RICARDO BARROS MARIUTTI
Expressão, purificação e caracterização de proteínas dos fitovírus
SBMV e RSPaV
São José do Rio Preto
RICARDO BARROS MARIUTTI
Expressão, purificação e caracterização de proteínas dos fitovírus
SBMV e RSPaV
Tese apresentada para obtençãodo título de Doutor em Microbiologia,área de Bioquímica e Biologia Molecular de Microrganismos, junto aoPrograma de Pós-graduação emMicrobiologia do Instituto deBiociências, Letras e Ciências Exatasda
Universidade Estadual Paulista“Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus deSão José do Rio Preto.
Orientador: Prof. Dr. Raghuvir Krishnaswamy Arni
São José do Rio Preto
RICARDO BARROS MARIUTTI
Expressão, purificação e caracterização de proteínas dos fitovírus
SBMV e RSPaV
Tese apresentada para obtençãodo título de Doutor em Microbiologia,área de Bioquímica e Biologia Molecular de Microrganismos, junto aoPrograma de Pós-graduação emMicrobiologia do Instituto deBiociências, Letras e Ciências Exatasda Universidade Estadual Paulista“Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus deSão José do Rio Preto.
Comissão Examinadora
Prof. Dr. Raghuvir Krishnaswamy Arni UNESP-São José do Rio Preto
Orientador
Prof. Dr. Anwar Ullah
UNESP-São José do Rio Preto
Profa. Dr. Fátima Pereira de Souza UNESP-São José do Rio Preto
Profa. Dra. Priscila Belintani
Centro Universitário do Norte Paulista- UNORP
Prof. Dr. Patrick Jack Spencer IPEN/CNEN, do BUTANTAN
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Dr. R. K. Arni, que nunca poupou esforços para me ajudar durante esses anos de pesquisa, sempre me motivou e acreditou no meu potencial, mais do que eu mesmo acreditei. Sempre serei grato pela orientação impecável que recebi, nenhum livro poderia me ensinar tudo que ele me ensinou sobre proteínas.
A minha namorada, pelo incentivo, companheirismo e pela compreensão da minha escolha em fazer do laboratório a minha casa. Ela me faz sentir uma pessoa de sorte.
“Diante da vastidão do tempo e da imensidão do universo, é um imenso prazer para mim, dividir um planeta e uma época com a Luana”.
Aos meus pais que são as pessoas mais importantes da minha vida.
Ao Dr. Vinícius pela amizade de muitos anos, ensinamentos e paciência.
Ao Dr. Anwar pela disposição em me ajudar nos experimentos, tanto tarde da noite como nos feriados.
Aos meus amigos do laboratório, Rehana, Eliana, Hévila, Carol Wilson.
Ao professor Dr. Betzel que me recebeu em seu laboratório com total atenção.
A toda banca examinadora pela disposição, em especial à Dra. Priscila, que durante minha iniciação científica me ensinou conceitos que uso diariamente em meus experimentos.
Ao Dr. Osmar que me orientou no mestrado.
À FAPESP pelo apoio financeiro
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS 8
RESUMO 14
1) INTRODUÇÃO 16
1.1) Os Vírus 16 1.1.2) Vírus vegetais ... 16
1.2) A videira 17 1.2.1) Viroses da videira ... 18
1.3) O Feijão 22 1.4) Sobemovirus 23
1.4.1) Organização do genoma ... 23
1.5) Produtos gênicos e suas possíveis funções 24 1.5.1) ORF1 ... 25
1.5.1.1) Proteína do Movimento 26
1.5.2 ) ORF 2 ... 29
1.5.2.1) VPg 29
1.5.2.2) Serino protease 30
2) REPLICAÇÃO VIRAL 33
3) EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EM BACTÉRIA 33
4) JUSTIFICATIVA 35
5) MATERIAIS E MÉTODOS 36
5.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinate da capa proteica do RSPaV
usando o pacote de ferramentas EXPASY 36
5.2) Linhagem de bactéria utilizada para expressão 36
5.3) Plasmídeo Utilizado 37
5.4) Tranformação bacteriana 37
5.5) Testes de expressão da proteína da capa proteica do RSPaV recombinante sob diferentes
condições. 38
5.6 ) Análise em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 38
5.7 ) Western blot 39
5.8) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 37 °C 39
5.9) Purificação por cromatografia de afinidade (Ni-NTA) 40 5.9.1) Sob condições desnaturantes ... 40 5.9.2) Sob condições nativas... 40
5.10 ) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 25 °C 41
5.11 ) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 17 ºC 42
5.12) Teste de expressão em meio auto-indutivo 43
5.13) Expressão utilizando estresse osmótico e choque térmico 43 5.14) Expressão a 13 ºC utilizando cepas de Arctic Express 44 5.15) Purificação e reenovelamento da proteína recombinante expressa a 37 ºC 44
5.16) Refolding 45
5.17) Concentração das amostras purificadas 46
5.18) Determinação da concentração das proteínas 46
5.20) Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS) 47
5.21) Ensaios de cristalização 49
5.21.1) Microseeding e Streak seeding ... 49
5.21.2) Counter-diffusion ... 50
5.21.3) Hanging drop ... 51
5.21.4) Microbacth ... 51
5.22) Inserção de sítio de clivagem nos plasmídeos recombinantes 52 5.22.1) Construção de oligonucleotídeos com adição de sítio de clivagem. ... 53
5.22.2) Amplificação dos genes das proteínas utilizando primers com sítio para TEV protease 54 5.23) Clonagem do vetor com sítio para TEV protease em vetor pET28a. 54 5.23.1) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pET28a ... 56
5.23.2) Ligação do DNA em vetor de expressão (pET28a) ... 56
5.23.3) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão (pMAL) ... 56
5.24) Transformação em célula competente (TOP 10) 57 5.25) Purificação do plasmídeo recombinante 57 5.26). Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5) 58 5.27) Sequenciamento dos vetores contendo as sequências dos genes CP do RSPaV, após inserção do sítio de clivagem para TEV protease 58 5.28) Expressão e Purificação da Proteína Capisidial com Sítio de Clivagem para Tev Protease 58 5.28.1) Expressão da CP utilizando pET28a ... 58
5.28.2) Purificação da CP utilizando pET28a ... 59
5.29) Digestão Enzimática utilizando TEV Protease. 59 5.30) Expressão e Purificação da CP utilizando pMAL 59 5.30.1) Expressão da CP recombinante utilizando pMAL... 60
5.30.2) Purificação da CP recombinante utilizando pMAL através de resina à base de amilose 60 5.31) Purificação da proteína digerida utilizando TEV protease 60 5.32) Ensaios de cristalização após digestão utilizando TEV protease. 61 6) VIRAL PROTEIN GENOME-LINKED (VPg) 61 6.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína VPg recombinate do SBMV usando o pacote de ferramentas expasy 61 6.2) Testes de expressão da VPg 61 6.3) Purificação da proteína VPg e Espalhamento Dinâmico de Luz 61 6.4). Ensaios de cristalização VPg 62 6.5) Inserção do sítio de clivagem para TEV protease 62 6.5.1) Amplificação dos genes das proteínas VPg utilizando primers com sítio para TEV protease ... 63
6.5.2)Purificação das partículas virais ... 63
6.5.3) Obtenção de RNA viral ... 64
6.5.4) Produção de cDNA ... 64
6.6) Clonagem do vetor com sítio para TEV protease em vetor pET28a 65 6.6.1) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pET28a ... 65
6.6.2) Ligação do DNA em vetor de expressão pET28a ... 65
6.6.3) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pMAL ... 65
6.6.4) Ligação do DNA em vetor de expressão pMAL ... 65
6.7) Transformação em célula competente (TOP 10) 65
6.8) Purificação do plasmídeo recombinante 66
6.10) Sequenciamento dos vetores contendo a sequência codificadora da VPg do SBMV após
inserção do sítio de clivagem para TEV protease 66
6.11) Expressão e purificação da VPg clonada em pMAL-c2x 66 6.11.1) Expressão da proteína VPg recombinante utilizando pMAL-c2x ... 66 6.11.2) Purificação da VPg clonada em pMAL-c2x ... 67
6.12) Digestão enzimática utilizando TEV protease 67
6.13) Purificação da proteína após digestão pela TEV protease 67 6.14) Expressão e purificação da proteína VPg clonada em pET28a 67 6.14.1) Expressão da VPg clonada em pET28a ... 67 6.14.2) Purificação da VPg clonada em pET28a ... 68 6.15) Efeito do TFE e dATP no raio hidrodinâmico das amostras proteicas 68 6.16) Verificação do efeito do TFE na estrutura secundária da VPg através de dicroísmo
circular 69
6.17) Ligação da sonda de sulfonato de naftaleno-1-8-anilina (ANS) 69 6.18) Análise da interação entre VPg e possíveis ligantes 70
7) SERINO PROTEASE DOSBMV 70
7.1) Amplificação da sequência codificadora da serino protease do SBMV para posterior
clonagem em pET28a 70
7.2) Clonagem da sequencia codificadora da Serino protease com sítio para TEV protease em
vetor pET28a 71
7.2.1) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pET28a ... 71 7.2.2) Ligação do DNA em vetor de expressão pET28a ... 71
7.3) Transformação em célula competente (TOP 10) 71
