Preparo de amostra

A quantificação de fármacos em matrizes biológicas utilizando a CLAE e a EM como técnicas de separação e de detecção, em geral, exige um tratamento prévio da amostra. O preparo de amostra é a etapa inicial e uma das mais críticas do desenvolvimento de métodos bioanalíticos que utilizam CLAE-EM ou CLAE-EM/EM. Amostras biológicas, como sangue, plasma e soro, são matrizes com constituição complexa, contendo proteínas (albumina e glicoproteína α), sais, lipídeos, anticoagulantes e outros inúmeros componentes. Essas substâncias endógenas e exógenas possuem um alto potencial para redução da estabilidade do fármaco na solução final da extração e são, muitas vezes, incompatíveis com as colunas cromatográficas e com os espectrômetros de massas, provocando degradação ou entupimento da coluna e efeito matriz, principalmente quando se utiliza Ionização por Electrospray (IES). Desse modo, o preparo de amostra destina-se ao fornecimento de uma solução homogenea, reprodutível, contendo os analitos e o mínimo possível de constituintes da matriz original, para que seja compatível e adequada às técnicas de separação e detecção utilizadas. A extração também pode ser necessária para concentração ou derivatização do analito (CHANG et al., 2007; DEVANSHU et al., 2010; HOPFGARTNER; BOURGOGNE, 2003; KING et al., 2000; QUEIROZ et al., 2001; XU et al., 2007; ZHOU et al., 2005).

As técnicas de preparo de amostra mais utilizadas para extração de fármacos do plasma sanguíneo são: extração líquido-líquido (ELL); extração por precipitação de proteínas (EPT) e extração em fase sólida (EFS). Além dessas técnicas tradicionais, outras mais modernas, como extração com fluído supercrítico, microextração em fase sólida, extração em membranas sólidas (diálise e ultrafiltração) ou líquidas, são utilizadas em menor escala na rotina dos estudos de biodisponibilidade, bioequivalência e farmacocinética. É comum a associação de mais de uma técnica de preparo de amostra em um único procedimento para aumentar a eficácia da

extração, principalmente quando se almeja a quantificação simultânea de vários analitos. Uma técnica de extração ideal deve ser simples e rápida, com poucas etapas e o máximo possível de automatização do processo, ter baixo custo, altas taxas de recuperação, boa precisão e exatidão para os analitos e fornecer extratos com o mínimo de interferentes possível. É importante citar que atualmente é desejável também que haja baixo consumo de solvente orgânico (CHANG et al., 2007; DEVANSHU et al., 2010; HOPFGARTNER; BOURGOGNE, 2003; KING et al., 2000; MITRA, 2003; QUEIROZ et al., 2001; SNYDER; KIRKLAND; GLAJCH, 1997; XU et al., 2007).

Em geral o preparo de amostra é a etapa limitante na velocidade dos métodos bioanalíticos por CLAE-EM ou CLAE-EM/EM, já que essas técnicas permitem a realização de análises muito rápidas e que a extração envolve várias etapas, muitas vezes, com baixo nível de automatização. Em comparação com a operação manual, a automatização do processo de preparo de amostra reduz em até 50% o tempo gasto. Deste modo, numerosos esforços tem sido feitos para reduzir o tempo de preparo de amostras e aumentar a reprodutibilidade dos resultados. Vários procedimentos de EPT, ELL e EFS tem sido realizados por meio de processos automatizados ou semi-automatizados. Entretanto, o custo elevado de aquisição e manutenção dos equipamentos disponíveis para automatização dificulta a implantação nos laboratórios quando se analisa a relação entre custo e benefício (DEVANSHU et al., 2010; HOPFGARTNER; BOURGOGNE, 2003; MITRA, 2003; QUEIROZ et al., 2001; SNYDER; KIRKLAND; GLAJCH, 1997; XU et al., 2007; ZHOU et al., 2005).

