande resistencia ˆ culdade na utilizaçao em ´ sofrer hidrolise [1]. 1.

(33) 1.1. ˜ e importancia ˆ Celulases: Funçao. ˜ da celulose em açucares ´ A degradaçao soluveis pode ser alcançada atraves ´ ´ ˜ de enzimas celulases produzidas por varios ´ ´ da açao fungos e bacterias que ´ ˜ catalisam a hidrolise das ligaçoes glicos´ıdicas. Diferentes tipos das glicosi˜ dases, endoglucanases, exoglucanases e β-glicosidases, atuam em conjunçao ´ no mecanismo de hidrolise. As exoglucanases clivam as extremidades das cadeias polissacar´ıdicas da celulose, liberando glicose ou celobiose, um dis˜ sacar´ıdeo de glicose. As endoglucanases hidrolisam aleatoriamente ligaçoes ˜ acess´ıveis, disponiintramoleculares β-1,4- glicos´ıdicas da celulose que estao bilizando novas extremidades para o ataque das exoglucanases. E, por fim, as ´ β-glicosidases realizam a hidrolise da celobiose em glicose, Figura 1.1 [2].. ˜ das celulases na celulose. Figura 1.1. Açao. 1.2. ´ Mecanismo qu´ımico: a hidrolise. ´ As celulases catalisam a hidrolise da celulose ou, mais especificamente, ˜ glicos´ıdica. Sao ˜ prote´ınas que mostram grande diversidade estrua ligaçao ˜ de hidrolise. ´ tural, mas apresentam similaridade na funçao A celulose e´ um ˆ ˜ polissacar´ıdeo constitu´ıdo de monomeros de glicose unidos pelas ligaçoes β˜ 1,4-glicos´ıdicas, Figura 1.2. A celulose pode apresentar regioes cristalinas e 2.

(34) amorfas [1]. ˜ relativa entre a hidroxila no carbono anomerico ´ Dependendo da configuraçao ˜ um monossacar´ıdeo (C1) e a hidroxila no carbono com mais alta numeraçao, e´ chamado de α ou β, Figura 1.3. A extremidade de polissacar´ıdeo com car´ bono anomerico livre e´ chamada de extremidade redutora porque e´ capaz de ´ ´ de abertura de anel e formar um grupo alde´ıdo em carbono anomerico atraves atuar como agente redutor. Enquanto isso, a extremidade oposta e´ chamada ˜ de nao-redutora.. ˜ β-1,4-glicos´ıdica, entre os atomos ´ Figura 1.2. Ligaçao C1 e O4’.. ˜ β-1,4-glicos´ıdica que ocorre em celulose e´ uma ligaçao ˜ entre a A ligaçao ´ ˜ 4 de hidroxila do carbono anomerico de uma glicose e a hidroxila na posiçao ˜ de uma molecula ´ ´ outra glicose, com a remoçao de agua. Portanto, e´ uma ˜ an´ıdrica e as enzimas que a clivam sao ˜ hidrolases, as enzimas que ligaçao ´ ˜ covalente entre o carrequerem agua. Mais especificamente, e´ uma ligaçao ´ ˆ bono anomerico (C1) de uma unidade de glicose e oxigenio da hidroxila 4 ˆ da outra, agora chamado de oxigenio glicos´ıdico, Figura 1.2. A liberdade de ˜ de uma cadeia de celulose e´ determinada por esta ligaçao ˜ que movimentaçao ˜ de aneis. ´ e´ mais flex´ıvel do que as ligaçoes ´ ˜ glicos´ıdica foi proposta por Koshland O mecanismo de hidrolise da ligaçao ´ ´ de dois mecanismos prinem 1953 [8], Figura 1.4. Esta hidrolise ocorre atraves ˜ origem a` retençao ˜ ou inversao ˜ integral da configuraçao ˜ anomerica ´ cipais que dao ´ ´ do substrato. Ela ocorre via catalise acida e exige dois res´ıduos cr´ıticos: um 3.

(35) ˜ anomericas ´ Figura 1.3. Duas configuraçoes da glicose.. ´ ´ ´ ˆ catalisador acido e um nucleofilo/base. O catalisador acido doa hidrogenio ˆ ˜ glicos´ıdica, liberando o produto da ao oxigenio glicos´ıdico e quebra a ligaçao ´ ´ ˜ glicos´ıdica fica com hidrolise. O carbono anomerico que formava a ligaçao a carga positiva, portanto sujeito ao ataque nucleof´ılico. Estes dois res´ıduos ˜ de catal´ıticos junto com um res´ıduo auxiliador que e´ protonado e forma ligaçao ˆ ´ ˜ certa, sao ˜ chamados de hidrogenio com o nucleofilo mantendo-o na posiçao s´ıtio ativo. ˜ o papel do nucleofilo ´ No caso do mecanismo de retençao, pertence a um ´ res´ıduo da enzima que se liga covalentemente ao carbono anomerico, assim ´ formando um intermediario covalente com o carboidrato. No segundo passo da ˜ este intermediario ´ e´ sujeito a outro ataque nucleof´ılico de uma molecula ´ reaçao, ´ ˜ que, para ser capaz de atuar como nucleofilo, ´ de agua da soluçao precisa ˜ agora e´ realizada por outro res´ıduo ser desprotonada. E esta desprotonaçao ´ da enzima que tinha papel de catalisador acido e agora tem papel de catal´ ´ isador basico, estando desprotonado. Depois da hidrolise, a enzima permanece ˜ ˜ anomerica ´ igual e o substrato, depois de duas inversoes da configuraçao em ˜ inalterada. O primeiro passo, em seguida, permanece com a configuraçao ´ ˜ pelo evento que o intermediario covalente e´ formado, chama-se glicosilaçao 4.

