A proteômica é o estudo integrado do conjunto total de proteínas expressas por um organismo, sob um determinado estímulo. Seu objetivo é obter uma visão global e integrada de todas as proteínas da célula (Graves & Haystead, 2003). Tais estudos podem fornecer informações sobre fenótipos de células e efeitos de alterações do ambiente sobre os organismos. Em suma, é possível observar alterações quantitativas, detectar modificações
pós-traducionais, identificar interações protéicas ou estabelecer a dinâmica celular de proteínas e seus complexos (Ow & Wright, 2009).
Embora o gênero Microcystis seja amplamente estudado devido à sua capacidade de formar florações tóxicas, de grande importância no âmbito econômico, ecológico e de saúde púbica, são escassos os trabalhos a respeito do padrão de expressão de proteínas. No Brasil, apenas um trabalho foi desenvolvido neste assunto (Tonietto et al., 2012). Neste estudo, foram comparados os proteomas de duas cepas, sendo uma tóxica M. aeruginosa (PCC 7820) e a outra não tóxica (NIVA CYA43). Entre as proteínas diferencialmente expressas, não foram observadas enzimas diretamente envolvidas na biossíntese da microcistina. Os autores concluíram que a produção da microcistina depende da expressão em níveis mais elevados de proteínas relacionadas principalmente ao metabolismo energético, considerando-se o gasto necessário para sua produção. Este estudo foi baseado na metodologia de separação de proteínas por géis em eletroforese bi-dimensional, seguido de identificação por espectrometria de massas.
O método livre de gel, sem marcação (label-free) ou com uso de marcação de proteínas com tags de massa (iTRAQ) são abordagens mais avançadas, que embora aumentem muito a complexidade de execução, tem potencial de revelar um número maior de proteínas, sendo bem mais eficientes que o desenvolvido em gel. Destaca-se que a análise proteômica livre de gel ainda é pouco desenvolvida no Brasil e esta tese representa o primeiro estudo de cianobactéria a utilizar esta abordagem. No exterior, os estudos mais importantes e recentes que abordam a elucidação do papel de microcistinas têm usado a abordagem proteômica e outras de larga escala, como descrito a seguir.
Um estudo amplo de proteômica comparativa com o objetivo de elucidar o papel da microcistina foi aplicado a seis linhagens de M. aeruginosa, naturalmente tóxicas e não tóxicas (Alexova et al., 2011b). A maior parte das diferenças foi representada por particularidades de cada linhagem, não tendo relação com a produção da toxina, e de fato nenhuma proteína pode ser identifiada como exclusiva de linhagens tóxicas ou não tóxicas. As proteínas diferencialmente expressas eram participantes do metabolismo de carbono/nitrogênio e manutenção do estado redox. Os autores mencionam que diferenças na aclimatação às condições de mudança do estado redox, de luz ou de disponibilidade de carbono podem, portanto, ser os parâmetros principais que distinguem linhagens tóxicas de não tóxicas.
Em outra abordagem, a comparação dos proteomas da linhagem de M. aeruginosa PCC 7806 e seu mutante mcyB- foi feita sob condições de alta intensidade luminosa (300 μmol. fotons m-2 s –1) e estresse oxidativo, e escuro (Zilliges et al., 2011). Isso resultou na alteração da expressão de diversas proteínas envolvidas com a fotossíntese: principalmente enzimas do ciclo de Calvin, ficobiliproteínas e redutases. Em muitos casos as linhagens diferiam em isoformas das mesmas proteínas, e verificou-se que isso resultava da ligação covalente da microcistina a diversas proteínas na linhagem selvagem, o que era intensificado em condições de alta irradiância e estresse oxidativo. A microcistina se ligou a resíduos de cisteína de diversas proteínas in vitro, inclusive à subunidade maior de RuBisCo, o que aumentou sua resistência à degradação. De acordo com estudos anteriores, o mutante foi mais sensível sob alta irradiância (300 μmol. fotons m-2 s –1) e tratamento com peróxido de hidrogênio. Estes dados sugeriram um papel modulador para a microcistina, estabilizando proteínas específicas sob estresse oxidativo (Zilliges et al., 2011).
Recentemente, foi feita nova comparação entre a linhagem de M. aeruginosa PCC 7806 e seu mutante mcyB- em termos de transcriptoma, sob baixa irradiância (16 μmol. fotons m-2 s –1), condição em que as duas linhagens não diferem em crescimento, mas diferem quanto aos conteúdos de clorofila a e pigmentos (Makower et al., 2015). Grande parte de genes do metabolismo intermediário foi menos expressa no mutante, incluindo funções como aquisição e metabolismo de carbono, assim como genes ligados à fotossíntese (indicando alteração da razão PSI: PSII), respiração e metabolismo energético, ainda que não houvesse diferença nas taxas de crescimento. Por outro lado, genes mais expressos no mutante corresponderam a funções como transporte de bicarbonato, indicando que o mutante seja mais sensível à limitação de carbono, de acordo com evidências anteriores de cultivo nesta condição. Genes de chaperoninas também foram mais expressos no mutante, o que pode indicar maior necessidade de manter a estrutura de proteínas na ausência da função estabilizadora da microcistina. A principal categoria regulada positivamente no mutante foi do metabolismo secundário. Em alguns casos, o efeito na transcrição pode ser complementado pela adição de microcistina no meio. O trabalho sugere que a microcistina tenha múltipos papéis na célula e que tenha efeito predominante intracelular, mas também possa sentida a partir do meio externo (Makower et al., 2015).
