Discussão

Os estudos sobre a prevalência de infeção por Toxoplasma gondii nas diferentes espécies hospedeiras são importantes de modo a compreender melhor os aspetos epidemiológicos deste parasita. Estudos sobre este protozoário em asininos são escassos e pouco se sabe sobre a infeção por este parasita nesta espécie. Segundo a bibliografia pesquisada este é o primeiro estudo sobre a infeção por T. gondii em asininos de Portugal.

O presente trabalho revelou a presença de anticorpos para T. gondii em 6,9% dos asininos de Portugal. Este resultado é similar aos 6,4% de seroprevalência encontrados nos Estados Unidos por Dubey et al. (2014a) e aos 10,9% obtidos por Alvarado-Esquivel et al. (2015) no México, também utilizando o MAT e um cut-off de 25. Resultados mais elevados foram observados na Andaluzia (Espanha) por García-Bocanegra et al. (2012), onde foi verificado que 25,6% dos asininos estudados foram seropositivos, utilizando o mesmo teste e o mesmo cut-off que os estudos anteriores. No estudo espanhol a amostra era mais pequena com 82 animais numa área de 87,268 Km2 do que no nosso estudo que incluiu 203 animais numa área de 92,212 Km2. A diferença neste resultado pode estar relacionada com maior contaminação ambiental no sul de Espanha que foi visível noutras espécies nomeadamente: gatos, cães (Millán et al., 2009), suínos (Hernández et al., 2014), ovinos, caprinos e bovinos (García-Bocanegra et al., 2013). Um valor de seroprevalência muito elevada foi também identificada no sul de Espanha, em linces (80,7%) (Millán et al., 2009).

Estudos realizados em asininos Amiatina de aptidão leiteira, provenientes de Itália, reportaram 22,2% (Martini et al., 2014) e 25% (Mancianti et al., 2014) de seroprevalência utilizando IFAT. O estudo realizado por Machacova et al. (2014) incluiu diferentes raças, idades e géneros e obteve 8% de prevalência também utilizando IFAT.

A baixa seroprevalência obtida neste estudo e obtida noutros países pode estar relacionada com a maior resistência dos asininos a T. gondii como sugerido por vários autores (Mendonça et al., 2001; Dubey et al., 2014a; Machacova et al., 2014; Alvarado- Esquivel et al., 2015). Os hábitos alimentares dos asininos podem predispo-los a menor contacto com parasita pois dão preferência a plantas do tipo arbustivo com baixo valor nutritivo a elevada quantidade em fibra, podendo também ocorrer ingestão de casca de árvore mesmo quando o pasto disponível é de elevado valor nutritivo (Lamoot et al., 2005; Wood et al., 2012; Couto, 2014). Este tipo de plantas é menos suscetível à contaminação por fezes de felinos por se encontrarem afastadas do solo. No entanto, os burros têm também o comportamento de desenterrar raízes em períodos de escassez (Süss e Schwabe, 2007), comportamentos descritos nos lameiros do planalto mirandês por Couto (2014). Do distrito de bragança muitos burros tinham também como fontes de água para

90 bebida tanques comunitários ou cursos de água no inverno, pelo que as oportunidades de infeção não são reduzidas.

A distribuição pouco homogénea das amostras pelos diferentes locais de proveniência geográfica não permitiu uma análise estatística viável mas os resultados obtidos poderão servir para comparações futuras. Porque não existem dados concretos sobre a distribuição dos burros em Portugal, é impossível confirmar o tipo de representatividade que esta amostra possa ter. Os únicos dados oficiais que existem são relativos ao censo agrícola de 2009 do INE onde asininos e muares foram contados em conjunto (INE, 2011). Tal como o INE, que identificou uma grande proporção deste efetivo em Trás-os-Montes, também o presente estudo encontrou a maior parte dos asininos em Bragança.

