4. Resultados e Discussão
4.4. Estudos de Estabilidade Coloidal
O conjunto de caracterizações estruturais confirmou a obtenção de todas as nanopartículas bem como as funcionalizações nas superfícies internas (fenila) e externas (PEG). Nesse contexto, foi possível comprovar, também, a síntese de veículos moleculares detendo uma complexidade porosa na qual a significativa variedade de tamanhos foi obtida, refletindo a textura irregular desejada durante o planejamento estratégico do trabalho. Os materiais mostraram amplas áreas superficiais, importante no estudo de interação de nanoestruturas com biossistemas.
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Embora elucidadas, as nanopartículas necessitam ser submetidas ao estudo de estabilidade coloidal no intuito de avaliar a influência do PEG na aquisição dessa nova propriedade físico-química interessante do ponto de vista biológico. O gráfico apresentado na Figura 43 mostra o aspecto da estabilidade coloidal (em PBS na concentração de 250 µg/mL) de cada nanopartícula sintetizada na presente dissertação. Na ausência de rotação tomou-se como parâmetro a presença de 100% de cada nanopartícula no sobrenadante.
De acordo com o gráfico, observa-se a instabilidade da NPH30-SiOH em toda a faixa de rotações da centrífuga, uma vez que a porcentagem dessa nanopartícula no sobrenadante em todo o intervalo estudado foi próxima a 0. Á medida que o teor de funcionalização com PEG de cadeira curta varia de 10% mol-Si para 50% mol-Si observa-se aumento da estabilidade coloidal na rotação de 94 rcf, isto é, a NPH30-SiO-50PEG10 detém maior porcentagem de
nanopartículas suspensas em relação às demais, confirmando a relação direta entre a taxa de funcionalização do silano PEG10 e a característica estável do
coloide. Nessa situação a NPH30-SiO-10GPS-PEG40 torna-se mais estável
comparada com a NPH30-SiO-10PEG10 e mais instável em relação às demais. Tal
resultado indica que no teor de 10% de funcionalização a nanopartícula detendo PEG de cadeia mais longa apresenta maior estabilidade coloidal. A partir da rotação de 2348 rcf todos os veículos moleculares exibiram comportamentos instáveis conforme esperado, uma vez que a força centrífuga atuante nessa situação é suficiente para gerar a coalescência.
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Figura 43: Gráfico de estabilidade coloidal das nanopartículas a 250 µg/mL em PBS
4.5. A influência da concentração das nanopartículas na hemólise
A Figura 44 apresenta a curva dose-resposta referente ao estudo da influencia da concentração das nanopartículas na hemólise. Em termos gerais o aumento de concentração eleva a lise das células vermelhas em virtude do aumento de interações entre ambos os sistemas. No entanto, um efeito interessante é claramente observado: tratando-se dos veículos moleculares contendo polietilenoglicol de cadeia pequena, o aumento da taxa de funcionalização de 0 para 50 acarreta na minimização da hemólise em determinadas faixas de concentração. Seguindo-se a abordagem toxicológica, esse comportamento é observado avaliando-se a dose efetiva ou ED50
(quantidade de nanopartícula necessária para engendrar 50% de hemólise). A análise do gráfico indica que a NPH30-SiOH, NPH30-SiO-10PEG10 e NPH30-SiO-
25PEG10 possuem ED50 iguais a 37, 37 e 35 µg/mL, respectivamente, isto é, até a
taxa de funcionalização de 25% não houve discrepâncias significativas na toxicidade da nanopartícula, demandando maiores teores de enxerto de silano PEG10 na superfície externa. Os resultados da NPH30-SiO-50PEG10 mostram
ED50 = 74 µg/mL, indicando diminuição da toxicidade.
A NPH30-SiO-10GPS-PEG40, detém ED50 = 47 µg/mL, valor maior
comparado com a nanopartícula de partida. Tal resultado reflete a diminuição da toxicidade do veículo molecular após o procedimento de funcionalização em virtude da presença do polietilenoglicol de cadeia grande na superfície externa. Nesse contexto foi possível observar a influência do tamanho da cadeia nos efeitos hemolíticos, isto é, para duas nanopartículas abrangendo taxas de funcionalização idênticas tal como a NPH30-SiO-10PEG10 e a NPH30-SiO-
10GPS-PEG40, está última mostrou-se menos tóxica. Portanto, grandes cadeias
poliméricas de PEG tendem a ser mais eficientes na supressão da hemólise possivelmente devido à sua capacidade em blindar de maneira mais efetiva os grupos silanóis. Segundo a literatura o contato direto dos grupos SiOH externos na superfície da nanopartícula negativamente carregados com a superfície da
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membrana da hemácia, também carregada negativamente, interfere na lise da célula vermelha. Dessa maneira a funcionalização covalente com silano PEG proporciona a diminuição das cargas eletrostáticas superficiais, conforme demonstrado pela análise de potencial zeta. A cadeia polimérica é capaz de proteger os grupos silanóis remanescentes desse processo, evitando o contato superficial direto nanopartícula-hemácia e, portanto, suprimindo a hemólise. Com relação ao os aspectos espaciais, o polímero maior possui maior capacidade de blindagem dos grupos SiOH em relação ao PEG menor, o que explica os resultados de dose efetiva obtidos. Tratando-se da comparação entre as nanopartículas funcionalizadas com polietilenoglicol de cadeia curta, a maior taxa de funcionalização gera maior revestimento da superfície externa de modo a neutralizar gradativamente as cargas negativas pré-existentes anteriormente à pós-modificação. Tal premissa explica o fenômeno de diminuição de toxicidade mostrado para esse grupo de carreadores – ainda que detendo cadeia pequena, tal resultado possivelmente é reflexo da ação mútua de blindagem da cadeia polimérica em relação aos grupos silanóis.
