5.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinate da capa proteica do RSPaV usando o pacote de ferramentas EXPASY
O ExPASy (Expert Protein Analysis System, http://ca.expasy.org/) é um servidor de biologia molecular que possui “links” para o acesso a “sites” dedicados às análises de identificação e caracterização da proteína, predição de estrutura primária, secundária, topologia, etc. A sequência de aminoácidos foi traduzida a partir da sequencia de nucleotídeos obtidos pelo sequenciamento do cDNA e analisada in silico no através do pacote ExPASy.
Estrutura primária no programa ProtParam, que é uma ferramenta que permite a análise computacional de vários parâmetros físicos e químicos para uma dada proteína depositada no Swiss-Prot ou TrEMBL ou para uma sequência de aminoácidos enviada ao ProtParam. Disponível em http://expasy.org/tools/protparam.html.
Estrutura secundária foi analisada no programa PSIPRED, que é um método de predição de estrutura secundária baseado em rede neural e em análises obtidas de PSI-BLAST (Position Specific Iterated- BLAST) (McGUFFIN, BRYSON; JONES, 2000). A predição de estrutura secundária foi baseada na sequência primária de aminoácidos da proteína capsidial do RSPaV. Disponível em http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/.
5.2) Linhagem de bactéria utilizada para expressão
E. coli BL21-CodonPlus-RIL (Novagen), possui cópias extras de genes de tRNA de argU, ileY, leuW. Esses genes codificam tRNAs que reconhecem códons para arginina AGA e AGG,
isoleucina AUA e para leuceina CUA, respectivamente. Essa linhagem tem tRNAs que mais frequentemente restringem a tradução heteróloga de proteínas de organismos que possuem genomas ricos em AT, e permitem alto nível de expressão de proteínas que são fracamente expressas em linhagens convencionais de BL21.
5.3) Plasmídeo Utilizado
Foi utilizado o plasmídeo pET28a (Novagen) contendo o gene da proteína capsidial do RSPaV cedido pelo Prof. Dr. José Osmar Gaspar, previamente sequenciado proveniente de estudos anteriores.
5.4) Tranformação bacteriana
Plasmídeos recombinantes contendo as sequências de interesse foram transformados em linhagem BL21-RIL de E. coli competente. Utilizando-se 50 µL de células competentes e 1 µL de amostra de plasmídeo, essa mistura permaneceu no gelo durante 1 h e, então, foi submetida ao choque de temperatura a 42 ºC por 1 min e 2 min no gelo. Em seguida foram adicionados 250 µL de meio líquido SOC (meio SOB + 200 mM de glicose) e as bactérias foram submetidas à regeneração (1 h a 37 ºC com agitação a 250 rpm). Posteriormente, as bactérias foram plaqueadas em meio sólido seletivo (LB + kanamicina e cloranfenicol, 30 e 34 µg/mL rspectivamente). As colônias foram testadas por PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para cada uma das sequências das proteínas em questão, sendo que uma das colônias positivas foi utilizada para o pré-inóculo nos testes de expressão.
5.5) Testes de expressãoda proteína da capa proteica do RSPaV recombinante sob diferentes condições.
Inicialmente 5mL do pré inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 100 mL de meio líquido seletivo (LB + kanamicina e cloranfenicol, 30 e 34 µg/mL rspectivamente). A amostra foi mantida sob agitação e aeração até atingir a densidade (OD550nm ) entre 0,4 e 0,6 para
indução da expressão com IPTG. A leitura da amostrafoi feita em espectrofotômetro - Spectronic Genesys 2. A indução da expressão foi feita com IPTG em diferentes concentrações (0,1 mM; 0,2 mM; 0,3 mM e 0,4 mM) e sob diferentes temperaturas (17 °C, 25 °C,e 37 °C) a fim de obter proteínas na fração solúvel após a sonicação. Após 4 h e 16h de indução, amostras coletadas foram analisadas através de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) segundo Laemmli (1970).
Após a constatação da expressão nos testes iniciais, a expressão foi realizada em maior escala visando à obtenção de proteínas para purificação. Inicialmente 5 mL de pré-inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 250 mL de meio líquido seletivo (LB + kanamicina e cloranfenicol, 30 e 34 µg/mL rspectivamente). A cultura foi mantida sob as mesmas condições citadas acima. A purificação foi feita utilizando resina de níquel (ProBond) conforme instruções do fabricante (Invitrogen).