(36) ´ Figura 1.4. Mecanismos de hidrolise glicos´ıdica.. de ligar o glicos´ıdeo (polissacar´ıdeo) a` enzima, e o segundo passo chama-se ˜ porque este glicos´ıdeo separa-se da enzima. desglicosilaçao ˜ o papel do nucleofilo ´ No caso do mecanismo da inversao, pertence a uma ´ ´ molecula de agua que posiciona-se entre o substrato e a enzima. Ela esta´ ´ desprotonada por um res´ıduo da enzima, o catalisador basico, e pronta para ´ ˜ do catalo ataque nucleof´ılico ao carbono anomerico do substrato. A posiçao ´ ˜ da configuraçao ˜ inalterada do substrato, manisador basico impede a formaçao ´ ´ ´ tendo a molecula de agua nucleof´ılica no lugar certo. Depois da hidrolise, a ´ enzima fica com um proton trocado entre os res´ıduos catal´ıticos e o substrato ˜ anomerica ´ com a configuraçao invertida. Praticamente, e´ o mesmo mecanismo ˜ seguida por um ataque nucleof´ılico com a diferença que, no caso de protonaçao 5.

(37) ˜ este processo acontece duas vezes [4, 5]. da retençao, Os res´ıduos catal´ıticos de enzima, como tem sido observado na maioria dos ˜ aspartato ou glutamato. Ambos possuem o grupo carboxila (-COOH) casos, sao ´ ´ ´ na cadeia lateral que pode atuar como um doador de proton na catalise acida ´ possuem oxigenios ˆ ´ e tambem ricos em pares de eletrons livres para ataque nucleof´ılico. ´ ˜ relativamente raros no interior de prote´ınas, mas Os grupos ionizaveis sao ˜ essenciais na catalise. ´ eles sao Em microambientes altamente polares ou po´ ´ larizaveis, a forma carregada de um grupo ionizavel ira´ predominar. Ja´ em mi´ croambientes menos polares ou polarizaveis, a forma neutra sera´ favorecida e ˜ deslocados em relaçao ˜ aos valores normais em agua. ´ os valores de pKa serao ´ Isto acontece de modo que, para os grupos acidos, os valores de pKa tendem ´ a ser superiores aos valores normais de pKa , e para os grupos basicos, os valores de pKa tendem a ser inferiores aos valores normais [6]. ´ ˜ ou inversao) ˜ depende da estrutura da O mecanismo de hidrolise (retençao ˜ e as enzimas com o enzima. As enzimas com o mecanismo de retençao ˜ diferem em distancia ˆ mecanismo de inversao entre os res´ıduos catal´ıticos. Amˆ ´ bos os mecanismos apresentam a mesma distancia entre o catalisador acido ˆ e o oxigenio glicos´ıdico situando-os perto o suficiente para eles formarem a ˜ de hidrogenio. ˆ ligaçao Os dois mecanismos começam a divergir quanto a` ˆ ´ ´ distancia entre o nucleofilo/base e o carbono anomerico. Como o mecan˜ deve acomodar espaço suficiente para a molecula ´ ´ ismo de inversao de agua, ´ ´ o nucleofilo/base esta´ situado mais longe do carbono anomerico. A tabela 1.1 ˆ ´ mostra as distancias medias entre res´ıduos catal´ıticos para os quatro tipos de ´ ´ ´ glicosidases medidas em varias enzimas por varios metodos experimentais [7].. 6.

