A linhagem tóxica apresentou colônias de 150µm a 800µm de diâmetro na fase exponencial e de 400µm a 1.850µm de diâmetro na fase exponencial tardia de crescimento. As células permaneceram densamente distribuídas em toda a mucilagem colonial nos dois tempos amostrais (figura 13C, D). Por outro lado, a linhagem não tóxica na fase exponencial exibiu pequenas colônias (˂ 100µm) com no máximo 4 células (figura 13A). Na fase exponencial tardia, as colônias continuaram pequenas (˂ 100µm) e atingiram um número máximo de 20 células, sendo a média 7,5 ± (4,1) células por colônia (figura 13B). As células encontravam-se sempre dispersas na mucilagem (figura 13B). A bainha mucilaginosa manteve-se ampla nas diferentes fases de crescimento (figura 13A, B).
A formação de colônias é uma característica comum em Microcystis e o seu tamanho pode variar de poucas a centenas de células (Reynolds et al., 1981; Šejnohová, 2008). Além do mais, algumas características morfológicas podem mudar com o tempo de cultivo, como desagregação celular, perda de aerótopos e mucilagem (Lange, 1976; Krüger & Eloff, 1977; Rippka, 1979; Krüger et al., 1981; Reynolds et al., 1981; Otsuka et al., 2000; Day et al., 2005; Zhang et al., 2007). Entretanto, as linhagens mantiveram as características morfológicas típicas da espécie durante todo o estudo (figura 9).
Diversos trabalhos têm reportado que o tamanho da colônia está diretamente relacionado com a concentração de microcistinas extracelulares, assim essas toxinas atuariam tanto na formação das colônias quanto na sua especificidade (Minillo et al., 2000; Kurmayer et al., 2003; Kehr et al., 2006; Sedmak & Elersek, 2006; Zilliges et al., 2008; Gan et al., 2012). A produção de microcistinas afeta a expressão das proteínas extracelulares envolvidas no contato célula-célula (Kehr et al., 2006; Zilliges et al., 2008).
Assim, linhagens tóxicas apresentariam células agregadas com distribuição homogênea na colônia. Enquanto linhagens não tóxicas, devido à deficiência na expressão das proteínas extracelulares, apresentariam células dispersas na mucilagem. Desta forma, nossos dados corroboram o fato de que linhagens tóxicas produzem principalmente colônias grandes e células agregadas, o que já foi constatado também por Kurmayer et al. (2003), Sedmak & Elersek (2006) e Gan et al. (2012) e linhagens não tóxicas, apresentam colônias com células dispersas na mucilagem.
Outra característica morfológica marcante que diferenciou as linhagens estudadas foi o tamanho da bainha mucilaginosa. Os polissacarídeos são os principais componentes da
mucilagem de M. aeruginosa (Plude et al., 1991). A composição elementar (C, H, O) das secreções envolve baixo custo para as células (Margalef, 1997). A densidade média da mucilagem de Microcystis é tipicamente equivalente à densidade da água que elas habitam (diferença de 0,07%) (Reynolds et al., 1981).
A presença da mucilagem é um importante critério taxonômico, portanto vários artigos descrevem sua morfologia. Contudo, são pouquíssimos os trabalhos que consideram as funções e os benefícios que a mucilagem pode fornecer a espécie (Reynolds, 2007). Mesmo assim, algumas funções foram propostas: 1) a bainha mucilaginosa poderia fornecer um micro ambiente especializado em torno das células, no qual nutrientes essenciais são concentrados e mantidos (Lange, 1976; apud Reynolds et al., 1981); 2) a bainha poderia ser um local para concentrar os carboidratos não utilizados (Margalef, 1997); 3) a bainha poderia ser utilizada como defesa contra o oxigênio. Sirenko (1972) demonstrou que um microambiente de baixo redox é mantido no interior da mucilagem de diversas espécies de cianobactérias, fato atribuído à produção e a manutenção de radicais de sulfidrila. Estes radicais ajudam a proteger as células contra processos oxidativos e a tolerar elevadas concentrações de oxigênio externo (Gusev, 1962; Sirenko et al., 1969; Sirenko, 1972; apud Reynolds, 2007); 4) a bainha poderia regular a flutuabilidade: quanto maior a colônia, maior a superfície de contato, o que proporciona maior flutuabilidade (Reynolds & Walsby, 1975); 5) ao mesmo tempo, colônias grandes e a presença de mucilagem ofereceriam proteção contra a predação, diminuindo significativamente as taxas de herbivoria, sendo este quesito mais uma consequência (Gliwicz, 2003).