Agrupando os resultados de acordo a classificação climática de Köppen–Geiger observa-se uma distribuição mais homogénea das amostras com 59% das mesmas em zonas classificadas como Csa e 41% em zonas classificadas como Csb. A prevalência entre estes dois grupos foi semelhante, com 6% em Csa e 7,8% em Csb. No conjunto, este sistema classifica Portugal com um clima temperado, húmido com verão temperado (Csa) ou verão quente (Csb). De acordo com estes resultados, estas diferenças não são suficientes para afetar o ciclo biológico do parasita não tendo o clima influência na distribuição do parasita no território nacional. Apesar de, no presente estudo, não existirem diferenças significativas, este sistema de classificação, para comparação entre países, pode mostrar-se vantajoso, uma vez que está aplicado à escala mundial e é fácil de usar. O sistema poderá também ser útil se aplicado em países com elevada variabilidade climática como o Brasil, o México ou os EUA. Por exemplo, Mendonça et al. (2001) observaram uma menor seroprevalência de infeção por T. gondii em asininos no estado de Bahia (1,5%) quando comparado com outras regiões do nordeste brasileiro (43,2% e 26,9%) (de Oliveira et al., 2013; Gennari et al., 2015). Mendonça et al. (2001) colocaram a possibilidade de o clima da região ser menos favorável à progressão do ciclo biológico do parasita. Apesar de os autores não terem apresentado a classificação climática de Köppen–Geiger como argumento, o estado da Bahia encontra-se sob a classificação de BSh, um clima árido pouco florestado e quente, em contraste com o resto do nordeste brasileiro sob a classificação de Aw, um clima tropical com estação seca e estação chuvosa.

No presente estudo o número de fêmeas foi superior ao número de machos em todos os grupos etários. Esta situação poderá dever-se ao maior valor económico das fêmeas principalmente em animais de raça sob o abrigo de subsídios, como é o caso da raça Asinina de Miranda que compõe mas de 50% da amostra. Tal como outros estudos não foi

91 encontrada diferença estatisticamente significativa entre géneros, mas foi detetada uma seroprevalência ligeiramente superior nas fêmeas (7,6%) em relação aos machos (5,6%). Resultados semelhantes foram encontrados nos Estados Unidos por Dubey et al. (2014b), no México por Alvarado-Esquivel et al. (2015), no Egipto por Haridy et al. (2010), na Turquia por Zeybek et al. (1998) e por Balkaya et al. (2011) e em Itália por Machacova et al. (2014).

Esta diferença entre machos e fêmeas, encontrada ao longo de vários estudos, pode estar associada ao tipo de maneio. As fêmeas, principalmente reprodutoras, poderão passar mais tempo em pastagens, aumentando assim a probabilidade de contactarem com as formas infetantes de T. gondii, os machos inteiros são mantidos fechados por serem demasiado territoriais para partilharem espaço com outros. No entanto, a grande maioria dos machos do presente trabalho eram animais castrados muitos dos quais partilhavam o espaço com fêmeas, o que pode justificar esta diferença não significativa.

Outra explicação possível reside nas diferenças fisiológicas. Estas poderão ser uma das causas deste desnível consistente entre géneros. Martini et al. (2014) sugerem que havendo uma quebra de imunidade no peri-parto as burras estarão mais susceptíveis a parasitemia e Mancianti et al. (2014) sugere que a libertação do parasita no leite esteja dependente de fatores como a distância ao parto ou o momento de infeção. Esta quebra imunitária de fêmeas associada a fenómenos reprodutivos pode ser uma forma de justificar a presença consistente de mais anticorpos nas fêmeas do que nos machos.

Neste estudo observou-se que 21,4% (3/14) das fêmeas gestantes eram seropositivas, embora as diferenças encontradas não tenham sido significativas. A amostragem em animais gestantes é difícil devido à relutância dos proprietários em darem o seu consentimento, pelo que a amostra foi pequena, não sendo possível atingir resultados estatisticamente significativos. No entanto, estes resultados, assim como os resultados obtidos em Itália por Martini et al. (2014) e Mancianti et al. (2014), refletem uma tendência que é importante explorar relativamente ao efeito que o estado reprodutivo tem na vulnerabilidade para Toxoplasma gondii.

