Diagnóstico laboratorial

O diagnóstico da toxoplasmose é exclusivamente laboratorial, pois a doença manifesta- -se nas várias espécies de forma inespecífica. No contexto clínico é importante considerar sempre que T. gondii é um agente oportunista, manifestando-se principalmente em situações de imunossupressão sendo raras as situações de toxoplasmose primária.

3.1 Deteção do agente

A deteção de T. gondii pode ser realizada com recurso a várias técnicas de diagnóstico.

No exame anatomopatológico podem ser vistas lesões macroscópicas e microscópicas. O diagnóstico histológico permite associar o parasita a lesões causada pela infeção aguda e deste modo confirmar o diagnóstico de toxoplasmose. Quando degradado, o parasita pode ser confundido com células hospedeiras também elas em degeneração. O diagnóstico só deve ser feito se os taquizoítos forem visualizados com as suas características típicas já descritas. A presença de bradizoítos ou quistos tecidulares sem taquizoítos demostra apenas infeção cónica. A técnica imuno-histoquímica (IHQ) está recomendada pois facilita a visualização e identificação do parasita e permite o diagnóstico diferencial de outras coccídeas com características semelhantes como Neoespora caninum. A observação de esfregaços de material recolhido por biopsia, ou de amostras recolhidas post mortem, coradas com Giemsa, pode permitir um diagnóstico citológico rápido pela visualização direta do parasita (Dubey, 2010).

O diagnóstico biológico permite confirmar a presença do parasita mas também recuperar o parasita quando as amostras são pequenas ou estão comprometidas, como no caso de fetos macerados. Esta técnica permite manter a viabilidade do parasita para posteriores investigações como caracterização genética. Neste tipo de diagnóstico a amostra, recolhida ante mortem ou post mortem, é inoculada em murganhos ou em culturas celulares, geralmente fibroblastos. Inoculações sucessivas do parasita em murganhos comprometem as suas características biológicas originais, o mesmo não se verifica em culturas celulares. O material recolhido é importante sendo preferível cérebro ou placenta. O resultado positivo só pode ser confirmado pela visualização de taquizoítos recuperados posteriormente da cavidade peritoneal, ou bradizoítos recuperados de músculo cardíaco ou cérebro dos murganhos inoculados. É importante salientar que um resultado negativo não

19 exclui uma infeção pelo parasita, uma vez que este pode já não se encontrar viável no momento da recolha (Dubey, 2010).

As técnicas moleculares para a deteção de ADN de T. gondii incluem a reação em cadeia da polimerase (“polymerase chain reaction” - PCR). Esta é bastante sensível sendo capaz de detetar apenas um taquizoíto. A análise de fezes de felinos por PCR pode levar a resultados falsos positivos, devido a reações cruzadas com Hammondia hammondi, ou falsos negativos devido à dificuldade em aceder ao ADN no interior do oocisto (Dubey, 2010). O uso da PCR confirma a presença do parasita, mas não o implica na causa do aborto ou doença e resultados PCR negativos não excluem o parasita. Pode ser feito diagnóstico presuntivo em situações onde amostras são PCR positivas e existe lesões compatíveis com infeção por T. gondii embora não sejam visualizados parasitas na análise histológica. A PCR também permite o diagnóstico diferencial entre outros parasitas semelhantes como Neospora caninum (Dubey, 2010; Moreno et al., 2012).

3.2 Deteção de anticorpos

O diagnóstico serológico deteta a presença de anticorpos para T. gondii (IgM ou IgG) produzidos pelo hospedeiro. Uma amostra positiva prova apenas que o hospedeiro entrou em contacto com o parasita. A seropositividade para IgM sem a deteção de IgG permite o diagnóstico precoce da infeção por T. gondii na fase aguda. Embora raro, a deteção isolada de IgM pode não indicar a existência de uma infeção aguda visto que as IgM podem permanecer no organismo durante mais do que 12 meses em humanos, e durante vários meses em animais (Dubey, 2010).

A infeção aguda pode também ser diagnosticada serologicamente através da recolha de duas amostras com intervalo de 2 a 4 semanas. Um aumento nos títulos de IgG 16 vezes superior na segunda amostra é fortemente sugestivo de infeção aguda. No contexto veterinário esta situação raramente acontece pois quando o animal manifesta sinais clínicos as IgG já atingiram o pico ou estão perto de o fazer (Dubey, 2010).

