Ensaios Hemolíticos

As nanopartículas obtidas no trabalho foram submetidas aos ensaios hemolíticos constituídos de três vertentes de estudo: a) avaliação da lise de hemácias em função da concentração; b) área superficial normalizada; c) e estado de agregação dos veículos moleculares.

Para a realização dos ensaios hemolíticos utilizou-se sangue do Tipo B concedido pelo Hemocentro da Universidade Estadual de Campinas ao Laboratório de Química do Estado Sólido do Instituto de Química. Concomitantemente duas soluções de PBS foram preparadas de acordo com o procedimento descrito a seguir:

a) PBS (2x): dois tabletes de tampão fosfato salino foram diluídos em 200 mL de água deionizada (2 mM de fosfato, 0,54 mM de KCl e 27,4 mM de NaCl);

b) PBS (1x): 100 mL da solução acima foram diluídos em 100 mL de água deionizada (1 mM de fosfato, 0,27 mM de KCl e 13,7 mM de NaCl).

O volume de 10 mL de sangue foi submetido à centrifugação a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos. Descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 20 mL de PBS (2x) ao pellet que, foi resuspendido subsequentemente. Após a esse processo, realizou-se duas novas lavagens seguindo-se o procedimento vigente, obtendo-se 20 mL de uma solução de hemácias em PBS (2x). Desse total, 2,5 mL foram diluídos em 12,5 mL de PBS (2x) obtendo-se a solução estoque de hemácias.

O pré-tratamento das nanopartículas (inicialmente em etanol) para os ensaios hemolíticos compreendem um procedimento no qual todas são centrifugadas a 15.000 rpm a 4°C durante 30 min e dispersas em água deionizada. Esse processo é repetido mais duas vezes obtendo-se dispersões coloidais finais em água deionizada nas concentrações de 1 mg/mL.

3.6.1. A influência da concentração das nanopartículas na

hemólise

Os efeitos hemolíticos62 foram avaliados segundo a influência da concentração das nanopartículas. Nesse processo, foram preparadas soluções de

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veículos moleculares nas seguintes concentrações: 5 µg/ mL, 12,5 µg/ mL, 25 µg/ mL, 50 µg/ mL, 75 µg/ mL, 100 µg/ mL, 150 µg/ mL e 250 µg/ mL. Cada coloide é adicionado a uma mistura de PBS (2x) (cujo volume é sempre igual ao volume de nanopartículas adicionado) e PBS (1x). Em seguida é adicionado 100 µL de uma solução estoque de hemácias, iniciando-se o processo de incubação por uma hora – note que para cada eppendorf tem-se um volume total de 1000 µL, o volume de solução de nanopartícula varia de acordo com a concentração final desejada e a quantidade de PBS (x1) complementa o volume final citado.

Após o período de incubação as soluções biológicas contendo as nanopartículas são centrifugadas a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos e 100 µL do sobrenadante é submetido à análise de espectroscopia eletrônica de absorção UV-Vis no comprimento de onda de 540 nm. Os valores de absorbância são referência para os cálculos percentuais da taxa de hemólise.

Tratando-se do aspecto estatístico na interpretação confiável e precisa dos resultados todos os experimentos foram realizados em triplicata.

3.6.2. A influência da área superficial das nanopartículas na

hemólise

A realização dos ensaios abrangendo a influencia da área superficial das nanopartículas no efeito hemolítico demanda critérios pré-estabelecidos62. Inicialmente tem-se um procedimento de normalização de área de modo que todos os veículos moleculares interagindo com os sistemas biológicos detenham a mesma área superficial total. Nesse contexto, o coloide detendo o menor valor foi escolhido como padrão. Por definição, 25 µL de uma determinada nanopartícula abrange sua área superficial calculada segundo o método BET. O carreador detém “x” m2

/g abrangido em 25 µL dessa solução e mantido como parâmetro de área total para interação com as hemácias. Sabendo-se que as demais nanopartículas possuem área de superfície maior do que “x” m2

/g o volume a ser adicionado para cada uma delas é menor do que 25 µL de modo a atingir o referido valor de área. Nessa situação, água deionizada é complementada para encerrar o volume de 25 µL de solução de coloides. Realizados os respectivos

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ajustes, todas as nanopartículas são adicionadas separadamente em tubos de epperndorf contendo 25 µL de PBS (2x) e 850 µL de PBS (1x). Para cada sistema é, portanto, transferido 100 µL de solução estoque de hemácias seguido de uma hora de incubação.

Após o período de interação entre nanopartículas e hemácias os sistemas são centrifugados a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos e 100 µL do sobrenadante é submetido à análise de espectroscopia eletrônica de absorção UV-Vis no comprimento de onda de 540 nm. Os valores de absorbância são referência para os cálculos percentuais da taxa de hemólise.

Tratando-se do aspecto estatístico na interpretação confiável e precisa dos resultados todos os experimentos foram realizados em triplicata.

3.6.3. A influência do estado de agregação das nanopartículas em

função do tempo na hemólise

A realização dos ensaios hemolíticos62 nessa etapa do trabalho demanda uma prévia avaliação do comportamento de agregação de cada nanopartícula em PBS durante uma hora. Dessa maneira, 25 µL de cada veículo molecular foi adicionado, respectivamente, a uma mistura de 25 µL de PBS (2x) e 950 µL de PBS (1x). Mediante a técnica de espalhamento de luz dinâmico foi avaliada intermitentemente a variação de tamanho de partícula e índice de polidispersividade no período de uma hora, similarmente ao tempo padrão de incubação com hemácias. O comportamento coloidal foi avaliado nos tempos de 0, 5, 15, 30, 45 e 60 minutos.

Avaliados os aspectos físico-químicos acima, 25 µL de cada nanopartícula foi adicionado em eppendorf contendo uma mistura de 25 µL de PBS (2x) e 850 µL de PBS (1x). Os veículos moleculares foram mantidos nos respectivos frascos durante uma hora. Após essa etapa foi adicionado 100 µL de solução estoque de hemácias mantendo-se uma hora de incubação.

O experimento acima foi novamente realizado mantendo-se todas as condições experimentais com exceção ao tempo de interação entre as

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nanopartículas e a mistura de PBS (anteriormente à adição da solução estoque de hemácias), que nesse caso foi de um minuto.

Após o período de interação entre os veículos moleculares e as hemácias os sistemas são centrifugados a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos e 100 µL do sobrenadante é submetido à análise de espectroscopia eletrônica de absorção UV-Vis no comprimento de onda de 540 nm. Os valores de absorbância são referência para os cálculos percentuais da taxa hemolítica.

Tratando-se do aspecto estatístico na interpretação confiável e precisa dos resultados todos os experimentos foram realizados em triplicata.