De acordo com Reynolds (2007), a ideia de que a mucilagem pode ser um repositório para a concentração e armazenamento de nutrientes essenciais é antiga e foi mencionada formalmente apenas por Lange (1976). Ainda segundo Reynolds (2007), concentrações intracelulares de nitrogênio, fósforo e mesmo carbono são da ordem de um milhão de vezes maiores do que nos lagos e mares, e armazenar nutrientes extracelulares parece ser uma atividade de alto risco para célula. Portanto, o autor não considera viável esta hipótese. Outra observação é que a produção de mucilagem ocorre principalmente em ambientes deficientes em nutrientes, ao longo de vários dias e em águas rasas, o que implica uma resposta à exposição a altos níveis de irradiância (Margalef, 1997). As linhagens neste estudo mantiveram as mesmas características ao longo do crescimento (figura 13). Além disso, principalmente a linhagem não tóxica, apresentou ampla bainha mucilaginosa no início da fase exponencial de crescimento, quando os nutrientes no meio não eram limitantes.
Como visto, não há uma explicação única e inequívoca para a função da mucilagem e nem todas as funções que foram sugeridas podem ser consideradas viáveis (Reynolds, 2007). Para este autor, duas funções são de fato prováveis para a bainha de mucilagem: flutuabilidade e proteção contra processos oxidativos. O papel da bainha na flutuabilidade é provável para colônias maiores do que 100 µm, já que para as menores, a mucilagem não seria suficiente para aumentar a sua taxa de flutuabilidade.
No presente estudo, parece mais provável que a bainha tenha tido um papel na proteção contra processos oxidativos, já que ambas as linhagens produziram ampla bainha mucilaginosa. No entanto, a grande diferença entre as linhagens foi o número de células por colônia e o tamanho das colônias, que foi muito maior na linhagem tóxica. Neste caso, a flutuabilidade promovida pela bainha parece ter sido importante para a manutenção das grandes colônias tóxicas (˃ 100µm) na superfície. Esta flutuabilidade das colônias tóxicas foi nitidamente observada nos frascos de cultivo. Ao contrario, as colônias não tóxicas (˂ 100µm) permaneceram sempre distribuídas no meio ou no fundo dos frascos.
Figura 13. Microcystis aeruginosa CCIBt3106 (não tóxica): A. Fase exponencial, aspecto geral das colônias; B. Fase exponencial tardia, detalhe das células distribuídas em ampla bainha mucilaginosa.
Microcystis aeruginosa CCIBt3194 (tóxica): C. Fase exponencial, aspecto geral das colônias; D.
Fase exponencial tardia, aspecto geral da colônia com as células agregadas.
20µm
D
D
Além da mudança na morfologia das colônias, a linhagem não tóxica apresentou diâmetros celulares estatisticamente maiores quando comparada com a linhagem tóxica, nos dias 5, 15, 17 e 18 do cultivo (figura 14).
Figura 14. Variação dos diâmetros celulares (μm) das linhagens de M. aeruginosa. A. CCIBt 3106 (não tóxica); B. CCIBt3194 (tóxica). Média mais desvio padrão (caixa) e mínimo e máximo (barra) – “Whisker Box-Plot” (n=30). As diferenças estatísticas são reportadas segundo o teste de variância (ANOVA) fator único, seguido do teste de comparação múltipla de Tukey: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001, comparação entre as diferentes linhagens
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 4 5 6 7 8 Não tóxica dias D iâm e tr o c e lu la r ( u m ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 4 5 6 7 8 Tóxica dias D iâm e tr o c e lu la r ( u m ) * *** ** * A B exponencial estacionária exponencial estacionária
De acordo com os relatos da literatura, linhagens não tóxicas possuem maiores diâmetros celulares (Rohrlack et al., 2001; Kurmayer et al., 2002; Kurmayer et al., 2003; Via- Ordorika et al., 2004). Watanabe et al. (1991) classificaram linhagens de M. aeruginosa em dois grupos, com base na análise estatística dos diâmetros celulares, ou seja, tamanho de célula pequena (S) e tamanho de célula grande (L).
Segundo os autores, estes dois grupos também podem ser reorganizados pela sua composição de microcistinas. As cepas que pertencentes ao grupo L continham microcistinas- RR, YR e LR, enquanto a maioria das cepas do grupo S não era tóxica. No entanto, uma cepa altamente tóxica, que produziu microcistina-LR em quantidade de mais de 1% do seu peso seco, também pertenceu ao grupo S. Portanto, ainda não se pode alegar que existe relação direta entre o aumento do diâmetro celular e a produção de microcistinas.
Além disso, avaliando todo o período de cultivo estudado, as linhagens (produtora e não produtora de microcistinas) mantiveram o mesmo comportamento geral na distribuição do diâmetro celular (figura 14). Deste modo, a diferença encontrada entre as linhagens em relação ao diâmetro celular não pode ser atribuída ao conteúdo de microcistinas.