Marcadores da Reação de Maillard 1 Extração dos marcadores da RM

A extração dos marcadores da RM foi realizada de acordo com o procedimento descrito Ramirez-Jiménez (2000) com algumas modificações.

Para um tubo de centrífuga, pesaram-se 0,5 g de amostra (farinha ou pão), adicionaram-se 5 mL de água ultrapura, 200 µL da solução Carrez I (hexacianoferrato de potássio 15%, m/v) e 200 µL da solução Carrez II (acetato de zinco 30%, m/v). A extração foi promovida por agitação desta mistura, numa placa de agitação, durante cerca de 15 minutos. De seguida, a mistura foi centrifugada durante 10 minutos a 3000 rpm.

O sobrenadante foi transferido para outro tubo de centrífuga previamente tarado. Foram efetuadas mais duas extrações, sobre o resíduo sólido, com porções de 2 mL de água ultrapura utilizando o mesmo procedimento mas sem adição das soluções Carrez.

Os sobrenadantes obtidos foram misturados no mesmo tubo e, no final, o volume foi completado a 10 mL com água ultrapura. Este extrato aquoso foi agitado numa placa de agitação durante 2 minutos e, de seguida, centrifugada durante 10 minutos a 3000 rpm. De seguida, procedeu-se à sua filtração com filtro de Nylon 0,45 µm para vails de 2 mL, que foram armazenados a -18ºC até serem analisados por HPLC.

Todas as amostras foram preparadas em duplicado.

3.8.2 Determinação de HMF e FUR

Os teores de HMF e FUR nos extratos aquosos preparados a partir das amostras em estudo foram determinados por HPLC utilizando o método da reta de calibração. A reta de calibração foi construída com 6 padrões aquosos de HMF de concentração entre 0,1 mg/L e 5,0 mg/L. Estas soluções de calibração foram preparadas por diluição apropriada da solução de trabalho a 10 mg/L (ponto 3.3.1).

A coluna cromatográfica utilizada foi uma coluna ACE 5AQ (250 mm×4,6 mm), com um tamanho de partícula de 5 µm. A fase móvel era composta por água e acetonitrilo (95:5), com um fluxo de 1 mL/min. A deteção do HMF foi realizada por medição da absorvância no ultravioleta (UV) ao comprimento de onda de 284 nm e o volume de solução injetado foi de 50 µL.

O equipamento utilizado foi um cromatógrafo líquido (HPLC), marca Dionex, equipado com uma bomba modelo Ultimate 3000, com detetor de fotodíodos, modelo PDA-100, um auto-analisador, modelo WPS-3000TSL e um forno para a coluna, modelo TCC-3200.

50 A reta de calibração obtida está representada na Figura 3.8. O valor da concentração de HMF nas amostras foi reportado em mg de HMF/100g de amostra.

Figura 3.8 - Reta de calibração utilizada para determinar o teor de HMF nas amostras.

A reta de calibração obtida para o furfural está ilustrada na Figura 3.9 e foi construída com 5 padrões aquosos de furfural de concentração entre 0,05 mg/L e 1,0 mg/L. Estas soluções de calibração foram preparadas por diluição apropriada da solução de trabalho a 10 mg/L (ponto 3.3.2).

Figura 3.9 - Reta de calibração utilizada para determinar o teor de furfural nas amostras.

y = 7,6674x - 0,0645 R² = 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1 2 3 4 5 Ár ea dos pi cos (m AU/ m in) Concentração de HMF (mg/L) y = 7,2783x - 0,1522 R² = 0,9985 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Ár ea dos pi cos (c m ) Concentração de furfural (mg/L)

51 A tabela 3.1 apresenta um resumo de todos os parâmetros estudados para fazer a validação do método.

Tabela 3.1- Parâmetros de validação dos métodos.

Parâmetro de validação HMF Furfural

Equação da reta y = 7,6674x - 0,0645 y=7,2783-0,1522

R2 _{1 0,9985} Gama de trabalho 0,1 a 5 mg/L 0,05 a 1,0 mg/L L.D. 0,040 mg/L 0,012 mg/L L.Q. 0,1 mg/L 0,05 mg/L Precisão intermédia 5,3% 6,8% 3.8.3 Medição da absorvância a 420 e 280 nm

A formação de melanoidinas, os produtos finais da RM, pode ser avaliada pela medição da absorvância a 420 nm. A determinação das absorvâncias foi efetuada de acordo com o procedimento descrito por Michalska et al., (2008), com algumas modificações.