No presente estudo não foram encontrados animais seropositivos com idade inferior a 24 meses. Este resultado está de acordo com os resultados obtidos por Dubey et al., (2014a) nos EUA, Machacova et al. (2014) em Itália e Alvarado-Esquivel et al. (2015) no México, sugerindo que a transmissão congénita de T. gondii não é frequente em burros.

Apesar de os animais jovens serem todos seronegativos, não se observou uma relação positiva entre a idade e os resultados obtidos pelo MAT. Resultados semelhantes foram encontrados em asininos por Dubey et al. (2014a) nos EUA e por Alvarado-Esquivel et al.

92 (2015) no México. Em Espanha García-Bocanegra et al. (2012) encontraram resultados semelhantes em equídeos (cavalos, mulas e asininos) e em Portugal Lopes et al. (2013b) obtiveram resultados semelhantes em cavalos. Até ao momento não existem provas que o sistema imunitário dos asininos seja capaz de eliminar o parasita como no caso dos bovinos. Assim, embora os animais permaneçam infetados durante toda a vida, é possível que os títulos de anticorpos diminuam ao longo do tempo tornando os asininos mais velhos seronegativos (Dubey, 2010). Assim sendo, a seroprevalência nestes animais em Portugal, um país com uma população de asininos envelhecida, poderá ser superior à obtida.

Neste trabalho, 57% da amostra era constituída por animais com raça definida, na sua maioria da raça Asinina de Miranda (56%). Este facto não significa que existam mais animais de raça em Portugal. Este valor parece ser influenciado pelas recolhas realizadas no solar da raça. Contudo, embora em menor número, animais de raça foram encontrados fora do solar, principalmente em centros de turismo rural, ecoturismo ou turismo de natureza devido ao apoio dado aos proprietários, com subsídios de motivação à reprodução, mas também devido às características da raça. Os resultados obtidos não demonstraram uma diferença significativa entre os animais de raça definida (7,8%) e os animais sem raça definida (5,7%). Resultados semelhantes foram encontrados em cavalos por Alvarado- -Esquivel et al. (2012b) e em asininos, em Itália por Machacova et al. (2014) e nos EUA por Dubey et al. (2014a). Por outro lado, na Turquia, Boughattas et al. (2011) identificaram animais Puro-Sangue Árabe como os mais susceptíveis. No Brasil, Valença et al. (2015) verificou que animais da raça Mangalarga apresentaram um maior risco de aquisição da infeção quando comparado com cruzados de raças e Quarto-de-milha.

Neste estudo, 53% dos asininos não eram utilizados em atividades sendo mantidos pelos proprietários por lazer como animais de estimação. Dos animais que participavam em atividades de trabalho a maior parte era utilizada em passeios (23,2%) seguido de trabalho agrícola (9,9%), produção de leite (8,4%) e por fim asinoterapia (5,9%). Estes resultados mostram que o burro tem interesse não só como animal de estimação mas também como animal de produção com potencial utilização em diferentes áreas.

Apenas uma exploração leiteira foi analisada, nesta o leite destina-se à produção de produtos de cosmética. Devido à localização afastada das explorações e à relutância em participar no estudo por parte dos produtores não foi possível recolher mais amostras de animais envolvidos neste tipo de atividades. A seroprevalência mais elevada nos asininos de produção de leite onde a amostra foi constituída maioritariamente por fêmeas em idade fértil.

93 No entanto, os resultados obtidos pelo MAT nas diferentes atividades não permitem tirar conclusões pois a amostra não se encontra distribuída de forma homogénea.

