cariotípica de M�������� ��������
(Cichlidae, Perciformes)
Livia Silva dos SANTOS-PERES; Carlos Henrique SCHNEIDER; Maria Leandra TERENCIO; Eliana FELDBERG; Maria Claudia GROSS
Abstract
Th e wide distribution Amazon fi shes, like Mesounauta festivus, had to develop behavioral and molecular adaptative strategies to live in many kinds of water. Th e objective of the present study is understand the karyotype organization of M. festivus from two Amazon alopatric populations with diff erent physicochemical parameters waters, using cytogenetic markers (diploid number, constitutive heterochromatin distribution, number and localization of ribosomal DNA sites and nucleolar organizing regions). Six specimens (three males and three females) of M. festivus from Catalão Lake (AM) and six specimens (three males and three females) from Amazonas River (PA) were analyzed. All individuals had diploid number equal 48 chromosomes and RONs multiple, with 2 up 4 active sites. Th e ribosomal sites 5S gene were localized interstitially in the 8 and 24 chromosome pairs, and the DNAr18S sites were localized in the short arms of the 2, 17, and 18 chromosome pairs. Th e constitutive heterochromatin was distributed in the centromeric region in the most part of the complement chromosome. Some diff erences in the heterochromatin distribution pattern were observed between the individuals from diff erent populations, and only in the samples from Amazonas River were observed bitelomeric blocks in the 1, 9 and 16 pairs. Th is information leads to infer that physicochemical characteristics in the aquatic environment and geographic distance are correlated to diff erences found in the heterochromatin organization of studied populations of M.
Introdução
A bacia Amazônica é extensa (6.110.000 km²) e constituída por um complexo sistema de drenagem, sendo encontrados nesta região três tipos de águas com diferentes características físico-químicas que possibilitam a sua distinção. As águas brancas apresentam-se turvas, com baixa transparência, composição química rica em sais minerais, pH quase sempre próximo ao neutro (6,5 a 7) e condutividade alta. As águas pretas apresentam cor escura devido a grande concentração de ácidos húmicos e fúlvicos que se originam da decomposição incompleta da matéria orgânica das florestas que circundam os rios, pH ácido (entre 3,0 e 5,0), ausência de cálcio/magnésio e pobreza de sais minerais. As águas claras apresentam maior transparência, com pH variando entre 4,5 e 7,0 e condutividade relativamente baixa (SIOLI, 1984; FURCH, 1984; GOULDING et al., 2003).
Como os organismos aquáticos respondem diretamente às alterações na composição físico-química do meio, os peixes amazônicos desenvolveram um avançado conjunto de habilidades para viver nestes diferentes ambientes e estas estratégias adaptativas ocorrem desde o nível molecular até o nível comportamental (WOOTON, 1990; WILKELSKI e COOKE, 2006). Isso pode ter favorecido o surgimento da grande diversidade de espécies que a bacia Amazônica apresenta, muitas com potencial para criação em aquários, tais como as pertencentes ao gênero Mesonauta, que compreende seis espécies:
Mesonauta acora (sub-bacia do Tocantins e Xingu), Mesonauta egregius (bacia
do rio Orinoco), Mesonauta festivus (bacia do rio Paraná e Amazônica),
Mesonauta guyanae (sub-bacia do Rio Negro e Essequibo), Mesonauta insignis
(sub-bacia do rio Negro e Orinoco) e Mesonauta mirificus (bacia Amazônica, no Peru e Colômbia) (KULLANDER, 2003).
Dentre estas espécies de Mesonauta, M. festivus destaca-se por habitar diferentes tipos de águas amazônicas ao longo da extensa bacia Amazônica. Conhecida popularmente como acará-boari, bererê, mereê, mojarra e festivo, estes peixes pertencem à família Cichlidae, ordem Perciformes e tem como característica seu porte pequeno (8,2 cm a 20 cm), corpo comprimido lateralmente, cor amarelo esverdeada, uma mancha lateral escura que se inicia atrás dos olhos e se espalha de forma oblíqua até a nadadeira dorsal (KULLANDER, 2003). Por ser encontrada nos três tipos de águas amazônicas, apesar de não possuír hábitos migratórios, acredita-se que esta espécie apresenta plasticidade genética que possibilita o seu desenvolvimento em diferentes condições. Assim, análises citogenéticas clássicas e moleculares foram efetuadas para verificar se esta plasticidade se extende a nível
cromossômico e se a mesma pode estar relacionada a diferentes padrões de organização do genoma, evidenciando variações intraespecíficas, tais como diferentes padrões de distribuição de heterocromatina constitutiva e DNA ribossomal.
