10.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinante VPg do SBMV usando o pacote de ferramentas EXPASY
O resultado da análise da proteína capsidial recombinante VPg utilizando o programa ProtParam (Figura 35), mostrou que ela é composta por 111 aminoácidos (com uma massa molecular de 12,295.6kDa), possui um ponto isoelétrico predito de 5.38 quando a cauda de histidina e a região polilinkerestão presentes. Após inserção do sítio de clivagem para TEV protease e remoção da cauda de histidina e região polilinker, ela apresenta 77 aminoácidos, massa molecular de 8,751.7kDa e ponto isoelétrico teórico de 4.29.
Figura 35. Sequência de aminoácidos da proteína VPg clonada emvetor pET28a. Os aminoácidos em
vermelho e grifados correspondem à sequência do vetor pET28a que contém a cauda de histidina; em preto e negrito correspondem à sequência de aminoácidos da VPg do SBMV.
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGST L P P D L S V I E I P
F E D V E T R S Y E F I E V E I K G R G K A K L G K R E F A W I P E S G
K Y W A D D D D D S L P P P P E V V D G K M V W T S A Q E
10.2) Expressão, purificação e concentração das proteínas VPg
O rendimento a partir de 1 L de cultura de células, após o processo de purificação foi: 3 mL de VPg a 7 mg/mL, totalizando 21 mg de proteína pura por litro de cultura.
A proteína VPg mostrou-se estável até à concentração de 11 mg/mL. A pureza das amostras foi verificada em SDS-PAGE 12 % e 15 % comomostra a figura 36.
Figura 36. SDS-PAGE 15% corado com comassie evidenciando pureza da VPg do SBMV.(M) Marcador
10.3) Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
10.3.1) Resultados DLS VPg
Os menores valores de raio hidrodinâmico (próximos de 10 nm) foram obtidos quando a VPg estava em tampão TrispH 7 e pH 8 e concentração de NaCl ou KCl maior ou igual a 150 mM (figuras 37 e 38).
Figura 38. Ilustração das medidas de
DLS da proteína VPg em tampão Tris 10 mM e 150 mM NaCl.
Figura 37. Ilustração das medidas de
DLS da proteína VPg em tampão Tris 10 mM e 150 mM KCl.
Figura 39. Plotagem de 20 aquisições de 20 segundos cada, referentes à proteína daVPg do SBMV.
Em tampão tris com pH 9 ou maior e em pH 6 ou menor evidenciou-se aumento no valor do raio hidrodinâmico. O mesmo aconteceu com concentração de NaCl e KCl menor que 100 mM. Após encontrar a melhor condição utilizando a técnica de DLS (Tris 10 mM e 150 mM KCl) uma nova purificação foi feita utilizando este tampão desde a etapa de sonicação, na tentativa de evitar agregação antes, durante e depois da etapa de purificacão, pois algumas proteínas uma vez agregadas podem não mais desagregar em seu estado nativo. As causas mais frequentes de agregacao não específica de proteínas são condições sub-ótimas dos solventes e contaminação por outras proteínas. Desta forma muito tempo foi gasto nesta etapa do projeto, pois mesmo apresentando alto grau de pureza e uma populacão protéica monomodal a amostra ainda permanecia com um RH relativamente alto. Tentou-se reverter a formação de agregados
incluindo cossolventes que desestabilizam as interações proteína-proteína. Foram usadas baixas concentrações de cossolventes carregados são usadas para evitar interações eletrostáticas que podem facilitar a agregação (SHARME, 2000; NEAGU, 2001; TIMASHEFF, 1998). Outra estratégia é a utilização de espécies caotrópicas que interagem com grupos peptídicos prevenindo interações intermoleculares que levam à agregação (LU, 2001; EDWIN, 2002; BALDWIN, 1996). A adição de açúcares e álcoois poli-hídricos que interagem com a proteína mais
fracamenteque com a água (TIMASHEFF, 1998), alguns aminoácidos, e agentes redutores como DTT e beta-mercaptoetanol, que inibem a formação de pontes dissulfeto não nativas, podem também prevenir a agregação de proteínas.
As placas dos experimentos que utilizaram a VPg apresentaram cristais em 14 condições e algumas delas podem ser visualizadas na figura 40.
Figura 40. Algumas condições em que a proteína VPg apresentou cristais.
A proteínaVPg quando em tampão contendo 150 mM de KCl cristalizou em 4 dias, diferente de quando estava em 150 mM de NaCl que necessitou de 21 dias para cristalizar.
A utilização de luz UV para diferenciação de cristais de sais e proteínas confirmaram a natureza proteica dos cristais (Cristais de sal não fluorescem sob Luz UV, ao contrário de cristais proteicos que fluorescem devido ao triptofano) como pode ser vizualiadonas figuras 41e 42.