5.6) Análise em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
As amostras coletadas durante o teste de expressão foram analisadas através de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) segundo Laemmli (1970). As proteínas foram desnaturadas por fervura (3 minutos a 100 °C) em tampão de amostra (Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8, contendo SDS 4 %, glicerol 20 %, 2-ME 10 % e azul de bromofenol 1,0 mM). As amostras foram centrifugadas por 5 min a 16.000 x g e 10 L do sobrenadante de cada amostra aplicado no gel. A eletroforese foi feita em aparelho Hoefer mini VE Amersham Biosciences GE. Os géis foram fixados e corados em mistura contendo metanol, água, ácido
acético (50:50:10) e Comassie Blue 0,25 % por 1 h e descorados com metanol e água (1:1) por 1 h.
5.7) Western blot
Alíquotas contendo proteína recombinante foram misturadas com tampão de amostra (1:1) e aplicadas em gel SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose em um eletrotransferidor (Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad) operando sob voltagem constante (100V) por 1 hora.
O tampão de transferência utilizado foi o Tris-Glicina (Tris 0,025 M, Glicina 0,192 M) contendo metanol 20 %. A membrana foi incubada com antissoro monoclonal Anti-polihistidina (produzido em camundongo; Sigma) e antissoro anti-IgG de camundongo conjugado com fosfatase alcalina (Sigma) diluído 1:30.000 e a detecção da reação antígeno/anti-corpo foi feita com mistura de BCIP/NBT (“5-bromo-4chloro-3-indolyl-phosphate/nitro-blue tetrazolium”) até o aparecimento do resultado da reação (cor azul púrpura).
5.8) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 37°C
Após a expressão da proteína recombinante a 37 ºC utilizando 500 mL de meio LB induzidos com 0,5 mM de IPTG, a cultura foi centrifugada por 20 min a 8.000 x g a 10 °C. O “pellet” foi ressuspendido em 30 mL de tampão de lise (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20
mM β- mercaptoetanol, 1 % Triton X-100, 1 % Tween 20 pH 7,5). A solução foi submetida a pulsos de 15 s a 300 W em sonicador para lise celular. Esta amostra foi centrifugada por 30 min a 20.000 x g a 4 °C. O sobrenadante foi coletado e utilizado para a purificação da proteína de interesse sob condição nativa em coluna de afinidade utilizando resina de níquel (Ni Sepharose High Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare). O mesmo experimento também foi realizado utilizando tampão de lise (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β-
mercaptoetanol, 10 % Glicerol pH 7,5) a fim de obter maior quantidade de proteína na fração solúvel.
A fração insolúvel do experimento, o corpo de inclusão, foi lavado com o tampão de lise, deoxicolato de sódio 2 % e água. A cada lavagem, a amostra foi submetida a pulsos em sonicador e centrifugada a 10.000 x g por 20 min e, após a última centrifugação, a amostra foi então utilizada para a purificação da proteína de interesse sob condição desnaturante.
5.9) Purificação por cromatografia de afinidade (Ni-NTA)
5.9.1) Sob condições desnaturantes
A purificação do corpo de inclusão foi feita em condições desnaturantes, em coluna de afinidade utilizando resina de matriz de níquel conforme instruções do fabricante (GE Healthcare). Após a lavagem, o corpo de inclusão foi ressuspendido em tampão desnaturante (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris.HCl e 6 M guanidina pH 8,0).A suspensão foi sonicada e
centrifugada a 10.000 x g por 20 minutos. O sobrenadante foi filtrado e aplicado a coluna de afinidade. Após a ligação, a matriz foi lavada com tampões 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 6 M guanidina e pH, respectivamente, 6,3 e 5,9. A eluição da proteína foi feita em tampão 100 mM NaCl, 10 mM Tris, 6 M guanidina, pH 4,5.