Material e Métodos
Foram analisados seis espécimens (três machos e três fêmeas) de M.
festivus provenientes do lago Catalão (3º09’57’’S, 59º54’44’’W - estado do
Amazonas) e seis (três machos e três fêmeas) do rio Amazonas (2°28’18,04”S, 54°35’26,56” O - estado do Pará), coletados com autorização do IBAMA (n.°. 10609-1/2007). O lago Catalão (localidade 1) situa-se na na confluência do rio Negro (água preta) e rio Solimões (água branca), sofrendo influência dos dois tipos de águas, e o rio Amazonas (localidade 2) foi amostrado nas proximidades de Santarém, no Pará, apresentando águas brancas (Figura 1).
Figura 1
Mapa de satélite da hidrografia amazônica evidenciando as localidades amostradas (setas) e em destaque Mesonauta festivus. Fonte do mapa: Landsat.
Os peixes foram anestesiados com óleo de cravo dissolvido em água e posteriormente sacrificados. Estes peixes foram numerados, registrados, fixados em formol 10% por 24h, lavados em água corrente e acondicionados em recipientes contendo álcool 70%. Para a obtenção das preparações cromossômicas foi extraído o órgão hematopoiético de todos
os indivíduos em estudo. As preparações cromossômicas foram obtidas a partir de células renais, usando colchicina in vitro (BERTOLLO et al., 1978, com modificações). Para a determinação da fórmula cariotípica e número de braços cromossômicos, as lâminas contendo as preparações cromossômicas foram coradas com Giemsa 5%. O padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva (banda C) foi obtido pela ação do hidróxido de bário (SUMNER, 1972) e a região organizadora de nucléolo (Ag-NORs) pela impregação com nitrato de prata (HOWELL e BLACK, 1980). Sempre que possível, as lâminas foram submetidas a análises sequenciais com Giemsa, banda C e impregnação com nitrato de prata de acordo com Centofante et al. (2002).
O DNA genômico foi isolado a partir de tecido muscular preservado em álcool 96% seguindo protocolo de extração fenol-clorofórmio (SAMBROOK e RUSSELL, 2001). Amplificação por Reação em Cadeira de Polimerase (PCR) dos genes ribossomais 18S e 5S foram conduzidas com os iniciadores 18Sf (5’-CCG CTT TGG TGA CTC TTG AT- 3’), 18Sr (5’-CCG AGGACC TCA CTA AAC CA-3’) (GROSS et al., 2010) e 5Sa (5’ -TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC), 5Sb (5’ -CAGGCT GGT ATG GCC GTA AGC- 3’) (KOMIYA e TAKEMURA, 1979), respectivamente. Estes produtos da PCR foram utilizados como sondas nas hibridizações fluorescentes in situ (FISH), que foram conduzidas seguindo protocolo de Pinkel et al. (1986). As sondas DNAs ribossomais 5S e 18S foram marcadas por Nick translation utilizando o Kit BioNickTM
Labeling System (Invitrogen) com biotina-14-dATP e digoxigenina-11-dUTP,
respectivamente. Os anticorpos anti-avidina biotina (Sigma-Aldrich) e anti- digoxigenina rodamina (Roche) foram usados para detecção e amplificação do sinal. Os cromossomos foram contracorados com DAPI (Vector).
As lâminas de citogenética clássica foram analisadas em microscopia ótica e 30 metáfases por indivíduo foram contadas para determinar o número diplóide. As melhores metáfases foram fotografadas em objetiva com aumento 100x. As lâminas submetidas à FISH foram analisadas e fotografadas em microscópio de fluorescência Olympus BX51. As imagens foram capturadas através do software Image-PRO MC 6.0. As melhores metáfases tiveram seus cromossomos medidos, emparelhados e organizados em ordem decrescente de tamanho, obedecendo a razão de braços proposta por Levan et al. (1964) e categorias sugeridas por Thompson (1979). A morfologia cromossômica foi determinada de acordo com os critérios de relação de braços (RB=BM/ Bm, onde BM = braço maior e Bm = braço menor). O número fundamental (NF) foi determinado de acordo com o número de braços cromossômicos, sendo considerado como portadores de dois braços os cromossomos meta- submetacêntricos e de um braço os subtelo-acrocêntricos.