7.4) Purificação do plasmídeo recombinante 71
7.5). Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5) 72
7.6) Sequenciamento dos vetores contendo a sequência codificadora da Serino protease do SBMV após inserção do sítio de clivagem para TEV protease 72 7.7) Expressão e purificação da Serino protease do SBMV utilizando pET28a 72 7.7.1) Expressão da Serino protease utilizando pET28a ... 72 7.8) Amplificação da sequencia codificadora da serino protease do SBMV utilizando primer
Serine_NoTransmembrane 73
7.9) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pET28a 73
7.10) Ligação do DNA em vetor de expressão pET28a 73
7.11) Transformação em célula competente (TOP 10) 73
7.12) Purificação do plasmídeo recombinante 74
7.13) Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5) 74
7.14) Testes de expressão e purificação 74
8. PROTEÍNA DO MOVIMENTO DO SBMV 74
8.1) Expressão e purificação sob condições desnaturantes utilizando pET28a 75
8.2) Análise em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 15 % 75
8.3) Reenovelamento proteína do movimento do SBMV 75
8.4) Concentração das amostras purificadas 76
8.5) Dicroísmo Circular 76
9) RESULTADOS: CAPA PROTEICA DO RSPaV 76
9.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinate da capa proteica do RSPaV
usando o pacote de ferramentas EXPASY 76
9.3) Western blot 79
9.4) Expressão a 17 ºC e 25 ºC 81
9.5) Expressão utilizando extresse osmótico e choque térmico e expressão utilizando o meio
auto-indutivo 83
9.6) Arctic Express 84
9.7) Purificação e reenovelamento da proteína recombinante expressa a 37 ºC 86
9.8) Dicroísmo Circular 88
9.9) Ensaios de Cristalização 89
9.10) Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) 90
9.10.1) . Resultados DLS CP RSPaV. ... 92 9.11) Amplificaçao usando primers com sítio para TEV protease 94
9.12) Clonagem do fragmento da cp em vetor pMAL. 94
9.13) Sequenciamento do gene da capa preteica do RSPaV, confirmando sucesso na inserção
do sítio de clivagem para TEV protease 95
9.14) Purificação da TEV protease 97
9.15) Digestão enzimática das proteínas expressas clonadas em vetor pET28a (his-tag) e vetor
pMAL (MBP) utilizando TEV protease 97
9.16) purificação da proteína digerida utilizando TEV protease. 98 9.17) Ensaios de cristalização após digestão utilizando TEV protease 100
10) RESULTADOS E DISCUSSÃO: VPg DO SBMV 100
10.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinante VPg do SBMV usando o
pacote de ferramentas EXPASY 100
10.2) Expressão, purificação e concentração das proteínas VPg 101
10.3) Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) 102
10.3.1) Resultados DLS VPg ... 102 10.4) Amplificação da sequência codificador da VPg usando primers com sítio para TEV
protease 106
10.5) Purificação das partículas virais 107
10.6) Extração do RNA viral do SBMV 108
10.7) Amplificação da sequ6encia codificadora da VPg a partir do cDNA 109
10.8) Sequenciamentro e alinhamento VPg 111
10.8.1) Refinamento do alinhamento utilizando BioEdit ... 112
10.9) Expressão e purificação da proteína do movimento 113
10.9.1) Expressão e purificação da VPg utilizando pMAL-c2x ... 113 10.9.2) Expressão, purificação e concentração da VPg utilizando pET28a ... 115
10.10) Ensaios de cristalização 117
10.11) Efeito do TFE na estrutura secundária da VPg do SBMV monitorado atravé de
dicroísmo circular 118
10.12) Interação da sonda ANS 119
10.13) Efeito do dATP e TFE no raio hidrodinâmico da VPg 120
10.14) NMR 122
11) RESULTADOS: SERINO PROTEASE 124
11.1) Sequenciamento da região codificadora da serino protease do SBMV 124
11.2) Teste de solubilidade da Serino protease do SBMV 125
11.3) Predição da porção N-terminal da serinon protease do SBMV 126 11.4) Amplificação da sequência codificadora da serino protease utilizando primer a fim de
11.5) Sequenciamento da região codificadora da serino protease após remoção da porção
N-terminal 127
11.6) Teste solubilidade da Serino protease do SBMV após remoção da porção N-terminal 128
11.7) Expressão e purificação serino (-64) 129
12) RESULTADOS: PROTEÍNA DO MOVIMENTO 130
12.1) Expressão da provável MP em vetor pET28a 130
12.2) Dicroísmo circular após reenovelamento 131
12.3) Avaliação da interação entre MP do SBMV reenovelada e outras proteínas virais. 132 12.4) Dot blot utilizando proteínas que não interagiram com a MP 133 12.5) Amplificação usando primers com sítio para TEV protease 134 12.6) Amplificação dos gene da MP utilizando primes com sítio para TEV protease 134
12.7) Sequenciamento e alinhamento MP 136
13) CONCLUSÕES 137
14) EXPERIMENTOS REALIZADOS PARALELAMENTE AOS EXPERIMENTOS
VINCULADOS AO PROJETO DE PESQUISA 138
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Organização do genoma do RSPaV. ORF1: ... 21
Figura 2. Organização genômica dos sobemovírus. ... 24
Figura 3. Movimento célula a célula do Tobacco mosaic virus (TMV)... 27
Figura 4. Movimento viral célula a célula. ... 28
Figura 5. Sítio ativo da protease de SeMV. ... 32
Figura 6. (1) Capilar. (2) Solução contendo agente precipitante. ... 50
Figura 7. Método hanging drop: ... 51
Figura 8. Modelo representativo da técnica de microbatch: ... 52
Figura 9. Mapa do vetor pET-28a-c(+) ... 53
Figura 10. Modelo esquemático de oligonucleotídeoutilizado para clonagem visando remoção da cauda de histidina após purificação. ... 54
Figura 11. Região polylinker do vetor pMAL-c2x destacando os sítios de restrição ... 57
Figura 12. Sequência de aminoácidos da proteína da capa proteica recombinante do RSPaV clonada emvetor pET28a. ... 77
Figura 13. Quantidade e porcentagem de cada aminoácido presente na CP do RSPaV. ... 77
Figura 14. Predição da estrutura secundária a partir da sequência de aminoácidos da capa proteica do RSPaV utilizando o programa PSIPRED. ... 78
Figura 16. "Western blot" utilizando evidenciando reação imunológica com anti-soro monoclonal anti – histidina ... 80
Figura 17. SDS-PAGE 12 % evidenciando expressão em E. coli e purificação da proteína
capsidial doRSPaV a 37 ºC. ... 81
Figura 18. SDS-PAGE 12 % evidenciando os ensaios de solubilizaçãoda proteína capsidial doRSPaV expressa a 17 ºC ... 83
Figura 19. SDS-PAGE 12 % evidenciando os ensaios de solubilizaçãoda proteína capsidial doRSPaV expressa a 25 ºC ... 83
Figura 20. SDS-PAGE 12% evidenciando resultados referentes às estratégias de solubilização. 84
Figura 21. SDS-PAGE 12% evidenciando resultados referentes às estratégias de solubilização . 86
Figura 22. SDS-PAGE 12 % etapas da eluiçãoda CP-RSPaV recombinante ... 87
Figura 23. SDS-PAGE 12 % evidenciando sobrenadante dos testes de reenovelamento 88
Figura 24. Espectro do dicroísmo circular da capa proteica do RSPaV. ... 89
Figura 25. SDS-PAGE 12% evidenciando a proteína CP-RSPaV purificada. 90
Figura 26. Serie de Hofmeister ... 91
Figura 27. Ilustração das medidas de DLS da proteína da capa proteica do RSPaV. ... 92
Figura 28. Plotagem de 10 aquisições de 10 segundos cada referentes à proteína da Capa Proteica do RSPaV. ... 93
Figura 29. Gel de agarose 1% evidenciando a amplificação da sequência relativa a CP do RSPaV. 94
Figura 30. Gel de agarose 1,5% evidenciando a liberação do fragmento de aproximadamente referente à sequência codificadora da CP do RSPaV clonada em vetor de expressão pMAL. ... 95
Figura 32. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostrasda TEV purificada utilizando resina à base de
Níquel. ... 97
Figura 33. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostras proteicas após purificação e e digestão com TEV protease. ... 98
Figura 34. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostras proteicas após purificação,e digestão com TEV protease e posterior isolamento do fragmento de interesse ... 99
Figura 35. Sequência de aminoácidos da proteína VPg clonada emvetor pET28a. ... 100
Figura 36. SDS-PAGE 15% corado com comassie evidenciando pureza da VPg do SBMV. 101 Figura 37. Ilustração das medidas de DLS da proteína VPg em tampão Tris 10 mM e 150 mM KCl. ... 102
Figura 38. Ilustração das medidas de DLS da proteína VPg em tampão Tris 10 mM e 150 mM NaCl. ... 102
Figura 39. Plotagem de 20 aquisições de 20 segundos cada, referentes à proteína daVPg do SBMV. ... 103
Figura 40. Algumas condições em que a proteína VPg apresentou cristais. ... 104
Figura 41.Cristais de VPg fluorescendo quando iluminados por UV ... 105
Figura 42.Cristal de VPg ... 105
Figura 43. Gel nativo de agarose 1 %.evidenciando reações de PCR do gene da VPg ... 107
