Determinação dos parâmetros de preparo de amostra

A terceira e última etapa do desenvolvimento do método bioanalítico consiste no estabelecimento de uma técnica de extração dos fármacos do plasma com altas taxas de recuperação e baixos índices de efeito matriz. Essa etapa foi desafiadora por envolver a extração de dois fármacos, com características opostas, como valores de pKa, polaridade e ligação às proteínas plasmáticas, de tal modo que, provavelmente uma determinada técnica seria adequada para um fármaco, mas ineficaz para o outro (PATEL et al., 2012).

Considerando a dificuldade envolvida no desenvolvimento de uma técnica para extração simultânea de NAP e SUM e, visando obter a melhor condição possível, foram avaliadas as três técnicas convencionais de preparo de amostra: ELL; EPT e EFS. Para cada técnica foram incluídas variáveis abrangendo, principalmente, uma ampla faixa de pH. Em cada teste foram avaliados os parâmetros seletividade, efeito

matriz e recuperação em triplicata nas concentrações de CQB e CQA. Para avaliação da seletividade foram utilizadas amostras de plasma branco. A avaliação do efeito matriz foi feita por comparação de amostras de plasma branco extraídas e adicionadas dos analitos e PIs na última etapa da extração com amostras em solução, através da equação (1).

Efeito matriz = Área sob o pico na amostra de plasma x 100 - 100

Área sob o pico na amostra em solução (1)

A recuperação foi avaliada através da comparação de amostras de plasma branco adicionadas de NAP e SUM antes da extração com amostras em solução, sendo expressa como a porcentagem da concentração nominal declarada do analito ou PI na matriz biológica que foi efetivamente extraída no processo, conforme a equação (2). Para evitar diferenças de ionização dos fármacos entre as amostras extraídas e em solução, optou-se por utilizar FM como solução de ressuspensão na última etapa da extração. As soluções de PIs foram adicionadas na primeira etapa da extração em todas as amostras. Não há limites para aprovação da recuperação, já que consiste em um ensaio de qualidade. Portanto, não é necessário que a recuperação seja 100%, mas desejável que as taxas de recuperação dos analitos e dos PIs sejam precisas e constantes dentro da faixa de trabalho (BRASIL, 2003a; FDA, 2013).

Recuperação = Área sob o pico na amostra em solução x 100

Área sob o pico na amostra extraída (2)

Os cálculos dos valores de recuperação e de efeito matriz foram feitos com as devidas correções matemáticas das diluições, concentrações e perdas teóricas dos procedimentos de extração, para que os valores obtidos não fossem sub ou superestimados, resultando em conclusões errôneas sobre a melhor técnica.

Os testes de EPT foram realizados com três solventes precipitantes: metanol; acetonitrila e acetona. Cada solvente foi avaliado com adição de ácido, base ou puro. Também foi avaliada a utilização de ácido tricloroacético a 60% como agente precipitante. No procedimento padrão utilizado, foram adicionados 25 µL de cada

solução de PI, totalizando 50 µL, a um microtubo contendo 250 µL de plasma adicionado de NAP e SUM. Após agitação em vórtex por 20 segundos, foram acrescentados 500 µL de agente precipitante acidificado, basificado ou neutro e o microtubo foi submetido à agitação em vórtex por 60 segundos e centrifugação a 22639 g por 5 minutos a 5 °C. Uma alíquota de 200 µL do sobr enadante foi transferida para vial com insert e 20 µL foram injetados no sistema CLAE-EM/EM. Para avaliação do efeito matriz, a amostra utilizada na comparação consistiu no produto da extração de plasma branco pelo mesmo procedimento, sendo que ao final, 200 µL do sobrenadante foram misturados a 200 µL de uma solução contendo analitos e PIs na mesma concentração do sobrenadante obtido na extração do plasma adicionado de NAP e SUM.

