possível identificar até à espécie.
Apesar de terem surgido, nos grupos B e C, como isolados provenientes de incubações de amostras de AL, os isolados de C. oleophila e C. pomicola identificados nos agrupamentos D e E apenas foram obtidos em amostras de água ruça. Este facto pode mostrar que estas espécies revelaram capacidades adaptativas marcantes e vantajosas, uma vez que resistiram às condições mais desfavoráveis registadas nas amostras das águas ruças.
Os isolados de C. oleophila em questão, e cujos perfis são encontrados nos grupos B e C, obtidos nas amostras de AL, e nas amostras de DEC, e os encontrados nos grupos D e E, isolados de AR, resultaram na mesma identificação relativamente à espécie, após processo de sequenciação. No entanto, as amostras têm perfis electroforéticos com similaridades que justificam a sua colocação em grupos diferentes. Este facto pode sugerir que se trata de indivíduos pertencentes a estirpes distintas.
São escassas as publicações referentes à identificação de leveduras encontradas em águas residuais de lagares de azeite. Das referências consultadas, apenas se encontraram caracterizações microbiológicas de efluentes de lagares de azeite resultantes da investigação e publicação feitos por Mouncif et al (1993), Giannoutsou et al (2004), e mais recentemente Sassi et al (2008). Estes autores procederam à identificação de microrganismos que obtiveram a partir de águas ruças de lagares de três fases e efluentes de um lagar de duas fase (ecológico).
O grupo de Mouncif et al. (1993) identificou alguns isolados de leveduras, tendo encontrado indivíduos pertencentes aos géneros Pichia e Debaryomyces (os mais abundantes), Saccharomyces, Candida, Schizosaccharomyces e Rhodotorula. Estas identificações foram realizadas com base apenas em testes fisiológicos e bioquímicos, mas as espécies referidas por estes autores foram também identificadas no lagar em análise neste trabalho.
Das lamas resultantes da extracção em duas fases, Giannoutsou e colaboradores (2004) procuraram conhecer a diversidade em leveduras, não tendo efectuado estudos para determinar a abundância dos diferentes grupos do microbiota. Isolaram 12 leveduras que posteriormente identificaram. A representatividade associada a este número tão pequeno de isolados é uma desvantagem para o estudo. No entanto, os autores identificaram as leveduras como pertencentes aos géneros
Saccharomyces, Candida e Geotrichum. Mais uma vez, os resultados que se
obtiveram com a análise efectuada aos isolados obtidos no lagar em estudo nesta tese são concordantes com os obtidos pela equipa de Giannoutsou et al (2004).
CAPÍTULO 4
Caracterização do grupo de leveduras das águas residuais do lagar contínuo
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Sassi et al (2008) isolou 105 leveduras a partir de lagares de azeite em Marrocos, tendo identificado, por métodos moleculares, oito dos isolados que revelaram capacidade de crescer em meio com água ruça. Estes pertencem às espécies Pichia guilliermondii, Candida ernobii, C.diddiensiae e C.holstii. Os géneros de leveduras a que pertencem estes isolados marroquinos são concordantes com os géneros encontrados no lagar que foi analisado neste trabalho.
As publicações referidas, corroboram também a conclusão referida após análise do dendrograma da Figura 4.7, de que as leveduras dos géneros Candida e
Pichia podem apresentar melhores capacidades de adaptação a ambientes com níveis
altos de compostos fenólicos e ácidos gordos voláteis.
Os procedimentos normalmente utilizados para a identificação de leveduras baseiam-se nos aspectos morfológicos distintos apresentados pelas colónias e nas respostas dessas colónias a uma série de testes de fermentação e assimilação de diversos compostos (normalmente glúcidos e compostos azotados). Os resultados são muitas vezes ambíguos devido às pequenas diferenças que podem ocorrer entre estirpes, levando a identificações erróneas. Do mesmo modo, quando o número de amostras a analisar é elevado, como é o caso deste trabalho, o tempo dispendido, bem como o material e reagentes utilizados, que são dispendiosos, podem dificultar a realização dessa tarefa. Assim, o recurso a comparações baseadas em características moleculares das amostras foi a opção tomada.
