Regulação da trascrição dos genes mcy

A produção de microcistina em resposta a fatores ambientais pode ser investigada a partir de estudos da expressão dos genes que codificam as enzimas responsáveis pela síntese da toxina (mcy).

Rueckert & Cary (2009) acompanharam os níveis de transcrição do gene mcyE de acordo com a fase de crescimento de uma cultura de Microcystis. O nível máximo de expressão ocorreu no final da fase exponencial de crescimento. Com avanço do tempo de cultivo, a transcrição do gene foi diminuindo gradualmente, de acordo com observações de vários trabalhos anteriores, mostrando uma forte correlação entre taxa de crescimento e síntese de microcistina (Long et al., 2001; Wiedner et al., 2003; Jähnichen et al., 2011; Sitoki et al., 2012).

A intensidade e a qualidade de luz têm efeito direto sobre a expressão dos genes mcy (Kaebernick et al., 2000; Kaebernick et al., 2002; Wiedner et al., 2003). Kaebernick et al. (2000) mediram a transcrição de mcyB e mcyD, em M aeruginosa, sob diferentes qualidades e intensidades de luz. Estes autores verificaram que o aumento da intensidade de luz (acima de 30 µmol. fotons m-2. s-1) e luz vermelha levavam ao aumento da transcrição, enquanto luz azul levou à redução.

O grupo de genes mcy é transcrito como duas unidades transcricionais policistrônicas,

mcyABC e mcyDEFGHIJ, a partir de promotores bidirecionais entre mcyA e mcyD

(Kaebernick et al., 2002). Porém sítios de início da transcrição adicionais foram detectados no início de outros genes e sua atividade pareceu ser dependente da intensidade luminosa (Kaebernick et al., 2002). Curiosamente, estudos seguintes não avançaram na caracterização desses padrões alternativos de transcrição.

O aumento na transcrição de genes mcy em irradiância elevada, também foi relatado na cianobactéria Planktothrix agardhii (Tonk et al., 2005). Apesar disso, o efeito da luz sobre a transcrição não pode ser correlacionado com o teor mais elevado de toxina por célula.

Em um estudo mais recente (Sevilla et al., 2012), o efeito da intensidade de luz sobre a transcrição do gene mcyD foi avaliado, confirmando que maiores valores (de 28 a 109 μmol. fotons m-2 s –1) induzem a transcrição. Porém, os autores ressaltam que este é um evento precoce e de curto prazo, pois ao se bloquear a cadeia de transferência de elétrons da fotossíntese, na verdade a transcrição deste gene cai. Isso sugere que o segundo efeito seja mediado pelo estresse oxidativo causado pelo bloqueio da fotossíntese. No entanto, o efeito destes fatores sobre a quantidade de microcistina nas células não foi tão evidente.

Ainda relacionado ao efeito da luz sobre a transcrição gênica do conjunto mcy, Straub et al. (2011) relataram pela primeira vez dados sobre a expressão global do genoma de M.

aeruginosa durante ciclo claro/escuro. Os autores verificaram variações na abundância de

transcritos de genes mcy, sugerindo que eles são influenciados por luz e possuem um ritmo circadiano endógeno. Neste caso, como todos os 10 genes foram acompanhados, pode-se detectar um padrão comum, embora não idêntico, de expressão nessas condições. De forma geral, a transcrição aumentou logo após o início da fase clara e começou a decair lentamente até o início do período escuro, quando diminuiu mais intensamente. Estes dados sugeriram que a síntese de microcistima fosse favorecida no período diurno e, portanto, se relacionasse com a parte diurna do metabolismo central (captação de carbono, fotossíntese, redução de pentoses, síntese de glicogênio). Entretanto, mais recentemente, Penn et al. (2014) caracterizam a expressão destes genes em uma floração em um ciclo de dia e noite. Para o gênero Microcystis a expressão de todos conjunto gênicos de policetídeos e peptídeos não- ribossomais (PKS/NRPS), incluindo microcistina e aeruginosina, ocorreu durante todo o período.

A deficiência de fosfato foi mais um fator que causou aumento da transcrição de mcyD, e em paralelo, aumento na concentração celular de microcistina. Já o excesso de fosfato não alterou a síntese de toxina (Kuniyoshi et al., 2013; Pimentel & Giani, 2014).