Figura 44. SDS-PAGE 12% evidenciando a proteína capsidial das partículas virais purificadas. ... 108
Figura 46. Gel de agarose 1%evidenciandodiferentes reações de PCR utilizando cDNA como template. ... 110
Figura 47. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando digestão enzimática dosvetores recombinates pET28a e pMAL-c2x. ... 111
Figura 48. Alinhamento de uma única sequência obtida utilizando primer reverse comparada com a sequência original do gene da VPg. ... 112
Figura 49. Alinhamento das sequências referentes ao gene da proteína VPg do SBMV. 113
Figura 50. SDS-PAGE 15 % evidenciando amostrasda VPg-MBPpurificada utilizando resina à base de Amilose. ... 114
Figura 51. SDS-PAGE 15 % . amostras digeridas pela TEV protease evidenciando bandas
referentes à MBP ... 115
Figura 52. SDS-PAGE 15 % VPg-his6 digerida com TEV protease. 116
Figura 53. SDS-PAGE 15 % comparando o precipitado de amostras contendo Histag e amostras com a Histag removida. ... 117
Figura 54. Espectros de UV-CD da VPg na ausência (linha preta), presença de TFE 10 % (linha vermelha), 20 % (linha laranja) e 30 % (linha amarela). ... 119
Figura 55. Espectro da emissão da fluorescência da sonda ANS ligada à VPg 120
Figura 56. Ilustração das medidas de DLS da proteína da VPg do SBMV na presença de tampão contendo 1 mM dATP e 30 % TFE. ... 121
Figura 57. Ilustração das medidas de DLS da proteína da VPg do SBMV na presença de tampão contendo 10 % de TFE. ... 121
Figura 59. Ilustração das medidas de DLS da proteína da VPg do SBMV na presença de tampão contendo 30 % de TFE. ... 121
Figura 60. Espectro de RMN de 1H mapeando locais de interação entre VPg e os ligantes: (a) dATP; (b) dCTP; (c) dGTP; (d) dTTP. ... 123
Figura 61. Espectro de RMN de 1H mapeando locais de interação entre VPg e adenina. ... 123
Figura 62. Alinhameto das sequências codificadoras da serino protease do SBMV. ... 124
Figura 63. Sequenciameto mostrandosucesso na inserção do sítio de clivagem para TEV protease. ... 125
Figura 64. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot após expressão proteica seguida de lise celular. ... 125
Figura 65. Predição da estrutura secundária da serino protease do SBMV. ... 126
Figura 66. Gel de agarose 1 % evidenciando a amplificação da sequencia codificadora da serino protease do SBMV ... 127
Figura 67. Gel de agarose 1% evidenciando a amplificação da sequência codificadora da serino protease utilizando colônias bacterianas transformadas como fonte de DNA 127
Figura 68. Resultado do sequenciamento da serino protease indicando sucesso nas etapas de clonagem. ... 128
Figura 69. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot após expressão proteicaseguida de lise celular. ... 129
Figura 70. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot após expressão proteica seguida de lise celular.: ... 129
Figura 72. Gel de poliacrilamida 12% mostrando a expressão da proteína de aproximadamente 22 kDa (MP-His). (17 kDa referente à MP + 5 kDA referente à cauda de histidina e região
polilinker). ... 131
Figura 73. Espectro do dicroísmo circular da MP reenovelada. ... 132
Figura 74. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot. 133
Figura 75. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de dot blot. 134
Figura 76. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando o fragmento de 500 pares de bases amplificado por PCR. ... 135
Figura 77. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando digestão enzimática dos vetores recombinates pET28a e pMAL-c2x. ... 136
Figura 78. Alinhamento das sequências referentes ao gene da proteína do movimento (MP) do SBMV. ... 137
Figura 79. SDS-PAGE 12 % evidenciando purificações parciais de 3 proteínas envolvidas neste projeto. (MM) Marcador molecular; (PknG): Proteína quinase PknG; (M1) Proteína DNA glicosilase mutM1. (M2) Proteína DNA glicosilase mutM2. ... 139
Figura 80. SDS-PAGE 12 % evidenciando purificações da PLD e PknG. (M) Marcador molecular; (1): PLD. (2, 3, 4 e 5): Proteína quinase PknG... 139
RESUMO
A videira é a frutífera economicamente mais importante no mundo e é cultivada para que seus frutos produzam uvas de mesa, suco, e uvas passas. As bagas da videira são também a base para o alto valor agregado dos vinhos e outras bebidas alcoólicas. O Rupestris stem
pitting associated virus – RSPaV foi identificado como o agente causador da doença do lenho estriado ou cascudo (“Rupestris stem pitting” - RSP), um dos componentes do
complexo do lenho rugoso da videira (“Rugose wood” - RW). Esta doença é transmitida por enxertia e constitui uma das viroses de videira mais disseminadas no mundo, sendo descrita no Brasil no final dos anos 60. Devido à dificuldade de purificação das partículas virais a partir da videira infectada, a expressão em larga escala da proteína capisidial do RSPaV em bactérias é uma estratégia promissora para o entendimento de suas propriedades. A cultura do feijão também tem produtividade grandemente afetada pela ocorrência de doenças que diminuem a produção e, conseqüentemente, reduzem a sua oferta, provocando um aumento nos preços de mercado. No Brasil, foram descritas mais de dez viroses em feijoeiro, citando-se aquela causada pelo Southern bean mosaic virus
(SBMV) do gênero Sobemovirus. Este vírus tem uma restrita gama de hospedeiras,
confinada quase exclusivamente a espécies da família das leguminosas, sendo algumas de interesse econômico como o feijoeiro comum e a soja. As proteínas do movimento (MP), serino protease e VPg, são produzidas em baixas concentrações, impossibilitando a purificação em larga escala a partir de plantas infectadas. A expressão e purificação em larga escala das proteínas VPg, serino protease e proteína do movimento do SBMV e proteína capisidial do RSPaV, foram realizadas utlizando os vetores pET28a e pMAL. Análises das proteínas, através de espalhamento dinâmico de luz mostraram que foi possível obter soluções proteicas monomodais. Através de dicroísmo circular foi possível observar que as proteínas estavam estruturadas e a investigação de interações proteína-ligante foi realizada utilizando técinicas de ressonância magnética nuclear. Estes resultados contribuiram para o aumento do conhecimento das propriedades bioquímicas dessas proteínas e podem auxiliar no entendimento do mecanismo de replicação viral.
ABSTRACT
The grapevine culture is the most economically important fruit plant in the world. The grapevine is the basic source of high valued wines and other alcoholic beverages. The Rupestris stem pitting associated virus-RSPaV was identified as the causative agent of the "rupestris stem pitting" (RSP) disease, a component ofthe the rugose wood (RW) complex, one of the major disease complexes affecting grapevines. This disease is transmitted by grafting and is one of the most widespread viruses of grapevine in the world. In brazil this disease was reported for the first time in late 1960s. As it is difficult to seperate the viral particles from the infected plant, the expression of large-scale of coat protein of RSPaV in bacteria is a promising strategy for understanding their properties. The bean crop productivity has also greatly affected by the occurrence of diseases that reduce the production and consequently reduce their supply, causing an increasein the prices. This virus has a narrow host range, confined almost exclusively to species of leguminous
species, some of the species has a very high economical value such as the common bean and soybean. The movement protein (MP), serine protease and VPg, are produced in low concentrations, making impossible the large-scale purification from infected plants. In Brazil, more than ten virus were reported in beans, among them, Southern bean mosaic virus (SBMV) from the genus Sobemovirus. The large scale expression and purification of proteins VPg, serine protease and movement protein of SBMV and capisidial protein of RSPaV were performed using pMAL pET28a vectors. Analysis of the proteins by dynamic light scattering showed that was possible to obtain monomodal protein solutions. By circular dichroism was observed that the proteins were structured and the investigation of protein-ligand interactions was performed using nuclear magnetic resonance. These results contributed to increase the knowledge of biochemical properties of this proteins and may help in understanding the mechanism of viral replication.
