Dentre as 192 imagens obtidas para análise no presente trabalho, são apresentadas 24 eletromicrografias selecionadas. As células coletadas nas diferentes fases de crescimento mostraram típica organização de uma célula de Microcystis. Como visto nas figuras 15-18, tanto a linhagem de M. aeruginosa não tóxica CCIBt3106, quanto a tóxica CCIBt3194 apresentaram as seguintes estruturas: 1. Parede celular (seta), 2. Tilacóides (T), 3. Aerótopos (A), 4. Amido das cianofíceas (AC), 5. Grânulo de Cianoficina (GC), 6. Grânulo de Polifosfato (GP) 7. Carboxissomo (CB) e 8. Inclusão lipídica (IL).
Figura 15. Micrografia eletrônica de transmissão da linhagem CCIBt3106 Microcystis aeruginosa (não tóxica), fase exponencial de crescimento (n=3). A) Aspecto geral da célula com tilacóides; B) Aspecto geral da célula em divisão; C) Detalhe da invaginação para divisão celular (seta); D) Detalhe dos aerótopos; E) Detalhe dos grânulos de polifosfato; F) Detalhe da organização dos tilacóides e da parede celular (seta). T. Tilacóides, GC. Grânulo de Cianoficina, A. Aerótopos, GP. Grânulo de Polifosfato, AC. Amido das cianofíceas, CB. Carboxissomo, IL. Inclusão lipídica.
Figura 16. Micrografia eletrônica de transmissão da linhagem CCIBt3194 Microcystis aeruginosa (tóxica), fase exponencial de crescimento (n=3). A) Aspecto geral da célula com tilacóides e aerótopos; B) Detalhe da invaginação para divisão celular (seta); C) Detalhe da divisão celular; D) Detalhe da parede celular (seta); E) Detalhe da organização dos tilacóides; F) Detalhe dos aerótopos. T. Tilacóides, GC. Grânulo de Cianoficina, A. Aerótopos, GP. Grânulo de Polifosfato, AC. Amido das Cianofíceas, CB. Carboxissomo, IL. Inclusão lipídica.
A B C D E F CB T CB T A GP AC CB T GP GC T AC GP AC IL A A T T A GP A AC T A IL A CB T A A A AC GC
Figura 17. Micrografia Eletrônica de transmissão da linhagem CCIBt3106 Microcystis aeruginosa (não tóxica), fase exponencial tardia de crescimento (n=3). A) Aspecto geral da célula com tilacóides proeminentes e grânulos de cianoficinas; B) Aspecto geral da célula com tilacóides vesiculados; C) Detalhes do grânulo de cianoficina e vesiculação dos tilacóides; D) Detalhes da parede celular e tilacóides alongados; E) Detalhes do arranjo dos tilacóides (padrões) e caboxissomos; F) Detalhe dos espaços intra - tilacóides. T. Tilacóides, GC. Grânulo de Cianoficina, GP. Grânulo de Polifosfato, CB. Carboxissomo, IL. Inclusão lipídica, EIt. Espaço intra-tilacóide
Figura 18. Micrografia eletrônica de transmissão da linhagem CCIBt3194 Microcystis aeruginosa (tóxica), fase exponencial tardia de crescimento (n=3). A) Aspecto geral da célula com tilacóides; B) Invaginação para divisão celular (seta); C) Aspecto geral da célula sem tilacóides visíveis; D) Detalhe da parede celular (seta); E) Detalhe do arranjo dos tilacóides; F) Detalhe dos aerótopos. T. Tilacóides, GC. Grânulo de Cianoficina, A. Aerótopos, GP. Grânulo de Polifosfato, AC. Amido das Cianofíceas, CB. Carboxissomo, IL. Inclusão lipídica.
T GC GP EIt CB IL CB T GC IL IL EIt EIt T EIt A B C D E F IL A T A T A IL CB CB A GP GC
A análise ultraestrutural mostrou mudanças significativas entre as linhagens estudas e entre as diferentes fases de crescimento. Diversas estruturas nas células de Microcystis podem mudar durante as fases de crescimento (Reynolds et al., 1981). A espessura da parede celular foi maior na linhagem tóxica quando comparada com a linhagem não tóxica, nas duas fases de crescimento (figuras 15F e 16D; 17D e 18D). Em ambas as linhagens a parede celular estava organizada por um envoltório constituído por três camadas: uma membrana mais interna (membrana citoplasmática), uma intermediária (parede celular, camada rígida composta do peptidoglicano mureína), e uma membrana externa (lipopolissacarídeos). Este tipo de disposição é típico de cianobactérias e bactérias gram-negativas (Allen, 1968).