A avaliação da EFS foi feita por meio de quatro testes variando a solução de lavagem e a solução extratora, com alteração da acidez, basicidade e polaridade, para favorecer a extração dos analitos (Tabela 3). Foram utilizados cartuchos de base polimérica para extração em fase reversa de compostos polares e apolares, resistentes a variações de pH de 1 a 14. Antes da extração propriamente dita, cada cartucho foi submetido ao condicionamento com 1 mL de metanol e ao equilíbrio com 1 mL de água ultrapura, sendo que, após cada adição de solvente ou amostra, os cartuchos foram centrifugados em tubos de 10,0 x 1,0 cm a 1986 g por 2 minutos a 5 °C para aumentar a velocidade de vazão do fluido pelo cartucho.

Tabela 3 – Composição das soluções de lavagem e extratoras utilizadas nos testes de EFS para extração simultânea de NAP e SUM em plasma humano.

Teste Solução de lavagem Solução extratora

I Metanol:água

(20:80)

Metanol:acetonitrila:água:ácido acético (60:30:10:0,1)

II Ácido acético 2% em metanol:água

(5:95)

Hidróxido de amônio 2% em metanol:água (50:50)

III Hidróxido de amônio 2% em metanol:água

(5:95)

Ácido acético 2% em metanol:água (50:50)

IV Metanol:água

(20:80)

1ª - Hidróxido de amônio 2% em metanol:água (50:50)

2ª - Ácido acético 2% em metanol:água (50:50)

Para a extração, foram adicionados 25 µL de cada solução de PI, totalizando 50 µL, a um microtubo contendo 250 µL de plasma adicionado de NAP e SUM e, após agitação em vórtex por 20 segundos, o volume total de 300 µL foi transferido para o cartucho de extração. Após incorporação da amostra na base polimérica, 1 mL da solução de lavagem foi passado pelo cartucho, o qual foi, posteriormente, transferido para um tubo limpo. Adicionou-se 500 µL da solução extratora e o extrato obtido foi coletado e transferido para vial com insert, sendo injetados 20 µL no sistema CLAE- EM/EM. Para avaliação do efeito matriz a amostra utilizada na comparação consistiu no produto da extração de plasma branco pelo mesmo procedimento, sendo que ao final, 250 µL do extrato foram misturados a 250 µL de uma solução contendo analitos e PIs na mesma concentração do extrato obtido na extração do plasma adicionado de NAP e SUM.

Os testes de ELL foram realizados com variações na solução extratora e no aditivo adicionado para variar o pH do meio (hidróxido de amônio, ácido fosfórico ou fórmico) ou a solubilidade dos analitos na fase aquosa (sulfato de amônio). O procedimento padrão consistiu na adição de 25 µL de cada solução de PI, totalizando 50 µL, a um tubo de 10,0 x 1,0 cm contendo 250 µL de plasma adicionado de NAP e SUM, além de 25 µL do aditivo. Após agitação em vórtex por 15 segundos, foram acrescentados 2 mL de solução extratora e o tubo foi submetido à agitação em vórtex por 60 segundos e centrifugação a 1986 g por 5 minutos a 5 °C. Uma alíquota de 1600 µL do sobrenadante foi tran sferidas para tubo de 12,5 x 1,5 cm e evaporada em banho a 60 °C sob corrente de a r seco. Ao resíduo seco foram adicionados 200 µL de FM e, após agitação em vórtex por 30 segundos, transferidos para vial com insert, sendo injetados 20 µL no sistema CLAE-EM/EM. Para avaliação do efeito matriz, a amostra utilizada na comparação consistiu no produto da extração de plasma branco pelo mesmo procedimento, sendo que ao final, o resíduo seco foi reconstituído com 200 µL de uma solução contendo analitos e PIs na mesma concentração do sobrenadante obtido na extração do plasma adicionado de NAP e SUM.

Após escolha da melhor técnica de extração, foi preparada uma curva de calibração e CQs com amostras extraídas nos mesmos níveis e replicatas descritos no item 4.2.1.2, para confirmar a linearidade, a sensibilidade, a precisão e a exatidão do