Realizaram-se experiências que permitiram a obtenção de um perfil molecular do genoma nuclear das amostras isoladas, recorrendo á técnica de tipagem com um
primer único – T3B, e ainda se procedeu à sequenciação da região D1/D2 do DNAr
26S em algumas amostras. Esta escolha recaiu sobre as que foram isoladas a partir de amostras das águas ruças, pelas razões já indicadas atrás. Alguns isolados obtidos nos outros pontos de amostragem estudados, apresentaram perfis electroforéticos semelhantes às seleccionadas, e por essa razão foram também sequenciados.
Devido ao número elevado de amostras que se obtiveram neste trabalho, o recurso à técnica de tipagem, como forma rápida de rastrear espécies iguais ou próximas, foi a opção óbvia. É necessário, de futuro, um trabalho de caracterização mais aprofundado dos restantes isolados que se obtiveram, que será, com certeza, efectuado.
As espécies mais representadas, obtidas após uma observação das águas residuais geradas no lagar em estudo, durante duas campanhas oleícolas consecutivas, foram C. oleophila (com onze isolados) e C. pomicola (seis isolados).
Para além de ter sido a espécie mais representada, os isolados de C. oleophila apresentaram uma distribuição/presença em todos os pontos de amostragem. Estes
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factos revelam capacidades de adaptação a ambientes “stressantes”, indicando estes isolados como potenciais candidatos a modelos biológicos para o pré-tratamento e /ou tratamento das águas residuais geradas pelo lagar de azeite da cooperativa Murcense. Estes isolados de C. oleophila, juntamente com os isolados de C.pomicola foram utilizados em ensaios preliminares de crescimento em meios com compostos fenólicos, cujos resultados são apresentados no capítulo 5.
4. Conclusões
A metodologia escolhida para responder aos objectivos definidos para esta parte do trabalho revelou ser adequada permitindo, num curto espaço de tempo, obter um rastreio de um número muito elevado de amostras, e ainda extrair inferências de interesse ecológico sobre os isolados em análise.
Relativamente ao primeiro objectivo, concluiu-se que a maior diversidade em espécies de leveduras é encontrada nas amostras de águas de lavagem. Foi também nestas amostras que se obteve o maior número de isolados.
As condições físico-químicas das águas da centrífuga vertical e das águas ruças não favoreceram o isolamento de um número elevado de leveduras. Concluiu-se que nestes locais o baixo número de isolados é concordante com a menor diversidade em espécies de leveduras encontrada.
Nas águas de lavagem, a espécie identificada predominante, foi a C.oleophila, seguida da espécie Metschnikowia aff fructicola. Nos outros pontos de amostragem surge também a espécie C. oleophila.
Nas águas ruças, as espécies mais abundantes são a C. pomicola e a C.
oleophila. Estas águas, cujas condições físico-químicas têm elevado teor poluente,
apresentam várias outras espécies de leveduras, sendo também de salientar o número de isolados do género Pichia que foram identificados neste local.
A técnica de tipagem seleccionada mostrou-se adequada para rastrear de forma rápida um número elevado de amostras, permitindo analisar a diversidade específica em ambientes cujo microbiota é desconhecido. O primer utilizado revelou capacidades discriminativas muito boas, sendo, inclusive, capaz de discriminar entre indivíduos da mesma espécie.
Concluiu-se, ainda, que para a identificação inequívoca dos isolados é necessário o recurso a outras técnicas de biologia molecular, nomeadamente a sequenciação. A região D1/D2 do DNAr 26S revelou ser adequada para, face às bases de dados disponíveis, permitir classificações ao nível da espécie.
CAPÍTULO 4
Caracterização do grupo de leveduras das águas residuais do lagar contínuo
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A caracterização morfológica, bioquímica e fisiológica das amostras deve ser efectuada para corroborar as diferenças encontradas pela tipagem, entre indivíduos provavelmente pertencentes a diferentes estirpes da mesma espécie.
As espécies com maior número de isolados e encontradas nas águas ruças foram a Candida oleophila e a Candida pomicola. Estes isolados foram seleccionados para ensaios de crescimento em meios ricos em compostos fenólicos como fonte única de carbono.