4.11.1 Caracterização filogenética das cepas estudadas
Após a definição das linhagens tóxica e não tóxica, foi realizado o sequenciamento de diferentes marcadores moleculares: 16S RNAr e genes envolvidos na biossíntese de microcistinas (mcyD, mcyE e mcyG). As análises moleculares foram desenvolvidas no Laboratório de Biologia, Ecologia e Taxonomia de Algas - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, UNESP - São José do Rio Preto, em colaboração com a Dra. Janaina Rigonato. O sequenciamento foi realizado na empresa Genomic Engenharia Molecular Ltda, São Paulo-SP.
4.11.2 Preparação da amostra para extração de DNA genômico
A produção de biomassa para as análises moleculares foi realizada a partir de linhagens uniespecíficas. Para a extração de DNA, utilizou-se cerca de 10 mL de cultura em meio líquido. Uma vez que as linhagens estudadas não são axênicas e apresentam bainha mucilaginosa, métodos de lavagem foram necessários para remoção de bactérias heterotróficas associadas. A presença destas bactérias aderidas ou não à bainha mucilaginosa pode interferir nas diferentes etapas da análise. Deste modo, os tratamentos I ou II foram utilizados para a lavagem da biomassa produzida, como segue:
4.11.3 Tratamento I
1 mL de Tampão TE (Tris 1 M pH 8,0, EDTA 0,5 M) foi adicionado ao material e agitado em vortex. Posteriormente, o material foi centrifugado (10.000 g por 10 min) e o sobrenadante descartado. Este procedimento foi repetido 3 vezes (Kling et al., 2012).
4.11.4 Tratamento II
500µl de solução de lavagem (Tris-HCL 1M pH 8,0; EDTA 0,5M e NaCL 5M) e 50µl de SDS 2% (dodecil sulfato de sódio) foram adicionados às amostras. Posteriormente, o material foi agitado em vortex, centrifugado (10.000 g por 5 min) e o sobrenadante descartado. Por fim, adicionou-se mais 1 mL da solução de lavagem e o material foi agitado em vortex novamente, centrifugado (5.000 g por 5 min) e o sobrenadante descartado.
4.11.5 Extração de DNA genômico
A extração e a purificação do DNA genômico foram realizadas por meio do Kit Ultra Clean® Microbial DNA Isolation (MO BIO, Carlsbad, CA, EUA). Alíquotas (5μl) dos DNAs extraídos foram acrescidas de tampão de carregamento (azul de bromofenol 0,5%; glicerol
0,3%; EDTA 0,5M) e GelRedTM 0,6X (Biotium, Hayward, USA). A integridade dos mesmos
foi verificada em gel de agarose 1 %, após corrida eletroforética em tampão TBE 0,5X (1X TBE: Tris-borato 45 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0). A documentação do gel foi feita usando o programa Multi Analyst do Fluor-STM MultiImager (BioRad, Hercules, CA, USA). Como
padrão de tamanho e concentração de DNA foi utilizado o marcador Low DNA Mass Ladder (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). O DNA genômico foi armazenado à temperatura de -20ºC até o momento de realização da próxima etapa.
4.11.6 Amplificação gênica do fragmento 16S RNAr + ITS
A amplificação do fragmento gênico 16S RNAr + ITS foi realizada utilizando os seguintes oligonucleotídeos iniciadores: 27F1 (5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) (Neilan et al., 1997) e 23S30R (5’ –CTTCGCCTCTGTGTGCCTAGGT- 3’) (Taton et al., 2003). A amplificação do fragmento foi realizada em solução contendo: 5 μL de tampão para
a reação PCR 1X (Tris HCl 20mM, pH 8,4; KCl 50 mM), 0,25 mM de cada dNTP, MgCl2 3
mM, 1,5 U de Platinum® Taq DNA Polimerase (Life Technologies), 20-50 ng de DNA, 5 µM de cada iniciador, água ultrapura (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) esterilizada, para um volume final de 25 μL. A reação foi realizada em um termociclador Techne TC-412 Thermocycler (Bibby Scientific). As condições para amplificação foram: 94ºC por 5’, seguidos de 25 ciclos de desnaturação a 92ºC por 45”, anelamento a 57ºC por 45”, extensão a 72ºC por 2’; e extensão final a 72ºC por 7’. A verificação dos produtos de PCR e documentação do gel foi realizada conforme descrito no item 4.11.2.