5.9.2) Sob condições nativas
Primeiramente, a resina (Ni-NTA) foi equilibrada com o mesmo tampão utilizado para lisar as células. Logo em seguida, o sobrenadante do lisado celular foi passado através da coluna de purificação (coluna de gravidade, Bio-Rad) para que as proteínas (His-tag-RSPaV-CP) fossem adsorvidas. Após a adsorção, a resina foi lavada utilizando tampão de lavagem (20mM NaH2PO4,
500mM NaCl, 40 mM imidazol, 2 % glicerol e 1 mM PMFS, pH 7.4) para remover contaminantes adsorvidos inespecificamente na resína de níquel. Por fim, as proteínas foram eluídas utilizando tampão de eluição (20 mM fosfato de sódio dibásico, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol e 1 mM PMFS, pH 7.4).
As proteínas foram dialisadas após a eluição para a remoção do imidazol utilizando tampão (20 mM de fosfato de sódio dibásico, 300 mM de NaCl, pH 7.4). Foi realizada uma diálise gradual trocando o tampão de diálise e reduzindo de 100 em 100 mM de NaCl a cada duas horas até a concentração final de 100 mM de NaCl.
5.10) Expressão da proteína capsidial do RSPaVa 25 °C
O experimento referente ao item 4.8 foi repetido diminuindo a temperaturas de indução a fim de diminuir a formação de agregados e obter a proteína de interesse na fração solúvel após a etapa de sonicação. Sob as mesmas condições de aeração e agitação o experimento foi realizado utilizando temperaturas de 25 ºC para a expressão. Para indução da expressão foi utilizado IPTG na concentração de 0,3 mM por 16h. Em seguida, o meio foi centrifugado por 20 min a 8.000 x g e 4 °C. O precipitado foi dividido em três tubos e três diferentes tampões de lise foram utilizados para sonicar cada amostra a fim de obter a proteína na fração solúvel após centrifugaçãopor 30 minitos a 20.000 x g a 10 ºC.
Os tampões utilizados foram:
Tampão A: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 %
Triton X-100, 1 % Tween 20 pH 7,5)
Tampão B: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 %
Glicerol pH 7,5)
Tampão C: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0,2 %N-Lauril
O sobrenadante de cada tubo foi utilizado para purificação da proteína sob condição nativa utilizando resina à base níquel (Ni Sepharose High Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare).
5.11) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 17 ºC
O experimento referente ao item 5.8 foi repetido diminuindo as temperaturas de indução a fim de diminuir a formação de agregados e obter proteínas na fração solúvel após a etapa de sonicação. Sob as mesmas condições de aeração e agitação o experimento foi realizado utilizando a temperatura de 17 ºC para a expessão. Para indução da expressão foi utilizado IPTG na concentração de 0,3 mM por 16h. Em seguida, o meio foi centrifugado por 20 min a 8.000 x g e 4 °C. O precipitado foi dividido em três tubos e três diferentes tampões de lise foram utilizados para sonicar cada tubo a fim de obter a proteína na fração solúvel após centrifugação por 30 minitos a 20.000 g a 10 ºC.
Os tampões utilizados foram:
Tampão A: (10 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 % Triton
X-100, 1 % Tween 20 pH 7,5)
Tampão B: (10 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 %
Glicerol pH 7,5)
Tampão C: (10 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0,2 %N-Lauril
Sarcosina pH 7,5)
O sobrenadante de cada tubo foi utilizado para purificação da proteína sob condição nativa utilizando resina de níquel (Ni Sepharose High Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare).
5.12) Teste de expressão em meio auto-indutivo
Inicialmente 5 mL de pré inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 250 mL de meio auto-indutivo (ZYM-5052), que consiste de meio LB + canamicina e cloranfenicol 34g/mL + meio M (Na2HPO4 25 mM, KH2PO4 25 mM, NH4Cl 50 mM, Na2SO4 5 mM, MgSO4
2mM) + meio 5052 (0,5 % glicerol, 0,05 % glicose, 0,2 %α-lactose), contendo 50 µg/mL, de acordo com Studier, 2005. O tubo foi mantido sob agitação e aeração a 18 °C por 48 horas. Em seguida, o meio foi centrifugado por 30 min a 6.000 x g e 4°C. O “pellet” foi ressuspendido em 20 mL de tampão de lise (50 mM tampão fosfato, 200 mM NaCl, 1 mM PMSF, pH 8). A solução foi submetida a pulsos de 15 s a 300 W em sonicador para lise celular. Esta amostra foi centrifugada por 30 min a 20.000 x g a 10 °C. A fase aquosa foi coletada e utilizada para a purificação da proteína de interesse.
A purificação foi feita utilizando resina à base de níquel (Ni Sepharose High Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare).