1) INTRODUÇÃO
1.1)Os Vírus
Os vírus infectam praticamente todas as formas de vida celular, desde procariotos (bactérias e archaea) até eucariotos (animais vertebrados e invertebrados, plantas e fungos). A presença de vírus pode ser nitidamente visível em organismos hospedeiros, mostrando sintomas da doença, no entanto, muitos organismos saudáveis podem ser hospedeiros de vírus não patogênicos, sejam eles ativos ou inertes.
Os vírus mais simples são compostos por um pequeno ácido nucleico protegido por uma camada de proteína. Todos os vírus são parasitas obrigatórios que dependem da maquinaria celular do hospedeiro para se reproduzir. Os vírus não são ativos fora de seus hospedeiros, e isso sugere que eles não são seres vivos. A maioria dos vírus infecta um único tipo de hospedeiro.
1.1.2) Vírus vegetais
Apesar das paredes celulares das plantas serem extremamente espessas e resistentes, existem diversos vírus capazes de infectar plantas, e disseminam-se a partir da célula infectada, atingindo células vizinhas. A maioria dos vírus de plantas conhecidos corresponde a vírus de RNA de fita positiva, foi postulado que estes pequenos genomas facilitam a transferência entre as células da planta.
O advento de novas tecnologias embiologia molecular esta nos dando uma visão muito diferente do mundo da virologia vegetal. Os estudos até agora são preliminares, mas prometem nos mostrar uma nova imagem da diversidade dos vírus de plantas que é muito além de nossa compreensão atual. Este novos conhecimentos abrangem uma série de questões importantes na agricultura, incluindo a fonte de infecções por vírus emergentes, o papel dos vírus em ecologia vegetal, incluindo potenciais efeitos benéficos (ROOSSINCK et al., 2010), o papel da biodiversidade, a
função dos hospedeiros na emergência de doenças (KEESING et al., 2011) e, finalmente, a
proposta de estratégias para combater a infecção viral.
1.2)A videira
A videira é uma planta pertencente à família Vitaceae, cujas principais cultivares são do gênero Vitis (CRONQUIST, 1981). Estima-se existirem cerca de 6000 variedades de V. Vinifera
L. (ALLEWELDT; DETTWEILER, 1994), das quais menos de 400 são de importância comercial. Atualmente, a maioria dos recursos genéticos de Vitis vinifera L. é mantida em
coleções de germoplasma (GALET, 2000). Sua importância econômica é devido ao fato de a uva ser uma das frutas mais consumidas no mundo, tanto in natura como em suco, possuindo também
um extenso mercado na indústria de vinhos e outros fermentos alcoólicos (CHOUDHURY et al.,
2001), ocupando mundialmente nove milhões de hectares plantados, o que faz com que a uva só perca em importância em área para citrus e banana (POMMER, 2002).
A Vitivinícola mundial apresenta grande concentração. A União Européia se destaca, representando cerca de: 45 % da superfície vitícola mundial; 65 % da produção mundial de uvas; 60 % do consumo mundial e cerca de 70 % das exportações mundiais. O Brasil, no cenário internacional, é o 21° país em área cultivada, 14° em produção de uvas, 24° em exportação de uva (MELLO, 2006). A viticultura é uma atividade econômica recente no Brasil, quando comparada aos tradicionais países produtores da Europa.
como o principal produtor com área de 36.668 há, ou seja, 56,08 % da área total do país, seguido pelo Estado de São Paulo com 12.152 há (MELLO, 2006).
1.2.1) Viroses da videira
A cultura da videira está sujeita a um grande número de doenças que pode causar perdas significativas na produção de uva. As doenças causadas por vírus representam um dos mais importantes problemas fitossanitários da viticultura mundial, ocorrendo em praticamente todas as regiões onde a videira é cultivada (AMORIM; KUNIYUKI, 1997). Doenças causadas por vírus na cultura da videira têm sido mencionadas nos países de tradição vitícola há mais de um século, porém o estudo desses patógenos evoluiu nos últimos 40 anos. Até 1960, eram mencionadas na literatura, apenas oito anomalias consideradas de origem viral. Dentre essas, estavam as doenças denominadas de ‘Pierce's disease’ e ‘Flavescence dorée’, as quais, sabe-se hoje, são causadas por uma bactéria e um fitoplasma, respectivamente.
Dois fatos marcaram decisivamente o avanço na pesquisa das viroses da videira, inicialmente a descoberta de que o vírus responsável pela degenerescência da videira (fanleaf ou court-noué) era transmitido através do solo pelo nematóide Xiphinema index e, posteriormente a
existe um grupo dessas doenças de grande relevância econômica para a viticultura, razão pela qual é objeto de constante atenção nos programas de seleção sanitária dos diversos países vitícolas. Dessas viroses já foram identificadas no Brasil quatro das mais importantes - "enrolamento da folha" (leafroll), "intumescimento dos ramos" (corky bark), "caneluras do tronco" (stem grooving, stem pitting) e "degenerescência da videira" (fanleaf). Outras duas possuem menor relevância econômica e ocorrem de forma latente na maioria das cultivares comerciais, a "necrose das nervuras" (vein necrosis) e "manchas das nervuras" (fleck) (KUHN; FAJARDO, 2006).
No Brasil, o primeiro relato de virose em videira foi em 1972 no Estado de São Paulo (KUNIYUKI, 1972a) e, atualmente, as principais doenças descritas em outros países já foram constatadas no território nacional. A disseminação desses patógenos pode ser potencializada quando se considera que a videira é, comercialmente, multiplicada por propagação vegetativa, o que propicia a possibilidade da ocorrência de infecção latente, na qual plantas infectadas não apresentam sintomas aparentes. Outros fatores que contribuem para o agravamento do problema são: presença de diferentes espécies de vírus infectando uma mesma planta; suscetibilidade de cultivares a estes agentes; combinação copa/porta-enxerto e presença de vetores desses vírus na área do parreiral, entre outros.
Lenho estriado ou cascudo (“Rupestris stem pitting” - RSP)
O lenho estriado é uma doença transmitida por enxertia que se caracteriza por induzir na indicadora Vitis rupestris ‘St. George’ (‘Rupestris du Lot’) faixa ou banda de pequenas caneluras
no lenho, que se desenvolve a partir do ponto de enxertia para a base da planta. Os sintomas característicos do cascudo ou lenho estriado são apresentados pelas variedades Itália, Rubi e Benitaka. As folhas apresentam-se menores, ligeiramente assimétricas e com mosaico difuso. A casca do tronco torna-se espessa, quebradiça e fendilhada e não se destaca com facilidade do lenho (AMORIN; KUNIYUKI, 1997). A etiologia do RSP não é totalmente conhecida, um vírus denominado Rupestris stem pitting associated virus – RSPaV foi identificado como o agente causador da doença do lenho estriado (MENG et al., 1997; MENG et al., 1998; MENG et al.,
1999a), sendo classificado como membro do gênero Foveavirus (MARTELLI; JELKMANN,
1998), família Flexiviridae(ADAMS et al., 2004).
crescimento e produtividade da videira (BONFIGLIOLI et al., 1998; REYNOLDS et al., 1997).
A presença de um outro vírus, como Grapevinevirus A (GVA), Grapevine fleck virus, ou
Grapevine leafroll associated virus-1, associado ao RSPaV, é requerida para sintomas de Rugose
wood-typeocorrerem (BONFIGLIOLI et al., 1998). Estes vírus podem ser transmitidos através de
enxertia de videiras infectadas pelo RSPaV (BONFIGLIOLI et al., 1998; MARTELLI, 1993) ou
no caso do GVA por cochonilha Planococcus ficus (ENGELBRECHT; KASDORF, 1990;
MINAFRA; HADIDI, 1994). Cultivares de videiras sem sintomas, mas infectados pelo RSPaV são um risco para o desenvolvimento do RSP, portanto é importante saber se uma videira contém o RSPaV. A presença do RSPaV pode ser determinada por RT-PCR usando oligonucleotídeo baseado na sua sequência genômica (MENG et al., 1999; ZHANG et al., 1998) com
aparentemente maior confiabilidade do que indexação biológica em St. George (MENG et al.,
1999). O vírus foi reportado em pólen (ROWHANI et al., 2000) e sementes (STEWART;
NASSUTH, 2001), mas essas fontes não originam mudas infectadas (MENG et al., 2003).