Estudos sobre alterações na ultraestrutura de células de cianobactérias são escassos e antigos (Jost & Zehnder, 1966; Smith & Peat, 1967; Jones & Jost, 1970; Golecki & Drews, 1974; Vasconcelos & Fay, 1974; Miller & Holt, 1977; Kessel, 1978; Sherman & Sherman, 1983; Stevens et al., 1985; Wanner et al., 1986; Ariño et al., 1995). A morfologia e ultraestutura de Microcystis foram estudadas em detalhe por Reynolds et al. (1981). Um estudo compilado mais recente é uma monografia que resume um conjunto considerável de resultados das análises ultra-estruturais das cianobactérias Synechococcus sp., Anabaena
variabilis, Chlorogloepsis fritschii e Nostoc sp. mas, mesmo neste caso, boa parte das
referências datam do período entre 1960-1980 (Baulina, 2012).
Em relação à organização celular, o volume dos grânulos de cianoficinas, os aerótopos e a disposição dos tilacóides foram os que mais contribuíram para a distinção entre as linhagens e entre as diferentes fases de crescimento. Durante prolongada limitação nutricional, as estruturas intracelulares mudam consideravelmente, as mudanças mais prováveis são a degradação das membranas intracelulares do aparato fotossintético, os tilacóides, e o acúmulo de inclusões celulares (Schwarz & Forchhammer, 2005; Dagnino et al., 2006).
Os carboxissomos estavam localizados na região central das células, em ambas as linhagens e fases de crescimento (figuras 15A, 16F; 17E e 18C). Estas estruturas foram observadas isoladas ou em grupos e estão ligadas ao processo de fixação do carbono durante a fotossíntese (Badger & Price, 2003). Os carboxissomos foram mais numerosos na linhagem não tóxica indicando, o que parece indicar maior ênfase desta linhagem na fixação de CO2.
Os grânulos de polifosfato estavam presentes em ambas as linhagens, principalmente na fase exponencial de crescimento. Estes grânulos têm a função de reserva de fosfato
inorgânico (PO4 2-) e são degradados e utilizados como fontes de fosfato na biossíntese de
ácidos nucleicos e fosfolipídeos, ou servem como fonte de energia para a síntese de ATP (Allen, 1984).
Os grânulos de cianoficinas foram abundantemente encontrados na linhagem não tóxica, principalmente na fase exponencial tardia de crescimento (figura 17A). Esses grânulos são exclusivos de cianobactérias (Lawry & Simon, 1982) e são acumulados quando as células estão sob limitação de luz (Allen et al., 1980; van Eykelenburg, 1980), de fósforo (Allen et al., 1980; Stevens et al., 1981; Lawry & Simon, 1982), de enxofre (Allen et al., 1980; Lawry & Simon, 1982) ou quando as células são cultivadas em baixa temperatura (van Eykelenburg, 1979). Estes grânulos formados por aminoácidos como ácido aspártico e arginina e que são componentes essenciais na síntese de aerótopos, durante a privação de nitrogênio são os primeiros a serem degradados (Whitton & Potts, 2000).
O citoplasma da linhagem tóxica foi caracterizado por número acentuado de aerótopos, em ambas as fases de crescimento (figuras 16A e 18A). No entanto, a linhagem não tóxica apresentou raríssimos aerótopos (figuras 15D). Mesmo em cultura, células de Microcystis contêm muitos aerótopos (Jost & Zehnder, 1966; Smith & Peat, 1967; Jones & Jost, 1970; Avakyan & Baulina, 1972). Estas estruturas proporcionam flutuabilidade às células e por serem visivelmente brilhantes, de qualidade refringente e aparência avermelhada, podem estar envolvidas na proteção das cianobactérias contra a ação prejudicial de alta intensidade de luz, o que provoca a decomposição celular fotooxidativa (Walsby, 1972). No entanto, esta afirmação está ainda aberta à discussão (Baulina, 2012).
Neste estudo, encontramos correlação negativa entre a síntese de aerótopos e o volume dos grânulos de cianoficinas. Esta mesma correlação foi observada por Šejnohová (2008) em Microcystis bentônicas. Deste modo, o fato da linhagem não tóxica não possuir aerótopos na fase exponencial tardia de crescimento não está relacionado à limitação de nitrogênio na célula.
Outra forma de estocar nitrogênio nas cianobactérias que não fixam nitrogênio é através dos ficobilissomos (Li et al., 2001; Sloth et al., 2006). Os ficobilissomos são moléculas complexas nos quais estão organizadas as ficobiliproteínas, estas estruturas são encontradas nos tilacóides (Abalde et al., 1998; Sun et al., 2006). O principal papel biológico das ficobiliproteínas é o de receptores de luz durante o processo fotossintético, mas em condição de limitação de nitrogênio elas atuam como reserva de nitrogênio. Células sem
ficobiliproteínas continuam a fotossíntese porque a clorofila permanece associada ao fotossistema II (Allen, 1984). No entanto, neste estudo os ficobilissomas não puderam ser distintamente revelados na superfície externa dos tilacóides.
