Crescimento do isolado de Candida oleophila em meios com compostos fenólicos como única fonte de carbono e energia

Como se discutiu no ponto anterior, o isolado de Candida oleophila em estudo é capaz de usar uma elevada variedade de compostos, como fontes de carbono e energia. A capacidade de usar compostos químicos como única fonte de carbono e energia, permite ao microrganismo sobreviver em meios onde esse composto exista isoladamente, ou não, mesmo quando a substância em estudo apresente algumas características de toxicidade. Para aferir desta capacidade, inocularam-se balões de Erlenmeyer com diferentes concentrações de compostos fenólicos, e avaliou-se a capacidade da C. oleophila em utilizá-los como única fonte de carbono e energia.

Foram utilizados compostos fenólicos pertencentes aos fenóis monoméricos, por serem referenciados como mais tóxicos (Capasso et al., 1995; Isidori et al., 2005). Dentro destes escolheu-se entre os sub-grupos (simples, ácidos fenolcarboxílicos, fenilpropanóides) compostos com substituintes distintos (grupos hidroxilo e metoxilo) em posições diferentes do anel benzénico (carbono 2-orto, carbono 3-meta e carbono 4-para) que tivessem os seus equivalentes nos respectivos sub-grupos. Importa, ainda, referir que as substâncias químicas usadas como exemplos bem como as concentrações escolhidas (1000 mg/L, 100 mg/L, 10 mg/L), são comuns nas águas residuais dos lagares de azeite (Lesage-Meesen et al., 2001; Casa et al., 2003; Allouche et al., 2004; Chtourou et al., 2004; Isidori et al., 2005; Dimitrios, 2006; De Marco et al., 2007; Asses et al., 2009a,b).

Testaram-se três concentrações diferentes de três grupos de compostos fenólicos de baixo peso molecular. Os resultados das experiências de crescimento do isolado encontram-se na Tabela 5.3.

  CAPÍTULO 5 

Tratamento de águas ruças por uma estirpe de Candida oleophila isolada de águas residuais  

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Pela análise dos resultados obtidos verificou-se que a concentração de 10 mg/L se revelou menos vantajosa para a levedura sendo insuficiente para permitir o crescimento do isolado.

À concentração de 1000 mg/L para os ácidos fenilpropenóides, a estirpe em estudo apresentou crescimento com os ácidos 4-hidroxicinâmico e 3,4-di- hidroxicinâmico. Quanto aos ensaios com os ácidos fenolcarboxílicos, à mesma concentração de 1000 mg/L, verificou-se crescimento apenas para os ácidos não metoxilados, ácidos 4-hidroxibenzóico e 3,4-di-hidroxibenzóico. Nos dois casos, a fase de latência observada, foi longa. Para o ácido 4-hidroxibenzóico foram necessários cerca de dois dias para iniciar o crescimento, enquanto para o ácido 3,4-di- hidroxibenzóico esta fase de adaptação se prolongou até aos seis dias de incubação. De todo o modo, após esta fase inicial, o crescimento ocorreu muito rapidamente.

Quando as fontes de carbono e energia foram os ácidos fenilpropanóides, também os compostos usados pelo isolado são apenas hidroxilados, não possuindo substituintes metoxilo nos seus anéis. Também se verificaram fases de adaptação iniciais longas, que foram de quatro dias para o ácido 4-hidroxicinâmico e de três dias para o ácido 3,4-di-hidroxicinâmico. Não existe paralelismo, quanto às fases de latência, relativamente aos compostos fenolcarboxílicos (Tabela 5.3.). No entanto, no caso do ácido 3,4-di-hidroxicinâmico, o crescimento ocorreu até atingir uma absorvância a 640 nm mais baixa do que os casos anteriores. Esta toxicidade pode ser causada pelo composto em si, considerando que a levedura não terá esgotado as concentrações deste no meio, ou ainda pelos produtos resultantes do seu metabolismo que podem ser tóxicos.

Os compostos fenólicos que permitiram o crescimento do isolado de Candida

oleophila com concentrações de 1000 mg/L têm os substituintes nas posições meta

(carbono 3) e para (carbono 4) do anel benzénico. Os compostos cinâmicos permitiram crescimentos mais rápidos, e os ácidos benzóicos com dois grupos hidroxilo, pareceram ser mais favoráveis ao metabolismo do microrganismo.

A levedura revelou capacidade para assimilar compostos fenólicos à concentração de 100 mg/L, compostos estes diferentes daqueles que permitiram o crescimento a concentrações mais elevadas, com excepção do ácido 3,4-di- hidroxicinâmico. Neste caso, o crescimento foi verificado para o catecol (do primeiro grupo), ácidos 4-hidroxi-3-metoxibenzóico e 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzóico (do segundo grupo), e ácido 3,4-di-hidroxicinâmico (do terceiro grupo).