Comparando os resultados obtidos de acordo com a utilização em atividades verificou- -se que a seroprevalência foi superior nos animais utilizados em atividades de trabalho (9,4%) quando comparados com os não utilizados, ou mantidos para lazer (4,7%), contudo esta diferença não foi estatisticamente significativa. Apenas uma publicação foi encontrada relacionando positivamente a seroprevalência com o trabalho executado por equídeos (cavalos, póneis e mulas). Na Grécia, Kouam et al. (2010) identificaram o trabalho agrícola como um fator de risco, no entanto o estudo não incluiu asininos.

Relativamente ao tipo de alojamento observou-se que grande parte dos asininos em Portugal têm acesso ao exterior (98%) sendo que a maioria está alojada exclusivamente no exterior podendo ter coberturas para proteção da chuva ou do sol. Os animais com permanência no interior foram maioritariamente machos inteiros que, devido ao comportamento territorial e agressivo, são mantidos em curriças ou boxes. Os animais mantidos em interior, convíviam com outras espécies como burros, roedores e gatos. No presente estudo, não foi encontrada uma diferença significativa entre o tipo de alojamento e a seroprevalencia para T. gondii. Resultados semelhantes foram obtidos por Filho et al. (2012) em muares, asininos e equinos do Brasil e por Lopes et al. (2013b) em equinos do norte de Portugal. Face a estes resultados é impossível concluir que o alojamento no exterior ou a maior permanência em pasto seja fatores de risco, como afirmado por El- Ghaysh (1998) e García-Bocanegra et al. (2012). O alojamento exclusivamente no interior também não foi identificado como um fator de proteção. Apesar de em algumas espécies, como suínos e galinhas, o alojamento no interior ser um fator de proteção (Alvarado- Esquivel et al., 2012a; Guo et al., 2016) esta situação só se verifica quando o alojamento inclui condições de higiene e bem-estar animal. Nos asininos o alojamento exclusivamente no interior facilmente pode apresentar problemas graves de bem-estar e falta de higiene.

No contacto com gatos alguns proprietários tinham gatos e sabiam que estes dormiam e conviviam com os burros principalmente nos animais com alojamento no interior ou misto. Outros proprietários diziam que viam gatos no pasto ou nos locais de armazenamento do alimento que não lhes pertenciam. Na análise dos resultados relativos ao contacto com outros animais o contacto com gatos não foi associado à infeção por este protozoário. Resultados semelhantes foram encontrados em asininos de Itália por Machacova et al. (2014) e em equídeos do Brasil por Filho et al. (2012), também no Brasil mas penas em cavalos Valença et al. (2015) encontrou os mesmos resultados.

94 Os cães pertenciam aos proprietários e permaneciam no pasto ou no alojamento dos animais, alguns eram considerados um meio de proteção de propriedade, outros apenas animais de companhia. O convívio com estes animais foi identificado como fator de proteção, uma vez que burros que não conviviam com cães apresentaram uma seproprevalência significativamente mais elevada (17,2%) do que burros que conviviam com cães (5,2%). Estes resultados podem dever-se ao facto de cães diminuírem a permanência de gatos nas explorações, podendo também limitar o comportamento dos gatos no seu acesso ao pasto, ao feno ou à água de bebida dos burros. No entanto, devido aos hábitos de coprofagia, os cães podem contaminar o pasto com oocistos presentes nas suas fezes após a ingestão de oocistos presentes em fezes de felinos (Lindsay et al., 1997; Schares et al., 2005). Assim, e apesar dos resultados obtidos no presente estudo, a existência de cães em explorações de asininos deve ser evitada uma vez que os cães podem funcionar como um meio mecânico de disseminação de T. gondii mas também como hospedeiro definitivo de outros parasitas como Neospora caninum (Bártová et al., 2010; Moreno et al., 2012).