Resultados
O número diplóide encontrado para Mesonauta festivus foi 48 cromossomos, sendo 12 m-sm + 36 st-a e número fundamental igual a 60 (Figura 2a) para os indivíduos de ambas as populações. Ainda, não foi observado nenhum sistema cromossômico de diferenciação de sexo. A heterocromatina constitutiva apresentou-se distribuída na região pericentromérica da maioria dos cromossomos. Contudo as marcações foram diferentes para os indivíduos provenientes das diferentes localidades, sendo que nos exemplares provenientes do lago Catalão os pares cromossômicos 1, 2, 8, 9 e 13 apresentaram blocos mais conspícuos na região centromérica se comparado com os demais pares do complemento. Ainda, no par 7 foi possível evidenciar que um dos homólogos apresenta um bloco heterocromático intersticial em todas as metáfases analisadas (Figura 2b). Já os indivíduos do rio Amazonas (PA) apresentaram blocos mais conspícuos que os do lago Catalão, sendo evidenciado além das marcações centroméricas, a invasão de heterocromatina constitutiva nos braços curtos de alguns cromossomos meta-submetacêntricos (pares 1, 2, 4 e 5), assim como na maioria dos subtelocêntricos. Além disso, os pares de cromossomos 1, 9 e 16 apresentam marcações na região terminal dos braços longos (Figura 2c). Com relação aos sítios ribossomais DNAr 18S e 5S, os indivíduos de ambas as localidades não apresentaram sintenia destes genes e tampouco variabilidade intraespecífica ou interpopulacional quanto à distribuição destas sequências nos cromossomos mitóticos. Foram evidenciados seis sítios do gene RNAr 18S, os quais apresentam-se localizados ao longo dos braços curtos de ambos os homólogos do par 2 e na posição subterminal dos braços curtos de ambos os homólogos dos pares 17 e 18. Os genes RNAr 5S foram evidenciados intersticialmente nos braços longos de ambos os homólogos dos pares 8 e 24 (Figura 2d). A análise das metáfases de M. festivus impregnadas por nitrato de prata revelou de 2 a 4 marcações, sendo esta variação intra e inter individual. Contudo, estas marcações estavam sempre relacionadas aos cromossomos dos pares 17 e 18, sempre em posição terminal nos braços curtos, caracterizando um sistema de RONs múltiplas (Figura 2e).
Figura 2
Cariótipos de Mesonauta festivus: (A) em coloração convencional; (B-C) evidenciando diferentes padrões de heterocromatina constitutiva em indivíduos provenientes do lago Catalão-AM (B) e rio Amazonas-PA (C); (D) Localização física cromossômica do DNAr 18S (pares 2, 17 e 18) e DNAr 5S (pares 8 e 24); (E) em destaque os pares nucleolares impregnados por nitrato de prata. m= Metacêntrico, sm= Submetacêntrico, st= Subtelocêntrico, a= Acrocêntrico. Barra: 10 micrômetros.
Discussão
A evolução cromossômica dos ciclídeos tem sido considerada mais conservada que divergente, onde 2n= 48 cromossomos do tipo subtelo- acrocêntrico representaria um caráter plesiomórfico para a família Cichlidae
(THOMPSON, 1979; KORNFIELD, 1984; FELDBERG e BERTOLLO, 1985), assim como sistema de RONs simples localizada nos maiores pares cromossômicos, heterocromatina constitutiva com marcações centroméricas (FELDBERG e BERTOLLO, 1985; FELDBERG et al., 2003) e localização separada dos sítios DNAr 45S e DNAr 5S, além de um único par de homólogos portador de cada gene ribossomal (MARTINS e GALETTI JR., 2001; MARTINS, 2007). Mesonauta festivus retém a característica basal do número diplóide, mas apresenta região organizadora de nucléolo múltipla, grandes blocos de heterocromatina que invadem braços curtos dos cromossomos e múltiplos sítios de DNAr 18S e DNAr 5S, o que faz com que não possa ser considerada citogeneticamente uma espécie basal. Este dado é congruente com as árvores filogenéticas propostas para os ciclídeos, com base em caracteres morfológicos ou moleculares (FARIAS et al., 1998; KULLANDER, 2003; SMITH et al., 2008). Estes dados reforçam a proposição de que o número fundamental, fórmula cariotípica e número de braços não são caracteres confiáveis na recuperação de relações filogenéticas entre táxons aparentados, sendo necessário analisar diferentes marcadores cromossômicos para obter uma história mais parcimoniosa do grupo (DOBIGNY et al., 2004; SCHNEIDER et al., 2012).