5.13) Expressão utilizando estresse osmótico e choque térmico
Inicialmente 5 mL de pré-inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 250 mL de meio líquido seletivo (LB + canamicina e cloranfenicol 30 e 34g/mL respectivamente), contendo 0,5M NaCl e 1 mM betaína. O tubo foi mantido sob agitação e aeração a 37 °C até atingir a densidade ótica ideal. Para o choque térmico, o tubo foi submetido à temperatura de 47
oC por 20 minutos (contados a partir do momento em que o meio de cultura atingiu esta
temperatura). Posteriormente, a cultura foi transferida para outro shaker, a 18 oC, e a indução da
expressão foi feita com 0,4 mM IPTG “overnight”. Em seguida, o meio foi centrifugado por 30 min a 6.000 x g e 4 °C. O “pellet” foi ressuspendido em 20 ml de tampão de lise (50 mM tampão fosfato, 200 mM NaCl, 1 mM PMSF, pH 8). A solução foi submetida a pulsos de 15 s a 300 W em sonicador para lise celular. Esta amostra foi centrifugada por 30 min a 20.000 g a 10 °C. A
fase aquosa foi coletada e utilizada para a purificação da proteína de interesse utilizando resina de níquel (Ni Sepharose High Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare).
5.14) Expressão a 13 ºC utilizando cepas de Arctic Express
O vetor recombinante também foi utilizado para a transformação por choque térmico de células competentes da cepa ArcticExpress. As células foram incubadas a temperatura de 30 °C, 200 rpm por 16 horas. Foram transferidos 5 mL do pré-inóculo para o erlenmeyer contendo 250mL de meio LB com 30g/mL de kanamicina 30°C, 250 rpm até atingir a densidade ótica ideal. Após baixar a temperatura para 13 ºC a indução foi feita com IPTG 0,5 mM e a cultura foi mantida sob mesma agitação e temperatura por 16h. O “pellet” foi ressuspendido em 20 ml de tampão de lise (50 mM tampão fosfato, 200 mM NaCl, 1 mM PMSF, pH 8). A solução foi submetida a pulsos de 15 s a 300 W em sonicador para lise celular. Esta amostra foi centrifugada por 30 min a 20.000 g a 10 °C. A fase aquosa foi coletada e utilizada para a purificação da proteína de interesse. A purificação foi feita em coluna de afinidade utilizando resina de níquel (Ni Sepharose High Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare).
5.15) Purificação e reenovelamento da proteína recombinante expressa a 37 ºC
A fração insolúvel obtida a partir do experimento citado no item 4.8, o corpo de inclusão, foi lavado com o tampão de lise, deoxicolato de sódio 2% e água. A cada lavagem, a amostra foi submetida a pulsos em sonicador e centrifugada a 10.000 x g por 20 min e, após a última centrifugação, a amostra foi então utilizada para a purificação da proteína de interesse sob condição desnaturante conforme o item 4.9.1. Após a confirmação da presença da proteína em gel de poliacrilamida SDS-PAGE iniciaram-se os ensaios de reenovelamento utilizando protocolos de diluição simples e de gradiente decrescente de uréia em resina de afinidade contendo níquel.
5.16) Refolding
Diferentes métodos de renovelamento foram utilizados, basicamente foram utilizados protocolos de diluição simples em tampão de renovelamento, no qual a solução com guanidina 6M contendo proteína de interesse (1 mg/mL) é diluída até a concentração 10–100 µg/ml. O renovelamento também foi testado utilizando gradiente decrescente de uréia em resina de afinidade contendo níquel. Neste método a resina é carregada com a proteína em tampão contendo 8M uréia, e através de um gradiente, a solução final torna-se livre de uréia. Nos dois casos a proteína renaturada foi purificada em condições nativas utilizando-se resina de níquel conforme protocolo do fabricante (Qiagen) e sua concentração foi determinada. Baseando-se no ponto isoelétrico teórico (9.04) Vários tampões de renovelamento foram testados, entre eles:
Tampão R1:50 mMTris-HClpH 7,5 contendo 200 m M NaCl, 1 mM DTT e 500 mM l- arginina.
Tampão R2: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM Glutationa Reduzida, 1 mMEDTA, 500 mM l-arginina, 20 % glicerol.