A ELL baseia-se nos princípios da solubilidade diferencial e do equilíbrio de partição de moléculas do analito entre duas fases imiscíveis: orgânica e aquosa. Sua eficiência depende da afinidade do soluto pelo solvente de extração, da razão entre os volumes das fases e do pH da amostra. A afinidade pela fase orgânica pode ser aumentada pela formação de par iônico com solutos ionizáveis ou de complexos lipofílicos com íons metálicos, pela adição de sais neutros, para reduzir a solubilidade de compostos orgânicos na fase aquosa, e pelo ajuste do pH, para evitar a ionização de ácidos ou bases. A ELL é uma técnica simples, com custo

relativamente baixo e permite a utilização de vários solventes, o que leva a uma alta seletividade, a uma ampla faixa de solubilidade e a obtenção de extratos bastante limpos, como consequência da escolha de um solvente adequado e da desnaturação parcial das proteínas plasmáticas. Entretanto, a ELL não é muito eficaz para substâncias altamente hidrofílicas, nem para substâncias termicamente instáveis, pois, em geral, possui uma etapa de evaporação do solvente extrator sob aquecimento. Além disso, exige o uso de volumes relativamente altos de amostras e de solventes. Os solventes orgânicos mais utilizados na ELL para extração de fármacos do plasma são éter dietílico, acetato de etila, diclorometano, metil-tec-butil éter (MTBE), hexano e tolueno, isolados ou em soluções (CHANG et al., 2007; DEVANSHU et al., 2010; HOPFGARTNER; BOURGOGNE, 2003; NIESSEN, 2006; QUEIROZ et al., 2001; XU et al., 2007).

A EPT é utilizada na quantificação de fármacos em plasma para quebra das ligações existentes entre analitos e proteínas plasmáticas por desnaturação, permitindo a extração e recuperação para posterior análise. Embora seja uma técnica muito simples, rápida e de baixo custo, em geral, a EPT fornece extratos menos sujos que a ELL e a EFS, sendo mais susceptível ao efeito matriz. Sua utilização como precursora de outras técnicas é muito comum e existem diversos tipos de agentes precipitantes, cada um com um mecanismo de precipitação específico. Os solventes orgânicos diminuem a constante dielétrica da matriz e deslocam as moléculas de água dispostas em torno das regiões hidrofóbicas na superfície protéica, facilitando as interações eletrostáticas entre as proteínas e resultando na agregação. As soluções ácidas formam sais insolúveis com os grupos amino carregados positivamente das proteínas em pH abaixo do ponto isoelétrico. Já as soluções concentradas, ou saturadas de sal, precipitam as proteínas por deslocamento das moléculas de água para solvatação do sal. Por fim, os íons metálicos deslocam os prótons dos sítios de ligação coordenada nos aminoácidos expostos, resultando na redução do pH da solução. Embora o aquecimento também cause a desnaturação das proteínas, esse procedimento não é muito utilizado para evitar a degradação dos fármacos. Os agentes precipitantes mais utilizados são metanol, acetonitrila, acetona, etanol, ácido tricloroacético e sulfato de zinco (CHANG et al., 2007;

DEVANSHU et al., 2010; HOPFGARTNER; BOURGOGNE, 2003; NIESSEN, 2006; POLSON et al., 2003; TAYLOR, 2005; XU et al., 2007).

A EFS emprega sorventes dispostos em cartuchos com formato de seringa ou em discos e os mecanismos de retenção são idênticos àqueles envolvidos na CLAE por fase normal, fase reversa ou troca iônica, permitindo a extração de compostos hidrofílicos e/ou lipofílicos, básicos, neutros ou ácidos. Os sorventes disponíveis são similares aos usados na CLAE, embora com tamanho de partícula maior, para assegurar uma permeabilidade razoável. A seletividade, a recuperação e o efeito matriz variam de acordo com os tipos e as quantidades de sorventes e solventes de lavagem e de eluição empregados na extração. Embora a EFS possa fornecer maior reprodutibilidade, extratos mais limpos, altas taxas de recuperação e maior produtividade que a ELL e a EPT, o gasto com a constante aquisição de cartuchos é o fator limitante para a aplicação dessa técnica na rotina de análises dos estudos de bioequivalência, tendo em vista o grande número de amostras (CHANG et al., 2007; DEVANSHU et al., 2010; HOPFGARTNER; BOURGOGNE, 2003; LANÇAS, 2004; NIESSEN, 2006; QUEIROZ et al., 2001; XU et al., 2007).

2.1.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de