Também recentemente, uma análise inédita de metabolômica comparando estas mesmas duas linhagens (PCC7806 e mutante mcyB-) revelou mais uma vez um papel crucial
da microcistina na adaptação a alta irradiância (250 μmol. fotons m-2 s –1) (Meissner et al., 2014). A partir da identificação de metabólitos sintetizados, foi visto que a linhagem selvagem acumulou glicolato mais rapidamente em resposta ao aumento de luz, enquanto que o mutante acumulou moléculas indicadoras de estresse, como trealose e sacarose.
Apesar dos inúmeros estudos, ainda há muitos resultados contraditórios em relação à produção de microcistinas e ainda não há clareza sobre sua função bem como o controle de sua produção (Kaebernick & Neilan, 2001; Welker & von Döhren, 2006). Essa falta de dados conclusivos gera uma lacuna quando se busca estabelecer como e quando uma toxina pode ser produzida por uma dada espécie de cianobactéria. Uma visão que inclua a produção de toxinas como um fenômeno associado à fisiologia do microorganismo pode contribuir para a o controle de florações tóxicas no ambiente. Assim, nosso objetivo foi estudar a produção de microcistinas de forma integrada, analisando parâmetros morfométricos, fisiológicos, ultraestruturais, genéticos e toxicológicos.
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo geral
Comparar em diferentes fases de crescimento, as variações no crescimento, na morfologia, no perfil de proteínas e na produção de microcistinas de duas cepas de M.
aeruginosa, uma tóxica e outra não.
3.2 Objetivos específicos
Para cada cepa e em cada fase:
Determinar variações fisiológicas associadas ao crescimento celular, número de células e produção de pigmentos (clorofila-a, ficobiliproteínas e carotenóides).
Avaliar parâmetros ultra estruturais em relação ao crescimento celular.
Estudar as variações morfométricas, como diâmetro celular, bainha mucilaginosa.
Identificar proteínas diferencialmente expressas.
Avaliar possíveis correlações entre a categoria funcional das proteínas identificadas, a capacidade de produzir microcistinas, e as alterações fisiológicas em geral.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Coleta
Para o desenvolvimento deste trabalho foram realizadas três coletas em ambientes com florações de cianobactérias, com o objetivo de isolar uma linhagem tóxica e outra não tóxica de M. aeruginosa:
Represa Billings – “Prainha” – Riacho Grande, São Bernardo. A coleta foi realizada no dia 15/01/2011.
Lago das Garças- Instituto de Botânica do Estado de São Paulo, São Paulo. A coleta foi realizada no dia 22/01/2011.
Represa de Furnas- Areado, Minas Gerais. A coleta foi realizada no dia 12/06/2011.
Também se tentou isolar linhagens a partir de outras amostras coletadas por outros pesquisadores do Instituto de Botânica e foram analisadas:
Lago Jaó- Goiânia-Goiás. Amostra cedida pelo Ms. Watson Arantes Gama Junior.
A coleta foi realizada no dia 07/03/2011.
Viveiro localizado na cidade de Jabuticabal- SP. Amostra cedida pelo Dr. João Alexandre Saviolo Osti. A coleta foi realizada no dia 15/03/2011.
Lago em Jundiaí-SP. Amostra cedida pela Dra. Maria Teresa de Paiva Azevedo. A
coleta foi realizada no dia 04/07/2011.
As amostras foram coletadas com garrafa de plástico na superfície da água. Após a coleta, as amostras foram acondicionadas em caixas com gelo, protegida da luz, até serem analisadas em laboratório. Parte de todas as amostras foi fixada (formol 4%) e outra parte foi mantida fresca.
4.2 Isolamento e cultivo
Os procedimentos de isolamento e cultivo do material foram realizados no Laboratório de Cultura de Algas e Cianobactérias “Marilza Cordeiro Marinho” do Núcleo de Pesquisa em Ficologia, Instituto de Botânica. O isolamento do material foi feito em câmara de fluxo laminar, utilizando-se os métodos de plaqueamento e pescaria (Jacinavicius et al., 2013). As linhagens, tanto do isolamento quanto da manutenção (quando já isoladas), foram mantidas em sala com condições controladas: temperatura 23±2 °C, irradiância 40-50 μmol. fotons m-2
s –1 e fotoperíodo 14-10h claro-escuro (Azevedo & Sant'Anna, 2003). A irradiância foi medida com o uso do medidor de quanta Li-COR (modelo LI-250) com sensor subaquático esférico Li-COR (modelo LI-190).