Tampão R3:50 mMTris-HClpH 7,5 contendo 200 mM NaCl, 1 mM DTT e 1 M NDSB201 [3(1-pyridinio)-1-propane sulfonate].
Tampão R4: 30 mM NaH2PO4 pH 7.5, 200 mM NaCl e 20% glicerol.
Tampão R5: 30mM Citrato de Sódio pH 6.2, 200mM NaCl, 1mM DTT.
Tampão R6: 30mM Citrato de SódiopH 6.2, 200mM NaCl, 500 mM l-arginina.
Tampão R7: 30mM Citrato de Sódio, 200mM NaCl, 1 M NDSB201 [3(1-pyridinio)-1- propane sulfonate], pH 6.2
Tampão R8: 30 mM acetato de sódio pH 5.5,30 mMNaCl e 1% glicerol.
Após verificar o tampão mais eficiente a proteína foi dialisada contra tampão fosfato de sódio pH 6.4 contendo 0,2 M NaCl, concentrada até 2 mg/mL por centrifugação utilizando-se colunas Centricon-30 (Millipore), e utilizada para os ensaios de Dicroísmo Circular.
5.17) Concentração das amostras purificadas
Após a diálise as amostras contendo a proteína purificada foram concentradas em dispositivos de ultrafiltração AMICON (3.000 Da) conforme instruções do fabricante (Millipore) a uma rotação de 4.000 x g a 10 °C.
5.18) Determinação da concentração das proteínas
A quantificação das proteínas foi feita através de medidas de absorbância. Os espectros de absorbância foram obtidos em espectrofotômetro – Espectronic Genesys 2, com varredura de comprimento de onda de 340-200 nm. A concentração foi determinada a partir dos valores dos coeficientes de extinção molar (ε) obtidos através do programa ProtParam (http://ca.expasy.org) e dos valores de absorbância a 280 nm. A quantificação também foi feita através de leitura em equipamento Quant-iTTM Assays, conforme instruções do fabricante (Invitrogen).
5.19) Dicroísmo Circular
O Dicroísmo circular (CD) foi obtido à temperatura ambiente no espectro polarímetro Jasco710 para estimar a estrutura secundária e a qualidade da proteína. Os espectros de CD foram medidos em um concentração de proteínas de aproximadamente 2 mg/ml em 20 mM de fosfato de sódio, 100 mM de NaCl, pH6.4, usando uma cubeta com caminho ótico de um milímetro de comprimento. Cada espectro representa uma média de 5 acumulações coletadas de 190 a 260nm, com um passo de tamanho de 0,2 nm, a uma taxa de 20 nm/ min, e largura de banda de 1,0 nm. O tempo de resposta foi de 0,5s. A linha de base foi corrigida subtraindo-se o espectro do tampão de diálise, pois possui condições idênticas à amostra. Os resultados foram convertidos para
unidade de absorção molar per-resíduo, [θ] (Deg cm2 dg-1), e a estrutura secundária foi analisada
com o software CDPro. SELCON3, CDSSTR e CONTINL produziram resultados similares.
5.20) Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)
O espalhamento dinâmico de luz é uma técnica capaz de analisar biomoléulas em solução. Na prática as biomoléculas encontram-se hidratadas e o raio calculado a partir do coeficiente de difusão oferece uma estimativa do tamanho aparente da partícula com sua camada de solvatação, denominado assim raio hidrodinâmico, RH, a patir do qual também é possível estimar sua massa
molecular. O princípio da técnica se baseia na incidência de luz monocromática em solução de partículas e monitoramento das flutuações da intensidade. Para cada proteína foram testadas 125 condições (Tabela 1) variando concentração proteica, valores de pH, concentração salina e concentração de aditivos a fim de obter informação sobre a polidispersividade e a presença de agregados nas amostras das proteínas que forampreviamente centrifugadas por 60 minutos a 16000 x g a 4°C. Em todas as análises foram realizadas 20 aquisições de 20 segundos a 20°C. Somente as frações consideradas monomodais (1 população) foram utilizadas nos ensaios de cristalização, pois há relatos na literatura mostrando que amostras monodispersas têm maior chance de cristalização.