4.11.7 Amplificação de fragmentos gênicos envolvidos na biossíntese de microcistinas,
mcyD, mcyE e mcyG
A fim de verificar o potencial genético para produção de microcistinas na linhagem que não produziu microcistinas, a presença dos genes mcyD, mcyE e mcyG foi investigada. Para a
amplificação de fragmento do gene mcyD (~818 pb, codifica parte da cetoacilsintase e
domínio da aciltransferase - PKS) utilizou-se os iniciadores mcyDF
(5´GATCCGATTGAATTAGAAAG3´) e mcyDR (5´GTATTCCCCAAGATTGCC3´)
(Rantala et al., 2004). Para o gene mcyE (809 a 812 pb, codifica parte do domínio de adenilação e do sítio de ligação da fosfopanteteína - PS) foram usados os iniciadores mcyEF2 (5`GAAATTTGTGTAGAAGGTGC3`) e mcyER4 (5`AATTCTAAAGCCCAAAGACG3`) (Rantala et al., 2004). A amplificação de fragmento do gene mcyG (385 pb, codifica o domínio da C-metiltransferase - PKS) foi realizada a partir dos iniciadores mcyGF (5`GAAATTGGTGCGGGAACTGGAG3`) e mcyGR (5`TTTGAGCAACAATGATACT TTGCTG3`) (Fewer et al., 2007). A amplificação do fragmento foi realizada em solução contendo: 5 μL de tampão para a reação PCR 1X (Tris HCl 20mM pH 8,4; KCl 50 mM), 0,25 mM de cada dNTP, MgCl2 3 mM , 1,5 U de Platinum® Taq DNA Polimerase (Life
Technologies), 20-50 ng de DNA, 5 µM de cada iniciador, água ultrapura (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) esterilizada, para um volume final de 25 μL. A reação foi realizada em um termociclador Techne TC-412 thermocycler (Bibby Scientific). As condições para amplificação foram: 95ºC por 3’, 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30”, anelamento a 52ºC por 30’, extensão a 72ºC por 3”; e extensão final a 72ºC por 10 min. A verificação dos produtos de PCR e documentação do gel foi realizada conforme descrito no item 4.11.2.
As amostras positivas a PCR foram purificadas utilizando o kit “GFX PCR DNA e Gel Band Purification Kit” (GE Healthcare). No caso onde a presença de mais de uma banda foi observada após a eletroforese, elas foram excisadas do gel e purificadas utilizando o mesmo kit.
4.11.8 Clonagem dos fragmentos gênicos
Dentre os marcadores analisados neste estudo (16S RNAr + ITS, mcyD, mcyE e mcyG), a clonagem foi realizada apenas para o fragmento 16S RNAr + ITS. Após a amplificação das sequências de DNA via PCR foi realizada a clonagem dos produtos da PCR utilizando o kit de clonagem “pGEM®-T Easy Vector Systems” (Promega). A introdução do vetor contendo o inserto nas células competentes de E. coli DH5α foi feita através de choque térmico (Sambrook et al., 1989). Alíquotas de 10 μL do produto de ligação e 100 μL de suspensão de células competentes de E. coli DH5α foram misturadas em um microtubo esterilizado, o qual foi incubado no gelo durante 30 min. O microtubo foi transferido imediatamente para banho-
maria a 42ºC e deixado por 30 segundos, sem agitar. Em seguida o microtubo foi incubado no gelo por 2 min. Posteriormente adicionou-se 250 μL de meio SOC (Sambrook et al., 1989) à temperatura ambiente e a mistura foi incubada a 37ºC, durante 1 hora, sob agitação de 200 rpm. As células competentes transformadas foram plaqueadas em meio LB sólido contendo ampicilina (USB Corporation, Cleveland, OH, EUA) e X-Gal (Life technologies), ambos em concentrações finais de 100 μg/mL de meio. As placas foram incubadas por 15 horas, à temperatura de 37ºC. Em seguida, uma colônia de cor branca foi utilizada para reação de PCR, visando confirmar a presença dos insertos de interesse. Uma pequena quantidade de células de cada clone transformado foi adicionada a 25 μL de reação de PCR utilizando-se os
iniciadores: CYA359F (5’-GGGGAATTTTCCGCAATGGG-3’), CYA781aR (5’-
GACTACTGGGGTATCCTAATCCCATT-3’) e CYA781bR (5’-
GACTACAGGGGTATCTA ATCCCTTT-3’ – (Nubel et al., 1997). A amplificação foi feita em solução contendo: tampão para reação PCR 10X (Tris HCl 20mM pH 8,4; KCl 50 mM); 0,2 mM de cada dNTP; MgCl2 3 mM; 1,5 U de Platinum® Taq DNA Polimerase (Life technologies); 10 ng de DNA; 5 pmol de cada iniciador; água ultrapura (Milli-Q) esterilizada, para um volume final de 25 µL. A reação foi feita em um termociclador Techne TC-412 Thermocycler (Bibby Scientific). As condições de amplificação foram: 94ºC por 5 min; 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 min, anelamento a 63ºC por 1 min, extensão a 72ºC por 1 min; e extensão final a 72ºC por 1 min. A verificação do tamanho dos produtos da PCR gerados foi feita em gel de agarose 1,0% - 0,5 X TBE conforme descrito acima.