O desenvolvimento de técnicas moleculares para a detecção do RSPaV mostrou que este vírus encontra-se distribuído mundialmente (MINAFRA; BOSCIA, 2003). No entanto, a detecção de infecções causadas pelo RSPaV ainda é problemática. Anticorpos produzidos para a detecção da proteína capsidial (MENG et al., 2003; MINAFRA et al., 2000) ainda não foram
comercializados para o uso em testes de larga escala, como o ELISA.
O genoma completo deste vírus apresenta 8.726 nucleotídeos com extremidade 3’ poliadenilada (MENG et al., 1998; ZHANG et al., 1998) e similaridade com o Apple stem pitting
virus – ASPV) (MENG et al., 1998; ZHANG et al., 1998). O genoma do RSPaV apresenta cinco
Figura 1. Organização do genoma do RSPaV. ORF1: gene da replicase que inclui os motivos metil transferase, cisteíno protease, helicase e RNA polimerase. ORF 2, 3 e 4: bloco triplo de genes, codificadores de proteínas envolvidas no movimento célula a célula. OFR5:gene daproteína capsidial. ORF6: gene de proteína com função desconhecida. Extremidade 3` poliadenilada (A)n. Adaptado de MENG et al., 2006.
A presença de uma ORF adicional sobrepondo o gene da proteína capsidial também foi encontrada em outra espécie do gênero Foveavirus, o Apricot latent virus - APLV (GENTIT et
al., 2001). A existência desta ORF tem sido proposta baseando-se na ocorrência ‘in frame’ de
códon de iniciação e finalização. O códon de iniciação da ORF6 está localizado na região central (nt 458) do gene da capa proteica (ZHANG et al.,1998) que mostra-se conservada entre as
variantes analisadas por Nolasco et al. (2006). Entretanto, estes autores não localizaram este códon de iniciação em um dos grupos de variantes do RSPaV por eles analisado. Para este grupo (grupo 3), o códon de iniciação mais próximo foi localizado 72 nt após o códon de iniciação citado por ZHANG et al. (1998), ou seja, no nucleotídeo 530 da ORF5, o que codificaria uma
proteína de menor massa molecular (10.7 kDa). Foi observado que o RSPaV encontrado no Estado de São Paulo (Acesso GenBank: DQ443732) apresenta o códon ‘in frame’ de iniciação somente na posição 530 da ORF5. Além disso, o alinhamento de sequências de nucleotídeos do RSPaV mostrou que algumas sequências variantes possuem o códon de iniciação nas duas posições, ou seja, no nucleotídeo 458 e 530 (PEREIRA; GASPAR. Dados não publicados). Estas variações levam ao questionamento quanto à existência da ORF6 no genoma do RSPaV, uma vez que evidências diretas da existência desta ORF ainda não foram apresentadas. Além disso, estudos que visam o melhor entendimento das características moleculares do RSPaV poderão ser realizados.
têm sido publicados (MENG et al., 1999b; ROWHANI et al., 1999; ROWHANI et al., 2000;
SOARES et al., 2000; SANTOS et al., 2003; CASATI et al., 2003; TERLIZZI et al., 2003;
LIMA et al., 2003; MENG et al., 2005; NOLASCO et al., 2006).
1.3) O Feijão
O feijão (Phaseolus vulgaris L.), leguminosa comum da família das Fabáceas
(Leguminoseae) (CRONQUIST, 1981), constitui uma das culturas mais importantes existentes, sendo consumida por todo o mundo, devido principalmente ao seu valor nutritivo. A cultura do feijão no Brasil assume um grande valor social, pois constitui a base da alimentação da população, sendo fonte de proteína vegetal de baixo custo. A dupla feijão com arroz é o prato principal na alimentação da maioria da população brasileira (CULTURA, 2000). Dados das safras (2008) mostram que o Brasil produziu cerca de 3,52 milhões de toneladas de feijão, sendo a região sudeste a maior produtora (CONAB, 2009). A produtividade da cultura é grandemente afetada pela ocorrência de doenças que diminuem sensivelmente a produção e, conseqüentemente, reduzem a sua oferta, provocando um aumento nos preços de mercado (CULTURA, 2000). Estas doenças têm exercido um papel relevante na baixa produtividade de feijoeiros no Brasil e outros países latino-americanos (JAYASINGHE, 1982; COSTA; COSTA, 1983). As mais numerosas são ocasionadas por fungos seguindo-se as de etiologia viral, várias com expressiva importância econômica (GAMEZ, 1977).
No Brasil, foram descritas mais de dez viroses em feijoeiro (COSTA et al.,1972;
BIANCHINI et al.,1997), citando-se aquela causada pelo Southern bean mosaic virus (SBMV),
do gênero Sobemovirus (HULL; FARGETTE, 2005). Este vírus tem uma restrita gama de
hospedeiras, confinada quase exclusivamente a espécies da família das leguminosas, sendo algumas de interesse econômico como o feijoeiro comum e a soja. Embora o SBMV não seja no momento um problema fitossanitário, observações de campo no Estado do Paraná têm indicado a sua presença em infecções mistas principalmente com o Bean golden mosaic virus (Gênero
Begomovirus, Família Geminiviridae), levando à possibilidade de problemas futuros para a
1.4) Sobemovirus
O nome Sobemovirus é originado das iniciais da espécie tipo do gênero Southern bean
mosaic virus e o gênero compreende 13 espécies definitivas.
A maioria das espécies dos sobemovírus apresenta distribuição geográfica limitada, mas algumas espécies são encontradas em várias partes do mundo (HULL, 1988). Os sobemovírus infectam plantas tanto mono como dicotiledôneas, mas a gama de hospedeiras de cada espécie é relativamente restrita. Os sintomas induzidos são, principalmente, mosaico e mosqueado e, em geral, causam infecção sistêmica invadindo quase todos os diferentes tipos de tecidos das plantas hospedeiras (HULL, 1988). São transmitidos mecanicamente, por vetores e por sementes. Para a maioria das espécies (CoMV, RYMV, SNMoV, SBMV, SCPMV, TRoV) a transmissão é feita por besouros coleópteros enquanto o BSSV é transmitido por afídeos, o VTMoV por mirídios e o SoMV por dípteros, homópteros e hemípteros (HULL, 1988; TAMM; TRUVE, 2000).
1.4.1) Organização do genoma
Os sobemovírus possuem partículas virais isométricas com cerca de 30 nm de diâmetro, com uma única camada proteica formada por 180 subunidades com massamolecular igual a 26-34 kDa. O RNA genômico é uma molécula de fita única e polaridade positiva com tamanho de
grupos: aqueles semelhantes ao SCPMV e aqueles semelhantes ao CoMV. A poliproteína do SCPMV é codificada por uma longa e contínua ORF2, contendo também uma região codificadora interna, ORF3. Organização semelhante do genoma já foi descrita para o isolado Arkansas do SBMV (SBMV-Ark) (LEE; ANDERSON, 1998), isolado “Ivory Coast” do Rice yellow mottle virus- RYMV-CI (YASSIet al., 1994) e Lucerne transient streak virus - LTSV
(FEFFRIES et al., 1995).
Por outro lado, na organização genômica do CoMV falta a ORF2 contínua e uma região codificadora similar à ORF3 do SCPMV. Em vez disso, CoMV possui duas ORFs sobrepostas, ORF2a e ORF2b, e a poliproteína é expressa através de um mecanismo de mudança de fase (“frameshift”) ribossomal -1 (MÄKINENet al., 1995a; RYABOVet al., 1996).
Figura 2. Organização genômica dos sobemovírus Southern cowpea mosaic virus (SCPMV) e Cocksfoot
mottle virus (CoMV). Figura obtida de Hull; Fargette (2005).
1.5) Produtos gênicos e suas possíveis funções
Os RNA de vários sobemovírus já foram traduzidos in vitro em sistemas de “lisado de
reticulócitos de coelho” e de “extrato de germe de trigo”. Os RNA do SBMV e SCPMV codificam a tradução de 4 proteínas nesses sistemas: 105 kDa, 75 kDa, 29 kDa e 14 kDa para o SBMV e 100 kDa, 70 kDa, 30 kDa e 20 kDa para o SCPMV (MANG et al., 1982;
(MÄKINEN et al., 1995), LTSV (MORRIS-KRSINICK; FORSTER, 1983), SNMoV
(KIBERSTIS; ZIMMERN, 1984) e TRoV (MORRIS-KRSINICK; HULL, 1981), apresentando somente ligeiras diferenças na massa molecular. Estudos têm demonstrado que as proteínas de 100 e 70 kDa do SCPMV são relacionadas e traduzidas a partir do RNA genômico enquanto a proteína de 20 kDa é presumivelmente codificada pela ORF1 (MANG et al., 1982; WU et al.,
1987). Já a poliproteína codificada pela ORF2 do SCPMV é processada por clivagem proteolítica para originar o produto de tradução de 70 kDa (WU et al., 1987). A proteína de 30 kDa (proteína
capsidial) é traduzida a partir de um pequeno RNA subgenômico (sgRNA) que já foi encontrado em tecidos infectados por sobemovírus bem como em partículas virais (RUTGERS et al., 1980;
WEBER; SEHGAL, 1982; RYABOV et al., 1996; TAMM et al., 1999). Estudos com o CoMV,
utilizando a síntese de proteínas in vitro e imunoprecipitação com anticorpos específicos,
mostraram que as proteínas de 12 kDa, 71 kDa e 100 kDa são sintetizadas a partir do RNA genômico do vírus. A proteína 12 kDa é produzida a partir da ORF1, a proteína 71 kDa a partir da ORF2a e a 100 kDa é a poliproteína produzida a partir das ORFs 2a e 2b. A proteína de 34 kDa (proteína capsidial) é produzida a partir de um sgRNA.