(38) ˆ Tabela 1.1. Distancia entre res´ıduos catal´ıticos para quatro tipos de glicosidases, adaptado de [7].. ˜ Inversao. ˜ Retençao. ˚ (5.3 ± 0.2) A ˚ (9.0 ± 1.0) A. 1.3. Mecanismo f´ısico: reconhecimento de substrato. ´ Fora do mecanismo qu´ımico da hidrolise [8], pouco sabe-se a respeito dos ˜ f´ısica enzima-substrato que e´ mecanismos moleculares envolvidos na interaçao ˜ para a reaçao ˜ qu´ımica ocorrer. Entender tais mecanismos a primeira condiçao ´ para a compreensao ˜ de como as celulases funem n´ıvel molecular e´ necessario ˆ cionam e, portanto, de extrema importancia para o desenvolvimento de enzimas ˜ das celucom maior atividade celulol´ıtica. Ha´ diferentes modos de atuaçao ˜ lases. Estes dependem principalmente da forma da enzima e das interaçoes ´ ˜ sao ˜ dependentes hidrofobicas e hidrof´ılicas entre enzimas e substratos e nao ˜ de hidrolise. ´ ´ ˜ basta do mecanismo da reaçao Para a hidrolise acontecer, nao ˆ ´ ´ direcionar e a existencia do s´ıtio ativo em uma enzima, e´ necessario tambem ˜ nao ˜ covalentes manter a cadeia polissacar´ıdica no s´ıtio ativo, e a´ı as interaçoes ˆ papel importante. As interaçoes ˜ ˜ covalentes tambem ´ podem ser entem nao ` vezes, em bloquear substratos. volvidas em reconhecimento e, as ˜ exibir modos de As enzimas de estruturas tridimensionais similares vao ˜ similares [9]. A topologia geral que determina a atuaçao ˜ das celulases ligaçao ˆ classes gerais: 1)fenda, 2)tunel ˜ [10–13]. Celulases existe em tres e 3)bolsao ´ ˆ topologias estao ˜ representadas pela superf´ıcie molecular na Figura com as tres 1.5. As endoglucanases exibem a forma de fenda aberta que permite uma ˜ a cadeia celulosica ´ ˜ aleatoria ´ ligaçao na posiçao [10, 12]. O s´ıtio ativo das ex˜ O tunel oglucanases encontra-se em forma de tunel ou bolsao. permite que a ´ ´ 7.

(39) enzima libere o produto, permanecendo firmemente ligado a` cadeia de polis˜ e´ relacionada aos polissacar´ıdeos ramificasacar´ıdeo [12]. A forma do bolsao ˜ reflete dos ou cristalinos com poucas extremidades livres. O tamanho do bolsao o numero de subs´ıtios, que interagem com o substrato, e o comprimento do pro´ ´ destas tres ˆ topologias, existem as topologias intermediarias. ´ duto [10]. Alem. ˆ topologias das celulases relacionadas a interaçao ˜ com subFigura 1.5. Tres ˜ S´ıtio ativo esta´ representado em vermelho. strato: fenda, tunel e bolsao. ´. ˜ de ligaçao ˜ a` celulose de uma celulase, os subs´ıtios de Dentro da regiao ˜ sao ˜ frequentemente determinados. O subs´ıtio e´ a parte da enzima que ligaçao interage com uma unidade glicos´ıdica de substrato. Os subs´ıtios das enzimas ˜ enumeradas porcentagem inteiros positivos do lado redutor do ponto de sao ˜ clivagem de substrato e por inteiros negativos do lado nao-redutor do ponto de clivagem. Da mesma maneira, enumeram-se as unidades do substrato. Os ˜ mostrados na Figura 1.6. Esta determinaçao ˜ de subs´ıtios poderia subs´ıtios sao ˜ enzima-substrato e assim revelar aspectos ajudar no entendimento de interaçao moleculares de atividade de enzima.. 1.4. Estrutura modular. ˜ ˜ e´ soluvel, A celulose pode apresentar regioes cristalinas. Como nao o ´ acesso ao substrato cristalino representa um desafio para as enzimas. Por isso 8.

(40) ˜ ao substrato de uma glicosidase ou unidades Figura 1.6. Subs´ıtios de ligaçao ´ ˜ denominados por numeros monomericas de polissacar´ıdeo sao positivos ou negativos ´ ˜ a ligaçao ˜ glicos´ıdica. dependendo do lado em relaçao. ˜ as celulases apresentam uma estrutura complexa e isto traz implicaçoes para ˜ Uma caracter´ıstica geral da maioria das celulases e´ a estrutura a sua funçao. ´ ˆ catalytic core domain, CCD) modular [5], incluindo modulo catal´ıtico (do ingles, ´ ˜ ao carboidrato (do ingles, ˆ carbohydrate binding module, e modulo de ligaçao CBM), Figura 1.7.. Figura 1.7. Esquema da estrutura bimodal de celulase. O dom´ınio onde ocorre ˜ qu´ımica (CCD) e o dom´ınio menor que interage fisicamente com substrato a reaçao ´ ´ (CBM). A terceira parte da molecula e´ um pept´ıdeo sem estrutura terciaria definida, o linker.. ´ A hidrolise ocorre no CCD. O CBM tem papel importante na afinidade da enzima pela celulose. ˜ conectados por um pept´ıdeo sem estruOs dois dom´ınios, CCD e CBM, sao ´ ˜ deste linker nao ˜ e´ completamente tura secundaria, chamado de linker. A funçao ˜ exploradas algumas de suas propriedades f´ısicoconhecida e nesta tese serao qu´ımicas. 9.