4.11.9 Extração de DNA plasmidial
A extração de plasmídeos das células de E. coli DH5α que continham os insertos foi feita pelo método de preparação de pequena escala de plasmídeo, usando hidrólise alcalina (Birnboim & Doly, 1979). As colônias brancas foram transferidas para 4 mL de meio LB contendo ampicilina e cultivadas por 15 horas, a 37ºC, sob agitação de 200 rpm. Em microtubos foram colocados 1,5 mL da cultura de células que, em seguida, foram centrifugadas a 10.000 × g por 20 segundos. Esse procedimento repetiu-se por duas vezes. O pellet formado foi ressuspendido em 100 μL de solução I gelada (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM e glicose 50 mM). Em seguida, 200μL de solução II (NaOH 0,2 N, SDS 1%) foram adicionados e misturados gentilmente por meio da inversão dos microtubos. Após terem sido incubados no gelo por 5 minutos, foram acrescentados 150μL de solução III
gelada (acetato de potássio 3 M e ácido fórmico 1,8 M). Novamente foi realizada a mistura por inversão e os microtubos foram incubados no gelo por mais 5 minutos. Posteriormente, foram centrifugados a 10.000 × g durante 7 minutos e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Adicionou 270 μL de isopropanol à temperatura ambiente, misturando e centrifugando conforme descrito anteriormente. Após a eliminação do sobrenadante, o pellet foi lavado uma vez com 250 μL de etanol 70% gelado e centrifugado a 10.000 x g por 2 minutos. O pellet foi seco e ressuspendido em 30 μL de uma solução contendo Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,5 M e RNAse a 10 mg/mL. Incubou-se essa mistura a 37ºC por 30 minutos. Os plasmídeos assim extraídos foram armazenados a -20ºC até o próximo uso.
4.11.10 Sequenciamento
A PCR para o sequenciamento dos fragmentos inseridos nos plasmídeos foi feita usando-se o kit “DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing” (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA). Para a reação foram utilizados 200 ng de plasmídeo contendo o inserto, 5 ρmol dos iniciadores externos M13F(5’-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’) ou M13R (5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’) e 2 μL de “Big Dye Terminator versão 3.0 ” e 2µL de tampão 5X BigDye Terminator Sequencing Buffer (Life technologies) (protocolo fornecido pelo fabricante) e água ultrapura para volume final de 10 μL. Também foram utilizados conjuntos de iniciadores visando o fechamento das sequências que codificam o 16S RNAr (357F, 357R, 704F, 704R, 1114F, 1114R) (Lane, 1991). As condições de amplificação foram as seguintes: 30 ciclos de 95ºC por 20 s, 50ºC por 15 s, 60ºC por 1 min. Após a amplificação dos fragmentos, foi realizada a precipitação dos mesmos conforme manual de instruções do kit. Posteriormente, as reações precipitadas foram analisadas no sequenciador capilar ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Life technologies) para o sequenciamento dos fragmentos de DNA. Os dados gerados pelo sequenciador foram coletados e processados pelo programa “ABI PRISM® DNA Sequencing – Analysis Software” versão 3.7 (Applied Biosystems).
O sequenciamento dos marcadores para microcistinas mcyD, mcyE e mcyG foi conduzido diretamente a partir dos produtos de PCR purificados. Para cada amostra foram misturados 50 ng de produto de PCR com 5 pmol dos respectivos iniciadores usados na PCR, nas mesmas condições descritas acima. Os fragmentos foram sequenciados e comparados com sequências depositadas no GenBank do National Center for Biotechnology Information
(NCBI) utilizando-se a ferramenta Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1990).
4.11.11 Processamento e análise filogenética das sequências
As sequências geradas foram processadas para checagem de bases produzidas com baixa qualidade (índice de qualidade ≤ 20) através do pacote de programas Phred/Phrap/Consed (Ewing & Green, 1998; Ewing et al., 1998; Gordon et al., 1998), em sistema operacional Linux. As sequências obtidas foram comparadas com outras previamente depositadas no GenBank do National Center for Biotechnology Information (NCBI), utilizando-se a ferramenta Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1990).
Para a construção das árvores filogenéticas, as sequências obtidas neste estudo e outras selecionadas nos bancos de dados públicos foram alinhadas (ClustalW) e editadas manualmente. Os métodos de inferência foram Neighbor Joining (NJ) e Máxima Verossimilhança (ML), implementados a partir do pacote de programa MEGA 5.0 (Tamura et al., 2011), e Inferência Bayesiana (IB), utilizando-se MrBayes 3.2.2 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003). O teste de modelos de análises filogenéticas foi aplicado no programa Topali 2.5 (Milne et al., 2009) a fim de se definir qual o melhor modelo evolutivo a ser aplicado para o conjunto de sequências analisadas. Os modelos utilizados para cada conjunto de sequências estão descritos nas legendas das árvores filogenéticas apresentadas. A porcentagem de identidade entre as sequências analisadas foi realizada pelo método “p- distance” no programa MEGA 5.0 (Tamura et al., 2011).
Em relação à inferência Bayesiana, os parâmetros para a construção da árvore filogenética foram fixados em duas corridas de 15.000.000 gerações em quatro cadeias, com reamostragem a cada 1000 árvores. A qualidade das corridas foi avaliada pela convergência entre as corridas independentes usando o programa TRACER versão 1.5 (Rambaut & Drummond, 2007), e os 10% iniciais da corrida foram descartados (burn-in). Posteriormente, a melhor topologia foi obtida através de consenso estrito.