1.5.1) ORF1
Todos os sobemovírus caracterizados codificam uma pequena proteína a partir da ORF1, mas estas apresentam sequências e massas moleculares diferentes (11,7 a 24,3 kDa) e não são relacionadas com qualquer outra proteína conhecida. Análises de mutantes incapazes de produzir P1 ou mutantes produtores de proteínas truncadas indicaram que as proteínas P1 do RYMV ou do SCPMV não são necessárias para a replicação viral, porém são necessárias para o movimento célula a célula e movimento sistêmico (BONNEAU et al., 1998; SIVAKUMARANet al., 1998).
vivo ainda não foi possível para nenhum sobemovírus. Foi também descrito que a proteína P1 do
RYMV funciona como supressora do mecanismo de silenciamento gênico (“posttranscriptional gene silencing”, PTGS) (VOINNET et al., 1999).
1.5.1.1) Proteína do Movimento
Para realizar uma infecção sistêmica na planta hospedeira, os fitovírus precisam superar diversas barreiras. Eles devem entrar na célula através de um ferimento ou inoculação por vetores, iniciar a multiplicação, translocar para as células vizinhas (movimento célula a célula) e finalmente para as outras partes da planta (movimento a longa distância). Os fitovírus empregam comunicações intercelulares para se movimentarem pela planta. No movimento célula a célula os vírus utilizam os plasmodesmos para atravessar a parede celular. Os plasmodesmos são canais estreitos revestidos pela membrana plasmática e atravessados por um túbulo de retículo endoplasmático modificado, conhecido como desmotúbulo. Esses canais permitem a continuidade do citoplasma e do sistema de endomembranas entre as células (RAVEN et al.,
2001). Em células vegetais sadias, apenas moléculas com massa molecular inferior a 1 kDa são capazes de atravessar passivamente esses canais, que possuem limite de exclusão muito inferior à massa molecular dos menores fitovírus, ou mesmo de seus RNAs ou DNAs genômicos (WOLF
et al., 1987). Para suprir essa restrição física, os fitovírus codificam proteínas especializadas,
Figura 3. Movimento célula a célula do Tobacco mosaic virus (TMV). Neste modelo a proteína do movimento (MP) se liga ao RNA viral.[1] Proteínas da hospedeira podem se ligar ao complexo MP.[2] O complexo MP atravessando o plasmodesmo.[3,4 e 5] As proteínas se desligam do RNA viral permitindo que as replicases iniciem a replicação.
Para o transporte a longa distância, além dos plasmodesmos, foi proposta a utilização do sistema vascular da planta (floema) (CARRINGTON et al., 1996). Durante todo esse processo de
transporte, uma ou mais proteínas virais exercem papel fundamental. A maior parte dos vírus de plantas estudados parece expressar uma proteína especificamente relacionada com o movimento, denominada “Proteína do Movimento” (“Movement Protein”- MP), que está envolvida no transporte dos vírus através dos plasmodesmos (LAZAROWITZ; BEACHY, 1999). O papel da MP no movimento a longa distância ainda é mal compreendido, no entanto, alguns autores sugerem que a MP realize funções específicas no espalhamento dos vírus sistemicamente (HILF; DAWSON, 1993). Os fitovírus são classificados em três grupos principais com base na necessidade ou não da proteína capsidial (CP) para atravessarem os plasmodesmos. O grupo I compreende os vírus que não necessitam da CP para realizarem o movimento. Nos vírus do grupo II a CP age auxiliando a MP no movimento e protegendo o genoma viral. Os vírus do grupo III também requerem a CP, porém, são transportados como partículas inteiras (SCHOLTHOF, 2005). O movimento envolvendo CP pode ocorrer através de túbulos (movimento
CARRINGTON et al., 1996). Nesses casos, os plasmodesmos das células infectadas são
drasticamente modificados, os desmotúbulos são removidos e um túbulo formado por MP é inserido no poro plasmodesmal (Figura 3). É por esse túbulo que as partículas virais são transportadas, sendo que neste tipo de transporte a proteína capsidial é também requerida (LAZAROWITZ E BEACHY, 1999; CARVALHO et al., 2004).
Figura 4. Movimento viral célula a célula. Na parte inferior da figura, movimento é denominado túbulo guiado.
As MPs virais podem ser agrupadas em quatro superfamílias: I) MPs codificadas pelo bloco triplo de genes dos potexvírus e vírus relacionados; II) MPs dos tymovírus; III) uma série de pequenos polipeptídeos menores que 10 kDa, codificados pelos carmovírus e alguns
geminivírus; IV) a superfamília ‘30 K’, relacionada com a MP de 30 kDa do TMV. Para a superfamíla ‘30 K’ foram propostos dois modelos de movimento, o primeiro é exemplificado pelo Tobacco mosaic virus (TMV) e está relacionado com o aumento do limite de exclusão dos
MELCHER (2000) após alinhar a seqüência de aminoácidos das MPs de 30 kDa de vários gêneros de fitovírus mostrou que os agrupamentos formados estão relacionados com o tipo de movimento realizado pelo vírus. Um grupo reúne os vírus formadores de túbulos e outro, aqueles vírus que não se movimentam por túbulos.
1.5.2) ORF 2
A ORF 2 codifica uma poliproteína que por clivagem origina três produtos funcionais: uma serino protease; uma proteína ligadora do genoma viral (VPg) e uma polimerase com atividade relacionada à replicação do RNA viral, a RNA polimerase RNA-dependente. (GORBALENYA et al., 1988; LEE; ANDERSON, 1998; MÄKINEN et al., 1995; OTHMAN;
HULL, 1995; RYABOV et al., 1996; WU et al., 1987; YASSI et al., 1994). Não é ainda
conhecido se estas são as únicas funções da poliproteína. Dentro da ORF 2 encontra-se a ORF 3; que codifica uma proteína de função desconhecida. Os sobemovírus caracterizados codificam uma proteína com massa molecular de cerca de 100 kDa.A tradução da poliproteína dos sobemovírus não é iniciada a partir de RNA subgenômico (nunca detectado em tecidos infectados), mas sim a partir do próprio RNA genômico. Assim, as ORFs 1 e 2 são traduzidas apartir de seus respectivos códons de iniciação AUG. Produtos de tamanho esperado de ambas as ORFs foram observados após tradução dos RNAs genômicos do SCPMV (SIVAKUMARAN et
al., 1998) e do CoMV (TAMM et al., 1999).
1.5.2.1) VPg
estar envolvida na replicação genômica, possivelmente na iniciação da síntese do RNA. Foi sugerido ainda que a clivagem da ligação entre a VPg e o RNA pode ter um uma função regulatória; é possível que apenas RNAs ligados à VPg sejam encapsidados, enquanto RNA sem a proteína sirva como mRNA ou como templates (LEE et al. 1977; NOMOTO et al. 1977).
Trabalhos atuais indicam uma versatilidade da VPg, tendo participação nos processos de replicação do RNA, movimentação viral célula a célula e longa distância, tradução, supressão de silenciamento gênico, além de outras funções (BORGSTROM et al., 2001; KELLER et al., 1998;
LELLIS et al., 2002; RAJAMAKI et al., 2002; SCHAAD et al., 1996; SCHAAD et al., 1997).
Algumas proteínas VPg podem ainda ser encontradas associadas à membrana de plantas infectadas (HAFREN; MAKINEN, 2008) e possuir a capacidade de ligar-se anionicamente a fosfolipídios in vitro, evidenciando alterações estruturais associadas à ligação (RANTALAINEN
et al., 2009). Estudos recentes têm sugerido que uma flexibilidade estrutural permite essa
variedade functional das proteínas VPg (GRZELA et al., 2008; HEBRARD et al., 2009;
RANTALAINEN et al., 2008; SATHESHKUMAR, 2005), no entanto nenhuma estrutura foi
obtida através da difração de raio-X para que pudesse permitir avanços nessa linha de pesquisa. Várias proteínas VPg de vírus vegetais podem ser classificadas como proteínas intrinsecamente desordenadas (IDPs), incluindo VPgs do rice yellow mottle virus (RYMV), lettuce mosaic virus (LMV), potato virus A (PVA), potato virus Y (PVY) e sesbania mosaic virus (SeMV) (GRZELA
et al., 2008; HEBRARD et al., 2009; RANTALAINEN et al., 2008; SATHESHKUMAR et al.,
2005). IDPs em seu estado nativo não tem estruturas fixas, necessitando de uma associassociação com um ligante para permanecerem com suas estruturas estáveis. Esta é a característica mais vantajosa de proteínas multifuncionais, permitindo assim uma adaptação estrutural (KIMMO et
al., 2009).