Comparando o crescimento verificado usando fenóis à concentração de 1000 mg/L, com os resultados obtidos para o crescimento com fenóis à concentração de 100 mg/L, sobressai o facto de que as fases de latência para a concentração mais

UBR

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baixa foram claramente inferiores, não ultrapassando em nenhum caso as 24 horas de incubação.

Dos compostos fenólicos simples testados (catecol e hidroquinona) apenas o catecol permitiu o crescimento da estirpe. À concentração de 100 mg/L o isolado cresceu rapidamente, tendo atingido absorvâncias elevadas num curto período de incubação.

O único composto do grupo dos fenilpropanóides a permitir o crescimento do isolado de Candida oleophila a duas concentrações distintas foi o ácido 3,4-di- hidroxicinâmico (Tabela 5.3.).

Tabela 5.3. Crescimento e fases de latência do isolado de Candida oleophila quando usa como única fonte de carbono e energia, compostos fenólicos, ás concentrações de 10, 100 e 1000 mg/L.

Composto fenólico

Concentrações em mg/L

Crescimento Fase de Latência (dias) Catecol (1,2-di-hidroxifenol) 10 100 1000 Hidroquinona (1,4-di-hidroxifenol) 10 100 1000 - + - - - - 1 Ác. 4-hidroxibenzóico 10 100 1000 Ác. Protocatéquico (Ác.3,4-di-hidroxibenzóico) 10 100 1000 Ác. 2,5-dihidroxibenzóico 10 100 Ác. Vanílico (Ác. 4-hidroxi-3-metoxibenzóico) 10 100 Ác.Siríngico (Ác. 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzóico) 10 100 - - + - - + - - - + - + 2 6 1 1 Ác. P-cumárico (Ác. 4-hidroxicinâmico) 10 100 1000 Ác. Cafeico (Ác. 3,4-di-hidroxicinâmico) 10 100 1000 Ác. Ferúlico (Ác. 4-hidroxi-3-metoxicinâmico) 10 100 - - + - + + - - 4 1 3

(-) não cresceu (variação absorvância menor que 0,5); (+) cresceu (variação da absorvância maior que 0,5).

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Em todas as experiências em que se registou crescimento, ocorreram fases de latência alargadas, que se terão revelado fundamentais para a síntese de novas enzimas que permitiram o metabolismo dos compostos presentes no meio.

Dos compostos fenólicos testados, o catecol, os ácidos 4-hidroxi-3- metoxibenzóico, 3,4-di-hidroxicinâmico e 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzóico (por esta ordem) e à concentração de 100 mg/L são os que mais rapidamente são metabolizados. Com excepção do catecol, e dos substituintes do carbono 1 do anel benzénico, que caracterizam cada grupo em estudo, estas substâncias, apresentam grupos substituintes hidroxilo e metoxilo nos carbonos 3 e 4 dos anéis fenólicos, que parece ser uma característica que favorece a utilização do composto. As fases de latência na presença destes compostos são mais longas, variando de dois dias (para o ácido 3,4-di-hidroxicinâmico), até seis dias (para o ácido 3,4-di-hidroxibenzóico). O ácido 4-hidroxibenzóico também permite o crescimento do isolado de Candida

oleophila, à concentração de 1000 mg/L. Foi ainda possível verificar que nos casos em

que o composto fenólico foi metabolizado ocorreu uma descida do pH do meio. O pH inicial que se aproximava de cinco em todas as amostras (variando de 5,76 para o catecol até 4,83 para o ácido 4-hidroxibenzóico) desceu para valores próximos de três (de 2,34 para o catecol até 2,46 para o ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzóico).

Dos resultados que se obtiveram com estes ensaios, não parece ter influência para o crescimento da estirpe, o facto dos compostos serem fenóis simples, pertencerem ao grupo dos ácidos fenolcarboxílicos ou dos ácidos fenilpropanóides. O que parece ser mais importante para o metabolismo microbiano é o tipo de substituinte, o número de substituintes e a posição do anel benzénico em que o substituinte está localizado.

As posições 3 e 4, respectivamente meta e para, ou associações de ambas parecem favorecer a degradação do núcleo benzénico pelo microrganismo. O substituinte mais favorável parece ser o grupo hidroxilo, apesar de substituições pelo grupo metoxilo manterem a performance do isolado quanto à utilização do composto fenólico como fonte única de carbono e energia.