Utilizando a linhagem E. coli linhagem BL21(DE3)-RIL transformada com pET28a contendo a sequência codificadora da ORF1 do SBMV, proteína do movimento recombinante expressa foi purificada em coluna contendo resina à base de níquel (Figura 72).
Figura 72. Gel de poliacrilamida 12% mostrando a expressão da proteína de aproximadamente 22 kDa
(MP-His). (M) Marcador para proteínas, Bench Mark Protein Ladder (Invitrogen); (A) Amostra-controle contendo pET28a sem inserto. (B) 1 h de indução de amostra contendo pET28a recombinante, (C) MP-His purificada (17 kDa referente à MP + 5 kDA referente à cauda de histidina).
12.2) Dicroísmo circular após reenovelamento
Após expressão, purificação e reenovelamento, a proteína do movimento recombinante foi concetrada a 5 mg/mL e usada em experimentos de dicroísmo circular. Utilizando tampão 10 mM fosfato de sódio e 50 mM NaF, foi possível avaliar as porcentagens de estruturas secundárias.
Figura 73. Espectro do dicroísmo circular da MP reenovelada. 25 % Alfa hélice., 39 % Folha beta,18 %
Turns,18 % Desordenado.
12.3) Avaliação da interação entre MP do SBMV reenovelada e outras proteínas virais
Através de western blot foi possível propor que a MP do SBMV pode interagir com serino protease e proteína capsidial do SBMV. A membrana de nitrocelulose contendo as proteínas VPg, Serino protease, proteína capsidial, LAAO e BSA, foi incubada com MP reenovelada, a qual foi imobilizada nas regiões da membrana contendo serino protease e contendo a proteína capsidial. Diversas lavagens contendo tween 20 não desligaram a proteína que foi detectada utilizando anticorpo policlonal específico para a MP. Pode-se propor ainda, que a região transmembrânica da serino protease não é essencial para esta interação. Já a VPg, mesmo em altas concentrações, não mostrou interação através de western blot, no entanto mostrou interação quando aplicada diretamente na membrana de nitrocelulose e avaliada através de dot blot. As proteínas LAAO e BSA foram utilizadas como controle, mostrando que mesmo 20 vezes mais concentradas, não interagemcom a MP assim como não reage com anticorpos policlonais contra a MP.
Figura 74. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot.LA: LAAO, BSA albumina
de soro bovino. MP proteína do movimento recombinante. Se: serino protease sem a regiao transmembranica. CP: proteína capsidial obtida através da aplicação direta de vírus SBMV purificado no gel de poliacrilamida. VPg proteína VPg do SBMV purificada. M marcador de massa molecular pré corado.
12.4) Dot blot utilizando proteínas que não interagiram com a MP
As proteínas aplicadas no gel e transferidas para membrana de nitrocelulose, que não interagiram com a MP (VPg, LAAO e BSA), foram aplicadas diretamente na membrana em experimento de dot blot. A membrana foi submetida às mesmas condições do experimento de western blot supracitado.
Figura 75. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de dot blot. MP: proteína do movimento
recombinante. VPgH6 proteína VPg do SBMV contendo cauda de histidina; VPg proteína VPg do SBMV após remoção da cauda de histidina; LAAOL-amino-acid oxidase de Bothrops ; BSA albumina de soro bovino.
12.5) Amplificação usando primers com sítio para TEV protease
A partir de plasmídios contendo as sequências codificadoras da MP, usados como template, foram feitas reações de PCR visando a inserção do sítio da TEV protease e posterior clonagem nos plasmídio pET28a e pMAL-c2x.
12.6) Amplificação dos gene da MP utilizando primes com sítio para TEV protease
O produto da reação de PCR, amplificado com os oligonucleotídeo senso contendo os sítios da Bam HI e da TEV protease, foi analisado em gel nativo de agarose 1%, apresentando única bandade aproximadamente 500 pb correspondente ao fragmento de tamanho esperado para o possível gene codificador daproteína do movimento (Figura 76). O fragmento amplificado foi purificado e ligado aos vetores pET28a e pMAL-c2x (Figura 77).
Figura 76. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando o fragmento de 500 pares de bases amplificado por
PCR. C+: reação controle utilizando como template o pET28a contendo sequência codificadora da MP onde o primer foward não tem sítio para TEV protease. A: reação utilizando como template o pET28a contendo sequência codificadora da MP onde o primer forward tem sítio para TEV proteaseM: Marcador molecular DNA Ladder 100bp (Invitrogen); C-: Reação controle onde o template é o pET28a sem inserto.
É evidente a maior intensidade da banda referente ao controle C+, uma vez que o oligonucleotídeo senso possui elevado número de bases (48 bases), dificultando assim o anelamento ao template, mesmo em temperaturae concentração salina ideal.
Figura 77. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando digestão enzimática dosvetores recombinates pET28a
e pMAL-c2x. (M): Marcador molecular DNA Ladder 100 pb (Invitrogen); (3): Fragmento referente ao DNA plasmidial pMAL-c2x na parte superior do gel e fragmento liberado de aproximadamente 500 pb referente ao gene da MP; (4): Fragmento referente ao DNA plasmidial pET28a na parte superior do gel e fragmento liberado de aproximadamente 500 pb referente ao gene da MP.
12.7) Sequenciamento e alinhamento MP
O gene da proteína do movimento do SBMV foi sequenciado utilizando os mesmos primers usados na clonagem. O sequênciamento nos dois sentidos de leitura permitiu um alinhamento que confirmou a presença do sítio da TEV protease como mostrado na figura 78.
Figura 78. Alinhamento das sequências referentes ao gene da proteína do movimento (MP) do SBMV. A
seta verde no topo da figura indica a sequência de nucleotídeos referentes ao sítio da TEV protease.
13) CONCLUSÕES
1- Na primeira etapa deste projeto, foi possível testar diferentes construções dos vetores de expressão e selecionar os mais adequados aos ensaios de purificação, baseando-se na solubilidade, estabilidade e monodispersividade das soluções proteicas.
2- Os protocolos estabelecidos neste projeto de pesquisa permitem a expressão e obtenção de grandes quantidades de proteína recombinante com alto grau de pureza.
3- Os resultados obtidos através de dicroísmo circular mostram que as proteínas estão estruturadas e adequadas para realização de experimentos de interação com possíveis ligantes e ensaios de cristalização.
4- Os resultados obtidos através de DLS mostram que em determinadas concentrações proteicas, condições salinas e de pH, é possível obter amostras monomodais mesmo não obtendo a proteína na forma monomérica.
5- Os resultados desta tese lançam as bases para futuros testes de cristalização e posterior resolução das estruturas tridimensionais.
14) EXPERIMENTOS REALIZADOS PARALELAMENTE AOS EXPERIMENTOS