(41) 1.4.1. Sinergismo. ´ dos varios ´ Atraves experimentos realizados principalmente em celulases, foi observado que a atividade coletiva das endo e exoglucanases e´ maior do ˆ que a das enzimas individuais. Este fenomeno chama-se sinergismo. Foram relatadas quatro formas de sinergismo [14]: 1) Sinergismo endo/exo entre as endoglucanases e as exoglucanases de modo que as endoglucanases providenciam novas extremidades do substrato para as exoglucanases atuarem. 2) Sinergismo exo/exo entre as exoglucanases atuando em extremidades ˜ redutora e nao-redutora do substrato. ˜ de microscopia de força atomica ˆ Uma observaçao junto com os ensaios ´ de atividade enzimatica [15] trata um substrato preparado de mistura de celulose cristalina e a celulose amorfa e as celulases de Trichoderma reesei. As celulases estudadas foram as exoglucanases: a celobiohidrolase I que atua da extremidade redutora de substrato e a celobiohidrolase II que atua da extremi˜ dade nao-redutora; e uma endoglucanase. Foi mostrado que a endoglucanase junto com a celobiohidrolase I fornecem uma superf´ıcie da celulose de maior ˜ amorcristalinidade acess´ıvel para a celobiohidrolase II removendo as regioes ´ fas. Depois, a celobiohidrolase atua liberando cadeias amorfas novas. Alem ˜ previa ´ disso, sem a açao da endoglucanase, as exoglucanases foram pouco ˆ enzimas separadaativas na celulose. A soma das atividades de todas as tres mente foi menor do que a atividade da mistura das enzimas. 3) Sinergismo entre exoglucanases e β-glicosidases que clivam a celobiose, o produto das exoglucanases. As β-glicosidases atuam nos substratos de duas ˜ previa ´ unidades glicos´ıdicas, as celobioses, ou seja, precisam de açao das en´ zimas que liberam este produto. Tambem, as β-glicosidases consomem celo10.

(42) ˜ inibidores da atividade enzimatica ´ biose, que por uma vez, sao das exoglucanases e endoglucanases. ˜ 4) Sinergismo intramolecular entre o dom´ınio catal´ıtico e o dom´ınio de ligaçao ao substrato. ˜ de enzima inteira na suSabe-se que o dom´ınio CBM aumenta adsorçao perf´ıcie da celulose e assim aumenta a atividade da enzima [16]. Por exemplo, a endoglucanase 2 e a endoglucanase 5 de Thermomonospora fusca expressas ˜ significativa tanto na atividade quanto na casem CBM exibem uma reduçao pacidade de interagir com a celulose cristalina [17]. A atividade foi determinada incubando enzimas com substrato e medindo a quantidade de açucares redu´ ˜ produto da reaçao ˜ da hidrolise. ´ tores que sao Para os ensaios da capacidade ˜ uma soluçao ˜ das enzimas foi misturada com a celulose cristalina de interaçao, ˜ foi medida com e incubadas. Depois, a quantidade de enzima livre em soluçao os ensaios de atividade.. 1.4.2. Estrutura intacta. ˜ enzima-substrato no Para melhor entender o mecanismo f´ısico da interaçao caso das enzimas modulares, e´ preciso modelar a estrutura da enzima intacta. ´ Nesta tese uma modelagem sera´ feita combinando a estrutura cristalografica ˆ e estrutura de espalhamento de raios X de baixo angulo (SAXS) da endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. campestris. ˜ atomica ˆ A estrutura de enzima com resoluçao e´ normalmente obtida pela ˆ ´ ´ cristalografia de raios X ou pela Ressonancia magnetica nuclear. Porem, a ˜ estaveis ´ ´ cristalografia e´ restringida a descrever conformaçoes de macromoleculas ˜ sao ˜ em cristal. Normalmente os dom´ınios muito flex´ıveis, como linkers, nao ´ capturados pela cristalografia e existem estruturas dos dom´ınios enzimaticos ´ apenas separadamente. A Figura 1.8 representa a estrutura cristalografica 11.

(43) dos dom´ınios CCD e CBM da Endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. campestris.. ´ Figura 1.8. Estrutura cristalografica de uma celulose resolvidada separadamente para os dom´ınios CCD e CBM.. ˆ ˜ O espalhamento de raios X de baixo angulo (SAXS) oferece informaçao ´ ˜ e dom´ınios flex´ıveis com complementar sobre forma de biomolecula em soluçao ˜ consideravelmente mais baixa. A Figura 1.9 representa estruuma resoluçao tura SAXS da Endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. campestris... Figura 1.9. Estrutura de SAXS de uma celulase bimodal. ´ Juntas, estas tecnicas podem fornecer modelo de multi-escalas para criar ´ ´ descrever mecanismos uma imagem completa da macromolecula e tambem ´ alostericos, supramoleculares etc. No banco de dados PDB [18] existem es˜ atomica. ˆ truturas de dom´ınios separados resolvidos em resoluçao O problema ˜ relativa dos dom´ınios no espaço e a conformaçao ˜ em soluçao ˜ e´ a orientaçao ´ ˜ atomica ˆ no caso das estruturas cristalograficas. Para combinar resoluçao com 12.