Neste estudo apenas 12% dos asininos conviviam com cavalos, 9% com muares e 96% dos burros em estudo conviviam com outros burros. Mesmo proprietários que mantinham os burros por lazer tinham muitas vezes mais do que um animal. De acordo com os resultados obtidos o contacto com cavalos, muares ou outros asininos não foi associado à infeção por T. gondii em asininos. No entanto, outros estudos relacionaram a seroprevalência em equinos com o número de animais por propriedade. No Brasil, Filho et al. (2012) e no México, Alvarado-Esquivel et al. (2012b) encontraram maior seroprevalência em equídeos mantidos em manadas com mais de 30 cabeças associando deste modo a densidade populacional com a infeção.

A seroprevalência foi superior nos animais que contactavam com os ruminantes domésticos mas os resultados não foram estatisticamente significativos. Resultados similares foram encontrados em Itália por Machacova et al. (2014) com maior seroprevalência em burros que conviviam com ruminantes domésticos mas sem relevância estatística. Em Espanha, García-Bocanegra et al. (2012) identificaram a presença de ruminantes como um fator de risco para a aquisição da infeção em equídeos. Não há conhecimento de mais publicações relacionado a seroprevalência dos asininos com o convívio com ruminantes domésticos e este estudo foi o único que identificou as diferentes espécies de ruminantes. Apesar de García-Bocanegra et al. (2012) ter obtido resultados positivos, não justificou ou comentou os resultados. A base biológica para a risco que os

95 ruminantes domésticos representam para os asininos ou outros equídeos não é clara. Os resultados obtidos por García-Bocanegra et al. (2012) podem estar relacionados com a densidade populacional no pasto pois a seroprevalência em cavalos parece ser influenciada positivamente pelo tamanho da manada (Alvarado-Esquivel et al., 2012b; Filho et al., 2012). Em pequenos ruminantes a fraca gestão e a presença de várias espécies numa exploração foram identificados como fatores de risco (Santos et al., 2012; Bawm et al., 2016; Klun et al., 2006) e em Itália Gazzonis et al. (2015) identificaram que cabras alojadas com ovelhas tinham 1,3% mais probabilidade de estarem infetadas com T. gondii. Mas nenhum estudo apresentou justificação.

Com base nos resultados obtidos foi encontrada uma maior seroprevalência em asininos de Portugal que conviviam com aves de capoeira (14,3%) em relação aos que não conviviam com estas aves (6,3%). Estes resultados são corroborados por Filho et al. (2012) no Brasil tendo sido a única publicação encontrada a relacionar a infeção por T. gondii em equideos com a presença de aves domésticas.

A prevalência de anticorpos para T. gondii não variou significativamente entre os asininos que contactavam e não contactavam com fauna silvática mostrando que ambos os grupos de animais estão igualmente expostos e sujeitos à infeção por T. gondii. Resultados semelhantes foram encontrados no Brasil por Filho et al. (2012) em equídeos (cavalos, mulas e burros).

O convívio com roedores não foi associado à infeção por T. gondii em asininos de Portugal, embora se tenha observado uma prevalência mais elevada no grupo dos animais que não convivia com roedores 11,5% (9/78). Estes resultados podem não representar a realidade e a percentagem de asininos a conviver com roedores poderá ser maior do que a obtida através do inquérito. Não foram encontrados artigos que relacionassem a seroprevalência em equinos com a presença de roedores. Em princípio os roedores não apresentam uma forma de infeção para herbívoros como os equídeos, mas a presença de roedores pode ser um critério para avaliar a higiene das explorações (Kijlstra et al., 2008).

Apenas 6% dos animais em estudo estavam doentes. A prevalência de anticorpos para T. gondii foi superior nos animais doentes, no entanto, apenas um animal seropositivo (8,3%), com título de 20, estava doente e esta distribuição não nos permite tirar conclusões. Alvarado-Esquivel et al. (2015) indicaram que não havia relação entre a seroprevalência e o estado de saúde, não sendo este último um fator de risco para a infeção por T. gondii.

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