1.5.2.2) Serino protease
semelhante às proteases celulares, como tripsina e quimotripsina (GORBALENYA et al., 1988).
Esta protease é similar às cisteínas proteases encontradas nos picornavírus (Família
Picornaviridae) e é característica de todos os sobemovírus, polerovírus (Família Luteoviridae),
Pea enation mosaic virus (PEMV, Gênero Enamovirus) e Mushroom bacilliform virus (MBV,
Gênero Barnavirus). O motivo serino protease está localizado no terço N-terminal da
poliproteína codificada pela ORF2 do SBMV, SBMV-Ark, SCPMV, RYMV e LTSV e é codificada pela ORF2a no caso do CoMV (GORBALENYA et al., 1988). O sítio catalítico
H-D-S (Histidina, posição 181-Ácido Aspártico, posição 216-H-D-Serina, posição 284) encontrado no SCPMV é também conservado no SeMV e outros sobemovírus (LOKESH et al., 2001). Em
SeMV, esta protease, cliva a poliproteína codificada pela ORF2 em três posições diferentes, em E325-T326, T403-E402 eE498-S499, para liberar três domínios de proteases diferentes, sendo elas VPg, p10 e RDRP (RNA polimerase dependente de RNA) (SATHESHKUMAR et al.,
2004). Na maioria dos outros vírus que têm VPg na extremidade 5' do seu genoma, o arranjo de domínio é VPg-protease, ao passo que, em sobemovírus, é protease VPg.
Figura 5. Sítio ativo da protease de SeMV.Glicerol =GOL. As ligações de hidrogênio estão representadas por linhas pontilhadas.
Foi demonstrado que a serino protease do SeMV possui atividade proteolítica atuando em
cis e trans, além de possuir possíveis hélices que estariam associadas à ligação com membranas
(SATHESHKUMAR et al., 2004). Com exceção do LTSV, todos os produtos da ORF2 dos
sobemovírus mostraram a presença de tais hélices sugerindo uma possível função de ligação às membranas. Em muitos vírus de RNA de polaridade positiva, foi observado que a replicação e montagem das partículas virais ocorrem em associação com membranas (CARETTE et al., 2002;
2) REPLICAÇÃO VIRAL
Muitas proteínas codificadas pelos RNAs virais, sejam elas capsidiais ou proteínas não estruturais, acumulam-se na célula como "corpos de inclusão" ou “viroplasmas” tanto no citoplasma como no núcleo. A agregação desses produtos gênicos virais pode constituir um método de remoção de proteínas que, em grandes quantidades, poderiam ter influência no funcionamento da célula. Entretanto, os corpos de inclusão poderiam estar também associados com a replicação e/ou montagem das partículas virais (MATTHEWS, 2001). Na maioria dos casos, entretanto, a síntese das proteínas virais não estruturais ocorre de maneira transitória de modo que a quantidade produzida é extremamente baixa.
Quando as proteínas virais acumulam nas células como corpos de inclusão, há a possibilidade de as mesmas serem purificadas por métodos bioquímicos, a partir de extratos das folhas das plantas infectadas como ocorre, por exemplo, com os potyvírus (URCUQUI-INCHIMA et al., 2001). Por outro lado, quando as proteínas não estruturais (e mesmo as
partículas virais) são sintetizadas em tecidos específicos da hospedeira (floema, por exemplo) e em baixas concentrações, tais métodos mostram-se ineficientes e alternativas devem ser buscadas. Uma estratégia alternativa que vem sendo utilizada ultimamente para estes casos é a expressão de tais proteínas, sejam estruturais ou não, em Escherichia coli.
3) EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EM BACTÉRIA
baixa concentração nas hospedeiras.
A expressão de proteínas heterólogas em bactéria muitas vezes leva à formação de agregados insolúveis ou corpos de inclusão (IBs). Estes agregados consistem basicamente de proteínas recombinantes e podem ser facilmente isoladas dos demais componentes bacterianos por centrifugação após o rompimento celular, proporcionando assim um meio simples de recuperar a proteína de interesse. No entanto, solubilização dos corpos de inclusão e subsequente renovelamento da proteína, a fim de obter corretamente a reforma das pontes dissulfeto ainda é uma questão central no campo da biotecnologia com importantes implicações teóricas e práticas. Durante a última década, vários estudos têm revelado uma caracterísca peculiar dos IBs, que é a existência de estruturas secundárias residuais das proteínas recombinantes (OBERG et al., 1994;
PRZYBYCIEN et al., 1994; FINK, 1998; UMETSU et al., 2004; AMI et al., 2005; UMETSU et
al., 2005). Para obter a proteína nativa, os IBs primeiro devem ser liberados, solubilizados e
posteriormente renovelados para recuperar sua atividade biológica. Eles são sujeitos a repetidas lavagens por centrifugação e posteriormente solubilizados. Algumas proteínas podem ser solubilizadas com agente não desnaturante (por exemplo, L-arginina, N-Lauril Sarcosina, Sulfobetaína, Tampão Tris pH 12,5 com ou sem uréia 2M). No entanto, os corpos de inclusão são em geral solubilizados pelo uso de altas concentrações de agentes desnaturantes tais como uréia e cloridrato de guanidina, juntos com um agente redutor como β-mercaptoetanol (CLARCK, 1998; LILIE et al., 1998). As proteínas solubilizadas dessa forma podem ser renaturadas pela lenta
remoção do agente desnaturante na presença de agentes oxidantes (FISCHER et al., 1993)
através de diferentes métodos conhecidos. Muitos procedimentos cromatográficos têm sido descritos no passado e revisados recentemente (JUNGBAUERet al., 2004). No entanto, a
maneira mais simples de iniciar o refolding é diluir a proteína desnaturada em tampão de
4) JUSTIFICATIVA
partículas virais, são escassos.
5) MATERIAIS E MÉTODOS
5.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinate da capa proteica do RSPaV usando o pacote de ferramentas EXPASY
O ExPASy (Expert Protein Analysis System, http://ca.expasy.org/) é um servidor de
biologia molecular que possui “links” para o acesso a “sites” dedicados às análises de identificação e caracterização da proteína, predição de estrutura primária, secundária, topologia, etc. A sequência de aminoácidos foi traduzida a partir da sequencia de nucleotídeos obtidos pelo sequenciamento do cDNA e analisada in silico no através do pacote ExPASy.
Estrutura primária no programa ProtParam, que é uma ferramenta que permite a análise computacional de vários parâmetros físicos e químicos para uma dada proteína depositada no Swiss-Prot ou TrEMBL ou para uma sequência de aminoácidos enviada ao ProtParam. Disponível em http://expasy.org/tools/protparam.html.
Estrutura secundária foi analisada no programa PSIPRED, que é um método de predição de estrutura secundária baseado em rede neural e em análises obtidas de PSI-BLAST (Position Specific Iterated- BLAST) (McGUFFIN, BRYSON; JONES, 2000). A predição de estrutura secundária foi baseada na sequência primária de aminoácidos da proteína capsidial do RSPaV. Disponível em http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/.
5.2) Linhagem de bactéria utilizada para expressão
E. coli BL21-CodonPlus-RIL (Novagen), possui cópias extras de genes de tRNA de argU,
isoleucina AUA e para leuceina CUA, respectivamente. Essa linhagem tem tRNAs que mais frequentemente restringem a tradução heteróloga de proteínas de organismos que possuem genomas ricos em AT, e permitem alto nível de expressão de proteínas que são fracamente expressas em linhagens convencionais de BL21.
5.3) Plasmídeo Utilizado
Foi utilizado o plasmídeo pET28a (Novagen) contendo o gene da proteína capsidial do RSPaV cedido pelo Prof. Dr. José Osmar Gaspar, previamente sequenciado proveniente de estudos anteriores.
5.4) Tranformação bacteriana
Plasmídeos recombinantes contendo as sequências de interesse foram transformados em linhagem BL21-RIL de E. coli competente. Utilizando-se 50 µL de células competentes e 1 µL
5.5) Testes de expressãoda proteína da capa proteica do RSPaV recombinante sob diferentes condições.