(44) os dados de SAXS e obter uma estrutura tridimensional para a enzima intacta ˜ ˆ usamos simulaçoes de dinamica molecular para gerar um grande conjunto de ˜ ´ conformaçoes e calcular espalhamento SAXS teorico que depois sera´ comparado com os dados experimentais. Na literatura existem estudos de mode˜ com estrutura de baixa resoluçao ˜ como: programas para o lagem em soluçao ´ ´ ˜ calculo de curva SAXS teorica baseada em multiplas conformaçoes [19, 20], ´ ˆ Ajuste Flex´ıvel por Dinamica Molecular (MDFF), que realiza o encaixe de es´ ˜ [21], comparaçao ˜ de trutura cristalografica em estrutura de baixa resoluçao ´ ˜ por MD curva SAXS teorica com a experimental depois de obter conformaçoes [22, 23].. 13.

(45) 14.

(46) Cap´ıtulo 2. Objetivos. ˜ de Dinamica ˆ O objetivo desta tese foi a aplicaçao Molecular para o estudo ˜ de biomassa celulosica ´ de prote´ınas envolvidas na conversao em pequenas ´ ´ moleculas de açucares. A tecnica de MD e´ empregada para explorar mecanis˜ nao-covalentes ˜ ˜ de hidrolise. ´ mos de interaçoes que precedem a reaçao O foco principal deste trabalho foram quatro problemas diferentes: 1) Endoglucanase sem CBM. Entender como a endoglucanase 3 de Trichoderma harzianum e´ capaz de ´ ˆ reconhecer, ligar-se e hidrolisar as cadeias celulosicas na ausencia do dom´ınio ˜ ao carboidrato. de ligaçao 2) Seletividade da Endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. campestris. Explicar a seletividade da Endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. campestris quanto ao comprimento do substrato. Entender por que a Endoglu˜ cliva cadeias de celulase menores que quatro glicoses de compricanase nao mento. ˆ 3) Propriedades mecanicas do linker da XccEG. ˆ Explorar a sequencia espec´ıfica do linker de XccEG, que consiste em doze ˆ blocos de prolina e treonina intercaladas, estudando propriedades mecanicas, 15.

(47) como a elasticidade. 4) Modelagem com SAXS. ´ ˆ ` estruturas Adaptar a tecnica de Ajuste Flex´ıvel por Dinamica Molecular as ´ ˜ de SAXS para modelagem de estrutura intacta de biomoleculas em soluçao. Aplicar a` endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. campestris e comparar com os resultados experimentais.. 16.

(48) Cap´ıtulo 3. ˆ Metodologia: Dinamica Molecular. ˜ de biomassa celulosica ´ Para o estudo de prote´ınas envolvidas na conversao ´ ˜ ˜ em pequenas moleculas de açucares e suas interaçoes nao-covalentes com ´ ˜ investigados nesta tese, a tecnica ´ ˆ substratos, que sao de dinamica molecular e´ empregada. ˆ A dinamica molecular trata o sistema classicamente em que a estrutura ˆ ´ ´ eletronica dos atomos e´ tratada implicitamente. Porem, este modelo simplificado consegue capturar bem as propriedades f´ısicas porque o campo de força ´ ˆ ˜ utilizado e´ parametrizado por calculos quanticos e dados experimentais. Nao ˜ qu´ımicas ou polarizaçao ˜ (no caso dos modelos de e´ poss´ıvel modelar reaçoes ´ ˜ nao-covalentes ˜ atomos de carga constante), mas e´ poss´ıvel modelar interaçoes ˜ a base molecular de reconhecimento biomolecular [24]. que sao ˆ ˜ de esA dinamica molecular foi apresentada pela primeira vez na aplicaçao ˜ feras r´ıgidas no ano 1957 [25]. Muitas informaçoes importantes sobre o comportamento dos l´ıquidos simples surgiu a partir destes estudos. A primeira ˜ de prote´ına apareceu em 1977 no trabalho do inibidor de tripsina simulaçao ´ ˜ ˆ pancreatica bovina [26]. Hoje, na literatura, existem simulaçoes de Dinamica Molecular de prote´ınas solvatadas, complexos DNA-prote´ına, bem como sis17.

(49) temas de lip´ıdeos, abordando uma variedade de problemas incluindo a terˆ ˜ ao ligante e o enovelamento de prote´ınas pequenas. modinamica da ligaçao ´ do aumento da complexidade dos sistemas abordados, o numero Alem de ´ ´ ˜ tem expandido. Nos anos setenta do seculo ´ tecnicas de simulaçao XX apareceu ´ ˆ ˆ ˆ ´ uma tecnica mista mecanica quantica - mecanica classica, que e´ empregada ˜ enzimaticas ´ para estudar as reaçoes no contexto da prote´ına completa [27]. O ˆ ˆ cientistas que desenpremio Nobel de Qu´ımica de 2013 foi outorgado a tres ´ ´ volveram esta tecnica [28]. Agora existem muitas tecnicas especializadas para ´ problemas espec´ıficos, incluindo calculos de energia livre, modelagem estrutu´ ˜ de dinamica ˆ ˜ largamente utilizadas ral etc. Tecnicas de simulaçao molecular sao em processos de refinamento de resultados experimentais, tais como cristalo˜ da estrutura de Ressonancia ˆ ´ grafia de raios X e a determinaçao Magnetica Nuclear. ˜ de dinamica ˆ ´ Uma simulaçao molecular exige calculos muito extensos porque ˜ os processos que ela aborda envolvem um numero grande de interaçoes en´ ´ ´ tre atomos e escalas de tempo diferentes. Os metodos atuais e o poder de ˜ permitem simulaçoes ˜ de sistemas de um milhao ˜ de atomos ´ computaçao (grande o suficiente para a maioria das prote´ınas de interesse) por centenas de nanosse˜ constantemente superados pela evoluçao ˜ cont´ınua gundos, os limites que sao de arquitetura de computadores. Um exemplo de alto custo computacional da ˆ ˜ de um microssegundo de um sistema dinamica molecular e´ que uma simulaçao ´ relativamente pequeno (aproximadamente 25000 atomos) realizado em 24 pro´ cessadores demora varios meses para completar [30].. 3.1. ´ Fundamentos teoricos. ˆ ´ ˜ computacional que propaga Dinamica molecular e´ uma tecnica de simulaçao ˜ sistema no tempo com equaçoes baseadas na segunda lei de Newton, para 18.