Para a medição do valor da absorvância a 420 nm foram utilizados os extratos aquosos obtidos no ponto 3.8.1 depois de filtrados com um filtro de Nylon 0,45 µm. As leituras das absorvâncias foram efetuadas num espectrofotómetro de feixe duplo, usando uma célula de quartzo de 1 cm de espessura. O espectrofotómetro UV-vis utilizado foi um espectrofotómetro de feixe duplo da marca PerkinElmer, modelo Lambda 25.

3.8.4 Determinação de compostos fluorescentes

A determinação dos compostos fluorescentes, marcadores das etapas iniciais da RM, foi efetuada com base no procedimento descrito por Morales e van Boekel (1997) com ligeiras modificações.

Esta determinação foi efetuada nos extratos aquosos após serem filtrados, com filtro de 0,45 µm de Nylon. Assim, do filtrado, pipetaram-se 0,5 mL para um tubo seco e completou-se, a peso, o volume a 8,00 mL com água ultrapura.

As intensidades de fluorescência das soluções preparadas foram medidas num espetrofluorímetro da marca Varian, modelo Cary Eclipse, usando uma célula de

52 quartzo. O comprimento de excitação utilizado foi de 347 nm e o de emissão de 415 nm, com uma largura de banda de 5 nm. O volume de solução usado para efetuar as leituras foi de 2,5 mL.

A quantificação dos compostos fluorescentes foi realizada através do método da reta de calibração. A reta de calibração foi traçada com 6 padrões de concentração de 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5 e 1,0 mg/L de sulfato de quinino.

Na Figura 3.9 apresenta-se a reta de calibração usando o sulfato de quinino como padrão para o cálculo dos compostos fluorescentes formados nas diferentes amostras de pão.

A sua análise visual assim como o coeficiente de correlação (R2_=0,9992)

indicam que se observa uma proporcionalidade direta entre a intensidade de fluorescência (IF) e a concentração do padrão usado.

Figura 3.10 - Reta de calibração usada para determinar o teor de compostos fluorescentes.

3.8.5 Medição da cor

Existem diversos métodos para análise da cor dos alimentos, porém os mais utilizados são a colorimetria e a espectrofotometria. A colorimetria é uma técnica instrumental que permite a determinação da cor de um alimento num curto espaço de tempo, recorrendo a instrumentos denominados colorímetros que medem valores que podem ser facilmente traduzidos em mudanças físicas. Nesta técnica, a amostra é atravessada por radiação com comprimento de onda entre 380-700 nm, sendo posteriormente medida a quantidade de radiação absorvida ou transmitida. Esta informação é tratada utilizando um software adequado que, através de uma série de cálculos, descreve as características cromáticas da amostra sob a forma de um sistema

y = 197,85x + 0,2491 R² = 0,9992 0 50 100 150 200 250 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 In te ns id ad e de flu ore scê ncia (% )

53 de coordenadas geométricas. Neste contexto, o sistema CIELAB é um sistema de caracterização da cor em que os resultados são expressados nas coordenadas L* que representa a luminosidade e varia entre 0 e 100 (preto e branco respetivamente), a* que indica uma tonalidade, que varia entre -60 e +60 (verde e vermelho, respetivamente) e b* que indica uma tonalidade, que varia entre -60 e +60 (azul e amarelo, respetivamente).

No caso do pão, este foi avaliado através de um colorímetro Minolta Chroma Meter CR 300 (Figura 3.11), sendo feitos 24 disparos no pão (seis superiores, seis inferiores, três em cada lateral e seis no miolo) e 12 disparos nas massas cruas (seis de cada lado do saco plástico).

Posteriormente foi feita a média e desvio-padrão das leituras e calculada a diferença de cor (∆E*) dos pães através da seguinte equação:

∆@ ∗ = √[(∆L ∗)2 + (∆E ∗)2 + (∆F ∗)2]

Onde, ∆L*, ∆a*, ∆b* representam a diferença nos valores de L*, a* e b*, respetivamente.

Figura 3.11 - Colorímetro utilizado na medição da cor das amostras de pão e das massas cruas.

3.9 Determinação da capacidade antioxidante