Agentes que podem alterar solubilidade e estado de agregação de proteínas CONCENTRAÇÃO SAIS NaCl 0 – 1M KCl 0 – 1M NaF 0 – 500 mM NaCl + KCl 0 – 500 mM CaCl2 0 – 200 mM MgCl2 0 – 200 mM MgSO4 0 – 400 mM Uréia 0 – 500 mM AMINOÁCIDOS Glicina 0,5 – 2 % L-Arginina 0 – 0,5 M
MATERIAL GENÉTICO Solução de Primers 0,1 – 100 μM
Nucleotídeos (dNTPs) 0 –0,5 mM AÇÚCARES E ÁLCOOIS β-Ciclodextrina 0 – 100 mM Sucrose 0 – 1 M Glucose 0 – 1 M Sorbitol 0 – 40 % Glicerol 5 – 40 % Etanol 0-5% DETERGENTES Triton X-100 0 – 0,02% Tween 20 0 – 0,1% CHAPS 0 – 0,5% NP-40 0 – 0,2% AGENTES REDUTORES DTT 0 – 20 mM β-Mercaptoetanol 0 – 10 mM
TENSOATIVO NÃO- Sulfobetaina(NDSB 195) 0 – 500 mM
5.21) Ensaios de cristalização
Os “screenings” iniciais das condições de cristalização foramrealizados pelo método de difusão de vapor por gota sentada utilizando o robô Honeybee 961 (Genomic Solutions Ltd). A temperatura de incubação foi 20 C.
Os kits utilizados foram JSCG+ (Qiagen), Pact Suite 2 (Qiagen), Morpheus (Molecular Dimensions) e para cada uma das 96 condições de cada Kit foram aplicadas solução de proteínas concentradas e soluções de precipitante na proporção 1:1 e 1,5: 1, totalizando 192 condições por Kit. Para cada Kit foram utilizadas proteínas concentradas nas seguintes condições:
a)CP a 5mg/mL em tampão Tris 10 mM 300 mM NaCl pH 7,0. b) CP a 5mg/mL em tampão Tris 10 mM 150 mM NaF pH 7,0. Totalizando 1152 condições
As melhores condições encontradas foram utilizadas como referência para o refinamento do crescimento dos cristais fazendo pequenas alterações no pH, concentração da proteína, concentração de sal e concentração do precipitante. Em algumas condições foram encontrados pequenos cristais (menores que 100 micrômetros), os quais foram recolhidos e utilizados em experimentos de Streak seeding e microseeding.
5.21.1) Microseeding e Streak seeding
O método seeding consiste na preparação de uma solução estoque (seed stock) que contém cristais macerados e estas “sementes” são transferidas para soluções contendo tampão, concentração de proteína e concentração de precipitante desejado. Para preparação da solução estoque (seed stock), que contém os núcleos dos cristais, foram utlizados tubos de 1,5 mL
contendo esfera de vidro que sob vigorosa agitação permitiu a maceração dosmicro cristais. A solução estoque foi também utilizada para fazer diluições.
Para a técnica de streack seeding, uma haste é utilizada para transferir as “sementes” da solução estoque escolhida para gotas contendo diferentes concentrações de proteína e diferentes concentrações do agente precipitante. Esta haste percorreu unidirecionalmente através de cada gota.
5.21.2) Counter-diffusion:
Algumas condições foram testadasutilizandoo kit Granada Crystallization Box ®, que permite a cristalização de proteínas no interior de capilares, que são primeiramente preenchidos com a solução contendo proteína concentrada, e posteriormente mergulhados em tampão escolhido contendo agente precipitante como mostrado na figura 6. Os capilares foram estocados a 5, 10, 15, 20 e 25 ºC.
Figura 6. (1) Capilar. (2) Solução contendo agente precipitante. (3) camada de agarose. As condições de
otimização do crescimento dos cristais foram também testadas utilizando o método de difusão de vapor de gota pendente (hanging drop) e microbatch.
5.21.3) Hanging drop
Consiste em uma gota contendo a macromolécula biológica a ser cristalizada em tampão com o agente de cristalização. A gota é equilibrada contra um reservatório contendo a solução do agente de cristalização em uma concentração mais alta que na gota, como exemplificado na figura 7 abaixo.
Figura 7. Método hanging drop: (A) gota contendo solução proteica misturada com tampão contendo
agente precipitante. (B) Lâmínula siliconizada. (C) Silicone utilizado como material de vedação. (D) Solução contendo o agente de cristalização.