(50) ´ cada atomo [31], [32]: 2. d ~ri F~i = mi 2 dt. (3.1). ´ imposs´ıvel resolver as integrais devido ao numero E enorme de part´ıculas e ´ ˜ ˜ as equaçoes ˜ ˜ resolvidas discretamente, interaçoes, entao de movimento sao ˜ computapasso a passo. O algoritmo mais usado atualmente nas simulaçoes ´ cionais das biomoleculas e´ Velocity-Verlet [31]. Este algoritmo e´ usado por ˆ ˜ causa de conveniencia de calcular posiçoes e velocidades ao mesmo passo ˜ de tempo, o que significa que todas as propriedades derivadas daqui serao ˜ de cada atomo ´ ˜ calculadas da sincronizadas. As posiçoes em cada passo sao seguinte maneira:. ~r(t + ∆t) = ~r(t) + ~v (t)∆t +. 1 F~ (t) 2 ∆t 2 m. (3.2). Onde t e´ tempo, F~ a força calculada a partir do potencial V (~r) e m a massa da ´ ˜ do part´ıcula. A força do proximo passo, F~ (t + ∆t), e´ obtida a partir da posiçao passo t + ∆t: ~ (~r(t + ∆t)) F~ (t + ∆t) = −∇V. (3.3). ˜ calculadas da seguinte maneira: e em seguida as velocidades sao. ~v (t + ∆t) = ~v (t) +. F~ (t) + F~ (t + ∆t) ∆t 2 m. (3.4). ˜ ˜ e velocidades iniciais sao ˜ necessarias. ´ Para resolver estas equaçoes, posiçoes ´ ˜ distribu´ıdas aleatoriamente assim As velocidades iniciais de cada atomo sao ˜ de Maxwell-Boltzmann para uma temperatura deque satisfaçam a distribuiçao ˜ ´ ˜ desejada. As posiçoes iniciais de atomos da prote´ına e do substrato sao terminadas experimentalmente, normalmente pela cristalografia de raios X. A ˜ e´ suficientemente sens´ıvel para detectar raios escristalografia de raios X nao. 19.

(51) ´ ˆ ˜ de hidrogenios ˆ ˜ depalhados de atomos de hidrogenio, por isso as posiçoes sao ˜ ao meio onde se encontram. Os terminadas computacionalmente em relaçao ˜ de aminoacidos ´ ´ ˜ determinados estados da protonaçao ou outras moleculas sao calculando os valores de pKa a um pH desejado. ˜ entre diferO campo de força e´ a energia potencial que descreve interaçoes ´ ´ das interaçoes ˜ ´ ˜ covalentemente ligaentes atomos atraves entre atomos nao dos, representadas pelos potenciais de Lennard-Jones e de Coulomb, e das ˜ ´ ˜ interaçoes entre atomos ligados, descritas pelos estiramentos e deformaçoes ˜ ˜ de diedros como na forma aqui angulares das ligaçoes covalentes e a torçao representada [38]: XX σij σij qi qj (4ij [( )12 − ( )6 ] + )+ r r 4π r ij ij 0 ij i j6=i X X X kφn [1 + cos(nφ − δn )]+ kθ (θ − θ0 )2 + kb (b − b0 )2 + + ~ = V (R). ang. lig. +. X. (3.5). died. kω (ω − ω0 )2 +. X. ku (u − u0 )2. U rey−Bradley. died−impr. O primeiro termo da primeira soma, que e´ o potencial de Lennard-Jones, ˜ ´ descreve as interaçoes de van der Waals entre dois atomos i e j, separados ˆ ˆ por uma distancia rij , onde σ e´ a distancia em que o potencial inter part´ıculas e´ zero e ij e´ a profundidade do potencial. O segundo termo da primeira soma de˜ eletrostaticas ´ ˆ ´ screve as interaçoes ou Coulombicas entre dois atomos i e j, com ˆ cargas parciais q i e q j , respectivamente, separados por uma distancia rij , onde 0 ´ ˜ que e´ a constante de permissividade do vacuo. Na segunda soma da equaçao, ˜ qu´ımica, k b e´ a constante de força, b representa o estiramento de uma ligaçao ˆ ´ ˆ ´ a distancia entre dois atomos e b0 a distancia de equil´ıbrio entre esses atomos covalentemente ligados. Na terceira soma, k θ representa a constante de força ˜ angular, θ e´ o angulo ˆ ˆ atomos ´ associada a` deformaçao normal entre os tres e. 20.