Inicialmente 5mL do pré inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 100 mL de meio líquido seletivo (LB + kanamicina e cloranfenicol, 30 e 34 µg/mL rspectivamente). A amostra foi mantida sob agitação e aeração até atingir a densidade (OD550nm ) entre 0,4 e 0,6 para indução da expressão com IPTG. A leitura da amostrafoi feita em espectrofotômetro - Spectronic Genesys 2. A indução da expressão foi feita com IPTG em diferentes concentrações (0,1 mM; 0,2 mM; 0,3 mM e 0,4 mM) e sob diferentes temperaturas (17 °C, 25 °C,e 37 °C) a fim de obter proteínas na fração solúvel após a sonicação. Após 4 h e 16h de indução, amostras coletadas foram analisadas através de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) segundo Laemmli (1970).
Após a constatação da expressão nos testes iniciais, a expressão foi realizada em maior escala visando à obtenção de proteínas para purificação. Inicialmente 5 mL de pré-inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 250 mL de meio líquido seletivo (LB + kanamicina e cloranfenicol, 30 e 34 µg/mL rspectivamente). A cultura foi mantida sob as mesmas condições citadas acima. A purificação foi feita utilizando resina de níquel (ProBond) conforme instruções do fabricante (Invitrogen).
5.6) Análise em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
As amostras coletadas durante o teste de expressão foram analisadas através de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) segundo Laemmli (1970). As proteínas foram desnaturadas por fervura (3 minutos a 100 °C) em tampão de amostra (Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8, contendo SDS 4 %, glicerol 20 %, 2-ME 10 % e azul de bromofenol 1,0 mM). As amostras foram centrifugadas por 5 min a 16.000 x g e 10 L do sobrenadante de cada
acético (50:50:10) e Comassie Blue 0,25 % por 1 h e descorados com metanol e água (1:1) por 1 h.
5.7) Western blot
Alíquotas contendo proteína recombinante foram misturadas com tampão de amostra (1:1) e aplicadas em gel SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose em um eletrotransferidor (Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad) operando sob voltagem constante (100V) por 1 hora.
O tampão de transferência utilizado foi o Tris-Glicina (Tris 0,025 M, Glicina 0,192 M) contendo metanol 20 %. A membrana foi incubada com antissoro monoclonal Anti-polihistidina (produzido em camundongo; Sigma) e antissoro anti-IgG de camundongo conjugado com fosfatase alcalina (Sigma) diluído 1:30.000 e a detecção da reação antígeno/anti-corpo foi feita com mistura de BCIP/NBT (“5-bromo-4chloro-3-indolyl-phosphate/nitro-blue tetrazolium”) até o aparecimento do resultado da reação (cor azul púrpura).
5.8) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 37°C
Após a expressão da proteína recombinante a 37 ºC utilizando 500 mL de meio LB induzidos com 0,5 mM de IPTG, a cultura foi centrifugada por 20 min a 8.000 x g a 10 °C. O
mercaptoetanol, 10 % Glicerol pH 7,5) a fim de obter maior quantidade de proteína na fração solúvel.
A fração insolúvel do experimento, o corpo de inclusão, foi lavado com o tampão de lise, deoxicolato de sódio 2 % e água. A cada lavagem, a amostra foi submetida a pulsos em sonicador e centrifugada a 10.000 x g por 20 min e, após a última centrifugação, a amostra foi então utilizada para a purificação da proteína de interesse sob condição desnaturante.
5.9) Purificação por cromatografia de afinidade (Ni-NTA)
5.9.1) Sob condições desnaturantes
A purificação do corpo de inclusão foi feita em condições desnaturantes, em coluna de afinidade utilizando resina de matriz de níquel conforme instruções do fabricante (GE Healthcare). Após a lavagem, o corpo de inclusão foi ressuspendido em tampão desnaturante (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris.HCl e 6 M guanidina pH 8,0).A suspensão foi sonicada e centrifugada a 10.000 x g por 20 minutos. O sobrenadante foi filtrado e aplicado a coluna de afinidade. Após a ligação, a matriz foi lavada com tampões 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 6 M guanidina e pH, respectivamente, 6,3 e 5,9. A eluição da proteína foi feita em tampão 100 mM NaCl, 10 mM Tris, 6 M guanidina, pH 4,5.
5.9.2) Sob condições nativas
500mM NaCl, 40 mM imidazol, 2 % glicerol e 1 mM PMFS, pH 7.4) para remover contaminantes adsorvidos inespecificamente na resína de níquel. Por fim, as proteínas foram eluídas utilizando tampão de eluição (20 mM fosfato de sódio dibásico, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol e 1 mM PMFS, pH 7.4).
As proteínas foram dialisadas após a eluição para a remoção do imidazol utilizando tampão (20 mM de fosfato de sódio dibásico, 300 mM de NaCl, pH 7.4). Foi realizada uma diálise gradual trocando o tampão de diálise e reduzindo de 100 em 100 mM de NaCl a cada duas horas até a concentração final de 100 mM de NaCl.
5.10) Expressão da proteína capsidial do RSPaVa 25 °C
O experimento referente ao item 4.8 foi repetido diminuindo a temperaturas de indução a fim de diminuir a formação de agregados e obter a proteína de interesse na fração solúvel após a etapa de sonicação. Sob as mesmas condições de aeração e agitação o experimento foi realizado utilizando temperaturas de 25 ºC para a expressão. Para indução da expressão foi utilizado IPTG na concentração de 0,3 mM por 16h. Em seguida, o meio foi centrifugado por 20 min a 8.000 x g e 4 °C. O precipitado foi dividido em três tubos e três diferentes tampões de lise foram utilizados para sonicar cada amostra a fim de obter a proteína na fração solúvel após centrifugaçãopor 30 minitos a 20.000 x g a 10 ºC.
Os tampões utilizados foram:
Tampão A: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 % Triton X-100, 1 % Tween 20 pH 7,5)
Tampão B: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 % Glicerol pH 7,5)
O sobrenadante de cada tubo foi utilizado para purificação da proteína sob condição nativa utilizando resina à base níquel (Ni Sepharose High Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare).
5.11) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 17 ºC
O experimento referente ao item 5.8 foi repetido diminuindo as temperaturas de indução a fim de diminuir a formação de agregados e obter proteínas na fração solúvel após a etapa de sonicação. Sob as mesmas condições de aeração e agitação o experimento foi realizado utilizando a temperatura de 17 ºC para a expessão. Para indução da expressão foi utilizado IPTG na concentração de 0,3 mM por 16h. Em seguida, o meio foi centrifugado por 20 min a 8.000 x g e 4 °C. O precipitado foi dividido em três tubos e três diferentes tampões de lise foram utilizados para sonicar cada tubo a fim de obter a proteína na fração solúvel após centrifugação por 30 minitos a 20.000 g a 10 ºC.
Os tampões utilizados foram:
Tampão A: (10 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 % Triton X-100, 1 % Tween 20 pH 7,5)
Tampão B: (10 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 % Glicerol pH 7,5)
Tampão C: (10 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0,2 %N-Lauril Sarcosina pH 7,5)
5.12) Teste de expressão em meio auto-indutivo
Inicialmente 5 mL de pré inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 250 mL de meio auto-indutivo (ZYM-5052), que consiste de meio LB + canamicina e cloranfenicol 34g/mL + meio M (Na2HPO4 25 mM, KH2PO4 25 mM, NH4Cl 50 mM, Na2SO4 5 mM, MgSO4
2mM) + meio 5052 (0,5 % glicerol, 0,05 % glicose, 0,2 %α-lactose), contendo 50 µg/mL, de acordo com Studier, 2005. O tubo foi mantido sob agitação e aeração a 18 °C por 48 horas. Em seguida, o meio foi centrifugado por 30 min a 6.000 x g e 4°C. O “pellet” foi ressuspendido em 20 mL de tampão de lise (50 mM tampão fosfato, 200 mM NaCl, 1 mM PMSF, pH 8). A solução foi submetida a pulsos de 15 s a 300 W em sonicador para lise celular. Esta amostra foi centrifugada por 30 min a 20.000 x g a 10 °C. A fase aquosa foi coletada e utilizada para a purificação da proteína de interesse.
A purificação foi feita utilizando resina à base de níquel (Ni Sepharose High Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare).
5.13) Expressão utilizando estresse osmótico e choque térmico
Inicialmente 5 mL de pré-inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 250 mL
de meio líquido seletivo (LB + canamicina e cloranfenicol 30 e 34g/mL respectivamente),
contendo 0,5M NaCl e 1 mM betaína. O tubo foi mantido sob agitação e aeração a 37 °C até atingir a densidade ótica ideal. Para o choque térmico, o tubo foi submetido à temperatura de 47 oC por 20 minutos (contados a partir do momento em que o meio de cultura atingiu esta