Além disso, muitas vezes estes marcadores cromossômicos podem re- velar diferenças populacionais, tais como as existentes para Mesonauta festi-
vus do Centro-Oeste e Norte do Brasil, onde os indivíduos provenientes do
Mato Grosso apresentam fórmula cariotípica com 14 m-sm + 34 st-a (PO- LETTO et al., 2010) e do Amazonas e Pará apresentam 12 m-sm + 36 st-a (presente trabalho). Ainda, o mapeamento cromossômico de genes ribosso- mais mostra diferenças significativas na composição cariotípica desta espé- cie se comparado com outros ciclídeos, uma vez que a maioria das espécies de ciclídeos apresenta o gene rRNA 5S alocado em um par de cromossomos, embora sua localização varie entre intersticial ou terminal (SCHNEIDER et al., 2012). Acredita-se que a localização intersticial de sítios de DNAr previ- na rearranjos que alterem sua posição e seu número (MARTINS e GALETTI JR., 1999), entretanto Mesonauta festivus apresenta dois pares com sítios intersticiais de rDNA 5S, evidenciando que esta localização não previne a dispersão destas sequências no genoma durante a evolução.
Apesar da maioria dos ciclídeos neotropicais apresentarem os genes ribossomais da família rDNA 45S alocados em um par de homólogos do tipo subtelo-acrocêntrico (POLETTO et al., 2010), M. festivus apresenta RONs múltiplas. Isso foi evidenciado tanto nos indivíduos provenientes do rio Araguaia (Mato Grosso, Brasil), que apresentam 5 cromossomos do tipo subtelo-acrocêntricos marcados pela sonda de DNAr 18S (POLETTO
et al., 2010), quanto nos indivíduos do lago Catalão (Amazonas, Brasil) e rio Amazonas (Pará, Brasil). Porém, nas populações amazônicas o segundo par cromossômico do complemento, que é portador de DNAr 18S, não foi impregnado por nitrato de prata em nenhuma metáfase analisada, indicando que estes sítios ribossomais não estavam ativos na intérfase anterior. Provavelmente esta inatividade deve-se ao fato de que esta região está relacionada à heterocromatina constitutiva (ver cromossomos do par 2, Figura 2b; Figura c), que pode estar silenciando o gene neste sítio, já que as atividades gênicas são dependentes do estado de condensação da cromatina, a qual pode mudar em resposta a sinais celulares, respondendo inclusive a mudanças ambientais (GREWAL e JIA, 2007).
Considerando que o remodelamento da cromatina e metilação do DNA auxiliam na compactação e organização do genoma, as variações na quantidade e na distribuição da heterocromatina constitutiva são características importantes na evolução de alguns grupos de peixes e tem permitido a diferenciação de espécies e de populações devido a mecanismos epigenéticos (ANDREATA et al., 2006; TRECO et al., 2008). A heterocromatina em peixes é rica em sequências repetitivas (para revisão ver MARTINS, 2007; FERREIRA e MARTINS, 2008) e desempenham um papel importante na especiação e grandes mudanças evolutivas (BOHNE et al., 2008). Desta forma, diferenças nos padrões de distribuição de heterocromatina encontradas em Mesonauta festivus das duas populações amazônicas provavelmente podem estar relacionadas à presença de sequências repetitivas diferenciais entre as populações ou à regulação da expressão gênica, em função das seguintes variáveis: 1) diferentes características físico- químicas das águas em que se encontram, o que favoreceria a sua adaptação a uma ampla gama de habitats; 2) distância geográfica, o que favoreceria que rearranjos organizacionais tenham se fixado nas populações alopátricas do Amazonas, Pará e Mato Grosso. Resultados similares foram evidenciados em outras espécies de ciclídeos amazônicos, tais como Pterophyllum scalare, onde indivíduos coletados no rio Jarí (PA) apresentaram diferentes padrões de distribuição de heterocromatina constitutiva, quando comparados aos coletados no estado do Amazonas (NASCIMENTO et al. 2006). Estes dados corroboram a proposição recente de que sequências repetitivas de DNA, neste caso evidenciado pela heterocromatina constitutiva, são promotoras de diversidade cariotípica existente entre os ciclídeos neotropicais (SCHNEIDER et al., 2012), provavelmente porque estão menos sujeitas à pressão seletiva (RIDLEY, 2006).
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