(52) θ. 0. ˆ ˜ diedrais, e´ descrita e´ o angulo de equil´ıbrio. Ja´ a quarta soma, de torçoes. por uma soma de cossenos em que k φ n e´ a constante relacionada a` altura da barreira potencial; n e´ a multiplicidade, que determina o numero de pontos ´ ˜ completamente; φ e´ o valor do angulo ˆ m´ınimos na curva ao rotacionar a ligaçao ˆ ˆ diedro; δ n e´ o valor do angulo de fase, que determina quando o angulo torsional ˜ representam a interaçao ˜ entre quapassa por uma ponto de m´ınimo. As torçoes ´ ´ ˜ tro atomos ligados sucessivamente. A quinta soma, responsavel pelas torçoes ´ ˜ fora do plano, como as que ocorrem improprias e´ usada para tratar distorçoes ˆ ´ nos hidrogenios aromaticos, por exemplo. k ω e´ a constante de força e ω − ω 0 e´ o ˆ angulo fora do plano. A ultima soma do potencial interno e´ o Urey-Bradley, que ´ ´ ˜ qu´ımicas. e´ um termo cruzado entre dois atomos separados por duas ligaçoes ˆ Esse termo e´ usado para que os parametros melhor reproduzam o espectro viˆ bracional experimental, dado que apenas os termos harmonicos de estiramento ˜ angular de alguns atomos ´ ˜ ser suficientes. e deformaçao podem nao ˆ ˜ 3.5 para uma grande variedade Parametros como σ, , k b etc. da equaçao ´ ´ de moleculas e atomos encontram-se determinados, incluindo solventes, ´ıons, polipept´ıdeos, bases nucleot´ıdicas, lip´ıdeos, sacar´ıdeos, etc. Uma caracter´ıstica ˆ ˆ geral de campos de força e´ a transferibilidade de parametros. Assim os parametros ´ ˜ usados em todas as prote´ınas. de aminoacidos sao O sistema a ser simulado computacionalmente e´ constru´ıdo a partir de estru´ ´ ´ tura cristalografica das biomoleculas, moleculas de solvente distribu´ıdas aleato´ riamente em volta das biomoleculas e normalmente NaCl e´ adicionado para ´ eletroneutralizar sistema e imitar o ambiente fisiologico. Muitas vezes esta ˜ espacial de part´ıculas resulta em maus contatos entre elas. Antes distribuiçao ˜ ´ de realizar simulaçoes, e´ necessario minimizar a energia de sistema para elim´ ´ inar a energia repulsiva excessiva entre a estrutura cristalografica e atomos ˜ A minimizaçao ˜ de energia e´ um procediadicionados na caixa de simulaçao.. 21.

(53) ˜ de part´ıculas no sentido de diminuir a energia mento de mudança de posiçoes potencial total do sistema. ˜ Em seguida, o sistema e´ equilibrado por MD. Isto e´ preciso porque as posiçoes ´ ˜ redos atomos do solvente de um sistema criado computacionalmente nao ˜ para relaxar o sistema de uma fletem uma imagem real do sistema. Entao, ˜ artificial, e´ preciso simular um tempo ate´ equilibraçao ˜ de algumas situaçao ˜ de posiçoes. ˜ ´ grandezas como temperatura, energia e flutuaçao A trajetoria ´ ˆ ˆ depois deste ponto e´ considerada em analise de termodinamica ou dinamica ´ ˜ e´ normalmente realizada por partes, fixando do sistema. Uma pre-equilibrac ¸ ao ˜ atrapalhe o partes do sistema de forma que relaxamento de uma parte nao relaxamento de uma outra parte do sistema. Por exemplo, sistema e´ equili´ ´ brado com os atomos da prote´ına fixos e em seguida com os atomos apenas de cadeia principal de prote´ına fixos, e finalmente com todas as part´ıculas livres para se movimentar. Nesta tese sera´ usado o programa NAMD [40] que usa o algoritmo Velocity˜ das equaçoes ˜ de movimento de atomos. ´ Verlet [31] para a resoluçao O NAMD e´ ˆ ˜ de energia. A minimizaçao ˜ usado tanto para a dinamica quanto para minimizaçao ´ do metodo ´ ˜ e´ feita atraves dos Gradientes Conjugados [42]. As posiçoes dos ˆ ˜ determinadas computacionalmente atraves ´ da extensao ˜ Psfhidrogenios sao ˜ de aminoacidos ´ ˜ gen do programa VMD [34]. Os estados da protonaçao sao ˜ de determinados calculando valores pK a um pH desejado e a aproximaçao solvente cont´ınuo usando o servidor H++ [35–37]. O campo de força usado e´ CHARMM22 para prote´ınas [38] e CHARMM36 para carboidratos [39]. O campo de força CHARMM foi desenvolvido tanto a partir de dados experimen´ ˆ ´ tais quanto de calculos quanticos [40]. O modelo para agua e´ TIP3P [38].. 22.