Na fase exponencial de crescimento, ambas as linhagens apresentaram acentuado sistema de membranas tilacoidais, com disposição padrão para o grupo, dispersos por todo o citoplasma (figuras 15A, 16A e 17F). Contudo, na fase exponencial tardia, diversas células da linhagem tóxica não apresentavam mais os tilacóides visíveis (figura 18C) e, quando presentes, apresentavam sempre arranjo típico para a espécie (figura 18E). Mudanças nos arranjos dos tilacóides, como alongado, vesiculado (aumento no espaço intra-tilacóide) e proeminente não foram observados.
Todavia, a linhagem não tóxica na fase exponencial tardia apresentou células com diferentes distribuições dos tilacóides, desde padrão (figura 17E), proeminente (figura 17A), alongado (figura 17D) e vesiculado (figuras 17B, C, D e F).
O estresse oxidativo foi atribuído como o principal agente causador de vários tipos de reorganizações estruturais e funcionais nos sistemas tilacoidais de cianobactérias (Pinevich, 1991; Baulina, 2012). Alguns trabalhos relatam a inter relação da configuração dos tilacóides e a transferência de elétrons durante a fotossíntese e também durante a respiração (Albertsson, 1982; Pinevich, 1991; Pinevich & Topchieva, 1991; Pinevich, 1997, 2006).
Células com tilacóides proeminentes e com vesiculação foram observadas quando cianobactérias foram mantidas em condições de estresse fisiológico (Findley et al., 1970; Nikitina et al., 1974; Suleimanova & Mineeva, 1981; Hardie et al., 1983; Schmetterer et al., 1983; Balkwill et al., 1984; Al-Hasan et al., 1989; Baulina, 2012). A presença de células com vesiculação significativa nos tilacóides foi associada com as fases iniciais do comprometimento funcional do aparato fotossintético (Baulina, 2012). No entanto, aparentemente, proeminências e vesiculações não são estágios obrigatórios na mudança destrutivas dos tilacóides (Stevens et al., 1981). De acordo com o que foi observado por Stevens et al. (1981), neste estudo, algumas células da linhagem tóxica não apresentavam mais tilacóides, no entanto nenhuma fase intermediária foi observada. Além disso, o acúmulo de inclusões lipídicas foi mais frequente nessas células e pode ser decorrente das alterações estruturais geradas na membrana do tilacóide (figura 18C), uma vez que a deposição de grânulos de lipídios pode ser causada pela destruição dos tilacóides (Vasconcelos & Fay, 1974).
Células com alongamento da membrana do tilacóide foram observadas quando cianobactérias foram mantidas em diferentes condições de iluminação (Al-Hasan et al., 1989; Merzlyak, 1989; Sciuto et al., 2008). O alongamento pode ocorrer devido às alterações na composição de ácidos graxos (fosfolipídios), através da atividade da dessaturase (Tasaka et al., 1996; Szalontai et al., 2000; Sciuto et al., 2008). Correlações entre a configuração dos tilacóides e a presença de amido das cianofíceas, durante um período de incubação no escuro (até 45 dias), foram feitas por Baulina (2012) para diferentes espécies de cianobactéria. Entretanto, neste estudo pudemos observar que os amidos das cianofíceas estavam presentes independentemente da forma dos tilacóides (figuras 15F, 17A e17D).
Deste modo, no presente estudo, a diferença mais acentuada entre as linhagens ocorreu na fase exponencial tardia de crescimento. Entretanto, ambas as linhagens foram mantidas sob as mesmas condições de cultivo e as análises foram realizadas no mesmo tempo amostral. Assim, diferenças encontradas na ultraestrutura dos tilacóides não podem estar relacionadas exclusivamente à limitação de nutrientes ou condição específica de cultivo, mas podem estar relacionadas à particularidade de cada linhagem em um sistema de regulação em nível genético, corroborando os dados obtidos por Pinevich, 1991.
A plasticidade ultraestrutural dos tilacóides em diferentes espécies, independente da idade da cultura e da condição de iluminação, foi documentada por Baulina (2012). Diferenças na ultraestutura dos tilacóides da cianobactéria Chlorogloeopsis fritschii, foram observadas mesmo no caso de células de tamanho semelhante envoltas por uma bainha comum (Baulina, 2012). Além disso, Synechococcus sp. cultivada sob as mesmas condições de C. fritschii apresentou células sem tilacóides ou tilacóides com distribuição padrão, mas proeminentes, alongados ou vesiculados não foram observados (Allen, 1968; Baulina, 2012). Deste modo, as diferenças entre as linhagens de M. aeruginosa na ultraestrutura dos tilacóides, na espessura da parede celular, no volume dos grânulos de cianoficinas, na quantidade de aerótopos e carboxissomos sugerem que as linhagens tóxica e não tóxica possuem diferentes mecanismos de desenvolvimento. Na natureza, estas diferenças devem constituir diferentes estratégias ecológicas para aumentar a eficiência na utilização de nutrientes e irradiância disponíveis.
5.6 Análises qualitativa e quantitativa das microcistinas LR, RR e YR utilizando a