Figura 44: Curvas dose-resposta das nanopartículas em incubadas em células vermelhas do sangue
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4.6. A influência da área superficial das nanopartículas na
hemólise
Dentre as nanopartículas obtidas nesta dissertação a NPH30-SiO-10GPS- PEG40 teve a menor área superficial calculada segundo o método BET, dada por
760 m2/g. O referido valor foi mantido como referência para todos os veículos moleculares conforme explicado na metodologia experimental. Nesse contexto o volume total de cada nanopartícula interagindo com as células vermelhas do sangue foi calculado de maneira que a área total normalizada seja igual a 760 m2/g.
Os resultados de hemólise apresentados na Figura 45 mostram efeitos interessantes do ponto de vista de interação superficial entre nanopartículas e sistemas biológicos. Considerando todos os veículos moleculares apresentando a mesma área superficial total disposta às hemácias, a presença do polietilenoglicol de maneira geral acarreta aumento da hemólise. A compreensão de tal fenômeno pode ser baseada em conceitos de interação bem conhecidos na literatura. Através de interações eletrostáticas e, as nanopartículas de sílica mesoporosa isentas de funcionalização externa, detendo maiores valores de cargas negativas em relação às nanopartículas peguiladas (conforme resultados de potencial zeta), interagem com proteínas do sangue (carregadas eletrostaticamente) que, por sua vez, recobrem a superfície externa gerando uma camada proteica denominada corona. O referido recobrimento protege os grupos de silanóis no que se refere à sua interação direta com a membrana das hemácias. A funcionalização com PEG minimiza as cargas superficiais e a cadeia polimérica é capaz de blindar as espécies SiO- não participantes do enxerto, conforme explicado acima. As proteínas do sangue supostamente interagem de maneira menos eficaz com a nanopartícula funcionalizada, uma vez que as cargas eletrostáticas superficiais são menos pronunciadas e a presença do polietielnoglicol dá origem a efeitos estéricos que dificultam tal interação. Além disso, sabendo-se do caráter hidrofóbico conferido às proteínas do sangue e a natureza hidrofílica acentuada das nanopartículas peguiladas em virtude da presença do PEG, a interação entre os coloides e as biomoléculas são significativamente menores e, portanto,
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determinados grupos silanóis supostamente não blindados pelo enovelamento polimérico podem interagir com as células vermelhas, induzindo maiores efeitos hemolíticos.
Tratando-se de uma situação na qual todas as nanopartículas apresentam a mesma área superficial total disponível aos sistemas biológicos em estudo, o efeito corona é mais pronunciado no contexto da NPH30-SiOH, na qual os grupos silanóis encontram-se eficientemente recobertos pelas macromoléculas biológicas possibilitando menores interações com as hemácias e, consequentemente, viabilizando menores taxas de hemólise comparando-se com todos os veículos moleculares obtidos conforme apresentado no gráfico.
Analisando-se o grupo de coloides detentores de PEG10, torna-se
novamente evidenciado o efeito da taxa de funcionalização na superfície externa em relação à hemólise conforme comentado anteriormente no tópico anterior. Aumentando-se o teor de silano PEG10 (10, 25 e 50% mol-Si) observa-se
claramente a diminuição de hemólise em função do aumento de quantidade do referido polímero na superfície. Supondo-se o menor efeito corona vigente nos três veículos moleculares é válido afirmar que a funcionalização é significativamente mais expressiva uma vez que a hemólise diminui na ordem NPH30-SiO-10PEG10 > NPH30-SiO-25PEG10 > NPH30-SiO-50PEG10. Avaliando-
se os resultados citados, entre as nanopartículas peguiladas detendo semelhantes áreas superficiais totais, o efeito de aumento da quantidade de polietilenoglicol na superfície influencia significativamente na diminuição da hemólise. Deve-se salientar, ainda no contexto de nanopartículas detendo áreas superficiais similares, que o aumento da taxa de funcionalização está possivelmente diretamente relacionado à diminuição da adsorção de proteínas na superfície externa dos coloides.
Outro resultado substancialmente importante no contexto de área superficial de carreadores de fármacos é o excelente resultado da NPH30-SiO-10GPS-PEG40
na minimização da hemólise frente aos demais veículos moleculares, demonstrando a melhor eficiência quando veículos moleculares são comparados segundo idênticas áreas superficiais totais. Tal fenômeno está atrelado à presença
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da entidade polimérica de cadeia grande capaz de blindar os grupos silanóis de maneira mais efetiva, principalmente devido ao tamanho e, consequentemente, à sua disposição espacial. No gráfico abaixo os sistemas coloidais possuem legendas com a seguinte denominação:
NPH-SiOH: SiOH
NPH30-SiO-10PEG10: 10(10)
NPH30-SiO-25PEG10: 25(10)
NPH30-SiO-50PEG10: 50(10)
NPH30-SiO-10GPS-PEG40: 10(40)
Figura 45: Efeito hemolítico pelas nanopartículas detendo área normalizada em 760 m2/g