(54) 3.2. ˜ Aproximaçoes e v´ınculos. ˆ A dinamica molecular trata sistemas de muitas part´ıculas que exige um numero enorme de potenciais de pares. Como e´ imposs´ıvel resolver analiti´ ˜ ˜ e tambem ´ para diminuir o camente equaçoes de movimento nesta condiçao ´ ˜ sao ˜ empregadas. custo computacional, varias aproximaçoes ´ Para aproximar os resultados dos calculos aos dados experimentais, e´ preˆ ciso simular um numero representativo de part´ıculas do estado termodinamico. ´ ˜ grande com os Na MD seria imposs´ıvel tratar um numero de part´ıculas tao ´ custos computacionais de hoje. Em vez disso, um numero de part´ıculas rep˜ de contorno periodico ´ resentativo e´ usado junto com a condiçao de uma caixa ˜ Quando uma part´ıcula sai da caixa, ela aparece do lado oposto, de simulaçao. ˜ preservando o numero de part´ıculas e o momento total do sistema. A condiçao ´ ´ periodica diminui os efeitos de superf´ıcie de l´ıquido e assim mimetiza o seio da ˜ soluçao. ˜ ˜ Interaçoes nao-covalentes exigem um custo computacional grande porque ´ teoricamente cada um dos atomos interage com cada um, no espaço infinito. ˜ ˜ Interaçoes nao-covalentes de curto alcance como as de Van der Waals de˜ caem no m´ınimo com r-6 . Nos algoritmos de simulaçoes computacionais, es˜ sao ˜ normalmente truncadas depois de um raio de corte esferico ´ tas interaçoes ˚ para prote´ınas [33, 42]. Para evitar a queda de magnitude da ordem de 10A ˜ de Van der Waals, sao ˜ usadas funçoes ˜ suavizantes a partir abrupta de interaçao de r igual ao raio de corte ate´ um r onde o potencial e´ zero. ˜ ´ ˜ de maior alcance, decaem com r-1 , entao ˜ As interaçoes eletrostaticas sao ˜ ainda apresentam um valor significativo. Em na borda da caixa de simulaçao ˜ ´ vez de corte abrupto de interaçoes, o metodo baseado em somas de Ewald ´ um artif´ıcio matematico ´ (Particle Mesh Ewald) [41] e´ usado. Este contem usado ˜ das equaçoes. ˜ ´ ˆ dina resoluçao Um numero infinito de replicas da caixa em tres ´. 23.

(55) ˜ e´ considerado. A soma que representa a energia total eletrostatica ´ mensoes no ´ conjunto de infinitas replicas da caixa diverge, ou converge muito lentamente. O ´ ˜ artif´ıcio matematico consiste em multiplicar o membro da soma por uma funçao de forma que a soma convirja rapidamente e que a outra parte adicionada para anular convirja rapidamente no espaço rec´ıproco. Espaço rec´ıproco e´ a transformada de Fourier do espaço real. ˜ o metodo ´ Para poupar tempo de computaçao, de multiplos passos de tempo ´ ˜ ˜ calculadas e´ usado. Interaçoes que mudam com velocidades diferentes sao ˆ ˜ com frequencias diferentes. Um passo de tempo maior corresponde a interaçao ˜ de ser multiplos que muda mais lentamente. Estes passos diferentes hao in´ ˜ ˜ calculadas teiros um do outro. Por exemplo, interaçoes Van der Waals sao ˜ ´ a cada passo e as interaçoes eletrostaticas a cada dois passos. O programa NAMD usa o algoritmo RESPA (reference system propogator algorithm) [42, 43]. ˜ numerica ´ ˜ do sistema O algoritmo RESPA e´ baseado na soluçao das equaçoes ˆ ˆ ˆ de referencia. A essencia do algoritmo e´ de definir um sistema dinamico de ˆ ´ ˜ de movimento para referencia para os movimentos rapidos e derivar equaçoes ´ o desvio das coordenadas rapidas a partir das coordenadas do sistema de reˆ ˜ acoplados as ` equaçoes ˜ de movimento das coordeferencia. Estes desvios sao ˆ ´ nadas lentas. O sistema dinamico rapido e´ integrado por n pequenos passos ˜ iniciais para de tempo nδt mantendo as coordenadas lentas fixas. As condiçoes ˜ escolhidas para que este desvio seja semcada passo de tempo grande nδt sao pre mantido pequeno. ´ ˜ usados para definir propriedades macroscopicas ´ Varios v´ınculos sao dese˜ usados jadas e assim imitar o sistema real que se quer estudar. Sempre sao ˜ de momento e momento angular para sistemas fechav´ınculos de conservaçao ˆ dos. Para definir a temperatura, a dinamica de Langevin e´ usada, e para definir ˜ usa-se metodo ´ ˆ pressao de Langevin-Hoover [33]. Na dinamica de Langevin, a. 24.