Na toxoplasmose congénita em animais, principalmente ovinos, o diagnóstico serológico, com deteção de IgM, pode ser realizado, não na mãe, mas nos nados mortos ou recém-nascidos, antes da toma do colostro, uma vez que estes anticorpos maternos não atravessam a placenta. No entanto, a ausência de anticorpos não excluiu o diagnóstico, principalmente se os fetos tiverem lesões compatíveis com toxoplasmose, do mesmo modo que a presença de anticorpos sem lesões, não implica o parasita na causa de aborto. A presença de anticorpos fetais depende de fatores como o tempo de gestação no momento da infeção e do tempo decorrido entre a infeção e a análise.

20 Um dos principais objetivos dos estudos serológicos é determinar valores de seroprevalência permitindo assim estudos epidemiológicos entre regiões e países. Um dos critérios de escolha para o teste deve ser a acessibilidade deste para diferentes investigadores e a facilidade e rapidez de utilização, reduzindo as variáveis inerentes ao manipulador. Utilizar metodologias de diagnóstico que não possam ser recriadas em diferentes pontos do país e em diferentes países não tem fundamento científico, pois resultados de testes serológicos diferentes não podem ser comparados de forma objetiva. Vários testes serológicos encontram-se disponíveis. Os testes disponíveis no mercado são baseados na reação entre os anticorpos presentes em soros positivos e os antigénios presentes no teste. Os diferentes testes apresentam várias vantagens e desvantagens.

O teste de lise de Sabin e Feldman (“Dye Test”- DT) é o teste de referência para o diagnóstico da infeção em humanos. No entanto, possui baixa sensibilidade e especificidade para ruminantes e não funciona em aves. O ensaio imunoenzimático ("enzyme-linked immunosorbent assay” - ELISA) conta com uma reação enzimática em resposta à ligação Ag e Ac que produz uma mudança de cor, permitindo avaliar a quantidade de reações ocorridas no soro pela intensidade da cor. O teste de hemaglutinação indireta (“indirect hemogalutination test” - IHT) não está bem padronizado, tem baixa sensibilidade e especificidade e não deve ser utilizado na deteção de anticorpos fetais. O teste de imunofluorescência indireta (“indirec fluorescence antibody test” - IFAT) utiliza geralmente taquizoítos como antigénio e requer um microscópio de fluorescência, pelo que não é um teste acessível para qualquer estudo. O teste de aglutinação em latex (“latex aglutination test” - LAT) apresenta baixa sensibilidade e não deve ser utilizado na deteção de anticorpos fetais (Dubey, 2010). No Western blot o soro é incubado com antigénios de T. gondii e os anticorpos são separados por eletroforese, formando bandas que correspondem a diferentes pesos moleculares. Este teste exige material específico e não é utilizado normalmente como método de diagnóstico mas sim para comparar resultados entre diferentes técnicas (Ghazy et al., 2007) ou simplesmente confirmar resultados de uma técnica específica (Gupta et al., 2002; Jakubek et al., 2006).

O teste de aglutinação modificado (“modiffied agglutination test” - MAT) é uma modificação do teste de aglutinação direta criado por Fulton e Turk, (1959). Adaptações de Desmonts e Remington, (1980) conferiram ao teste maior sensibilidade e especificidade e quando Dubey e Desmonts, (1987) alteram a ordem de reagentes, tornou-se mais seguro e cómodo de usar, passando a designar-se pelo nome que é hoje conhecido. O teste deteta apenas IgG pelo que em fases precoces da infeção pode apresentar falsos negativos. É utilizado mundialmente em várias espécies (Dubey, 2010), permite o diagnóstico em aves (Dubey et al., 2006b) e está validado em suínos naturalmente infetados, não sofrendo

21 reação cruzada com Sarcocystis miescheriana, Ascaris suum, Trichuris suis e Trichinella

spiralis(Dubey, 1997). A sua utilização para diagnóstico em cavalos e burros está descrita e,

segundo Dubey et al. (2014a), o MAT pode ser utilizado em asininos pelas semelhanças que esta espécie partilha com os equinos e os muares onde este teste serológico se encontra validado por ensaios experimentais e isolamento do parasita em murganhos (Dubey e Desmonts, 1987; Dubey et al., 2014a). O teste é rápido e fácil de utilizar, tendo elevada sensibilidade e especificidade, os resultados positivos são assinalados pela presença de aglutinação em poços em forma de U. O diagnóstico serológico é feito utilizando soro ou suco muscular o que é de interesse para o diagnóstico post mortem (Desmonts e Remington, 1980; Dubey, 2010; Coelho et al., 2015).