Nestes casos mencionados acima, não se caracterizou a base molecular da regulação da transcrição dos genes mcy. Porém, isso foi investigado para o efeito de nitrogênio e ferro.

Uma vez que vários estudos já haviam mostrado uma relação entre a síntese de microcistina e a disponibilidade de nitrogênio, foi avaliado se o regulador global de resposta a nitrogênio em cianobactérias (NtrA) estaria envolvido na regulação da transcrição de genes

mcy. De fato, este regulador se liga a sítios localizados na região promotora de mcyA/D e a

autoregulado), aumentando sob limitação de nitrigênio (Ginn et al., 2010). Em seguida, foi mostrado que a ligação de NtrA ao promotor dos genes mcy ocorria com maior afinidade na presença de 2-oxoglutarato (Kuniyoshi et al., 2011). Os níveis de 2-oxoglutarato na célula refletem o balanço da concentração intracelular de nitrogênio em relação à de carbono. Por sua vez, NtcA é um regulador global, ligado não só ao metabolismo de nitrogênio mas também de carbono, à fotossíntese e a respostas de estresse. Assim, o status N/C poderia influenciar a síntese de microcistina. Estes dados foram confirmados por Pimentel & Giani (2014), que acompanharam a síntese de microcistina sob limitação de nitrogênio e relataram aumento da cota celular de microcistina e da transcrição do gene mcyD, além de correlação direta entre a transcrição do gene ntcA e a o do gene mcyD.

Em contraste, em um estudo recente, a resposta do transcriptoma de uma linhagem tóxica de M. aeruginosa durante o crescimento com baixos níveis de nitrogênio inorgânico dissolvido foi avaliada utilizando-se a tecnologia de RNA-Seq. Com baixo teor de nitrogênio, o conteúdo de microcistina por célula foi significativamente reduzido e os transcritos dos genes microcistina sintetase foram menos abundantes, sugerindo que a síntese de microcistina é dependente de um fornecimento suficiente de nitrogênio (Harke & Gobler, 2013).

Também foi testado se a resposta a disponibilidade de ferro seria mediada pela ligação do regulador global Fur à região promotora do conjunto mcy. Fur é um regulador transcricional que se liga a sequências específicas quando complexado a Fe+2, reprimindo a transcrição gênica. Em baixas concentrações de ferro intracelulares, Fur livre de Fe+2 se libera do DNA, permitindo a transcrição. A região promotora do conjunto mcy apresenta sequências reconhecidas por Fur in vitro, o que sugere que pode regular a síntese de microcistina (Martin-Luna et al., 2006). De acordo com esta ideia, a deficiência de ferro aumentou tanto a transcrição de mcyD quanto a síntese de microcistina em M. aeruginosa PCC7806 (Sevilla et al., 2008).

Em um trabalho mais extenso, a relação entre limitação de ferro e síntese de microcistina foi avaliada com três linhagens, sendo uma tóxica (PCC7806), seu mutante

mcyH- e uma linhagem naturalmente não tóxica (PCC7005) e em diferentes fases de

crescimento (Alexova et al., 2011a). Genes relacionados à síntese de microcistina, aquisição de ferro e resposta a estresse oxidativo foram testados. Observou-se ampla variação dos padrões de transcrição em resposta a baixo ferro de acordo com a linhagem e com a fase de crescimento. Embora em células privadas de ferro a cota celular de microcistna tenha

aumentado, esse efeito não ocorreu na transcrição gênica. Cabe notar que as duas linhagens não tóxicas, uma selvagem e outra a mutante construída (mcyH-) a partir de PCC7806, não responderam da mesma forma à limitação de ferro.

Embora em alguns trabalhos o aumento/diminuição da transcrição de genes mcy seja acompanhado de aumento/diminuição da quantidade de microcistina, isso não é geral. Muito das discrepâncias pode ser devido ao fato de que não foi dosada a microcistina total (incluindo a conjugada com proteínas), apenas a solúvel. Outro fator responsável seria o fato de que a síntese das enzimas do complexo mcy pode não significar sua imediata atividade, que pode depender da formação do complexo, modificação das enzimas, localização específica, sendo que nenhum destes aspectos foi estudado ainda. Além disso, na maior parte dos casos se escolhe apenas um gene do conjunto para avaliar a resposta, e a síntese da toxina depende da presença de todas as enzimas do conjunto.