Figura 41.Cristais de VPg fluorescendo quando iluminados por UV
Figura 42.Cristal de VPg
Mesmo conseguindo vários cristais de VPg e em diferentes condições, foram feitas otimizações tentando conseguir cristais maiores, uma vez que os maiores cristais tinham apenas
100 µm. Algumas placas otimizadas estão no Desy sob observação, assim como as placas dos experimentos de micro batch, micro seeding e streak seeding. Alguns cristais foram escolhidos pelo professor Christian Betzel e foram utilizados para testes de difração nas instalações do Petra III situado no Desy, onde há uma poderosa fonte de luzque possibilita a análise de cristais pequenos, pois gera raios X de altissíma intensidade. No entanto, não foi possível fazer um bom recolhimento de dados, desta forma iniciaram-se experimentos com a finalidade de remover os 34 aminoácidos codificados pelo pET28a, que incluem a his-tag. Mesmo conhecendo os inúmeros benefícios que as tags podem trazer à proteína, há relatos na literatura mostrando que a adição datag pode alterar a conformação proteica (CHANT et al., 2005), alterar a atividade biológica (FONDA et al,. 2002), e resultar em uma flexibilidade não desejada em estudos estruturais (SMYTH et al., 2003).
10.4)Amplificação da sequência codificador da VPg usando primers com sítio para TEV protease
Experimentos iniciais mostraram que o pET28a, contendo a sequência codificadora da VPg, não poderia ser usado como template para nova clonagem, uma vezque reações contendo pET28a vazio (C-) amplifica bandas de aproximadamente 200 e 300 pares de bases (figura 43).
Figura 43. Gel nativo de agarose 1 %.M: Marcador molecular DNA Ladder 100 bp (Invitrogen);C+:
reação controle utilizando como template o pET28a contendo sequência codificadora da VPg. C-: Reação controle onde o template é o pET28a (vazio) sem inserto.
Para superar este problema, folhas de feijoeiro infectadas pelo SBMV foram utilizadas para purificação do vírus. Após a purificação, partículas virais foram utilizadas como fonte de RNA,um cDNA foi feito utilizando o primer antissensoe utilizado como template da reação de PCR.
10.5) Purificação das partículas virais
Uma fração do vírus purificado foi observada em gel SDS-PAGE 12 % (Figura 44). Observou-se uma única banda de aproximadamente 30 kDa referente à proteína capsidial do vírus. A amostra não apresentou contaminante mostrando a eficiência do procedimento de purificação. A relação da leitura da absorbância à luz ultravioleta 260 nm/280 nm foi de 1,648.
Os dados de absorbância permitiram o cálculo da concentração viral que foi de aproximadamente 10 mg/ml.
Figura 44. SDS-PAGE 12% evidenciando a proteína capsidial das partículas virais purificadas. (M)
Marcador para proteínas Dalton Mark VII-L (Sigma), valores representados em kDa. (1) Proteína capsidial do SBMV.
10.6) Extração do RNA viral do SBMV
A partir do vírus purificado, o RNA viral foi extraído, purificadoe analisado em gel de agarose 1 % evidenciando banda com massa molecular de aproximadamente 4,2 kb,
correspondente ao RNA genômico do SBMVe evidenciando também poucos sinais de degradação (Figura 45).
Figura 45. Análise do RNA viral extraído de partículas purificadas de SBMV em gel de agarose 1 %.
(M): Marcador de tamanho molecular em kb; (R): RNA com 4,2kb.
10.7) Amplificação da sequ6encia codificadora da VPg a partir do cDNA
O RNA purificado foi utlizado na construção do cDNA e, então, utilizado como template em diferetes condições de PCR (figura 46).
Figura 46. Gel de agarose 1%evidenciandodiferentes reações de PCR utilizando cDNA como template.
(M): Marcador de tamanho molecular em kb; (1, 2, 3 e 4) Fragmento de 300 pb amplificado em diferentes reações de PCR.
Os fragmentos amplificados referentes ao gene da VPg (300 pb) foram clonados em vetores pET28a e pMAL-c2x. A confirmação da clonagem foi realizada utilizando plasmídios recombinantes digeridos durante 1 hora a 37 ºC com as enzimas Bam HI e Hind III. Como esperado, foi liberado um fragmento de DNA com mesmo tamanho do DNA amplificado (300 pb para VPg) como verificado na figura 47.
Figura 47. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando digestão enzimática dosvetores recombinates pET28a
e pMAL-c2x.. (M): Marcador molecular DNA Ladder 100 pb (Invitrogen). (1): Fragmento referente ao DNA plasmidial pMAL-c2x na parte superior do gel e fragmento liberado de aproximadamente 300 pb referente ao gene da VPg. (2): Fragmento referente ao DNA plasmidial pET28a na parte superior do gel e fragmento liberado de aproximadamente 300 pb referente ao gene da VPg.
10.8) Sequenciamentro e alinhamento VPg
Diferentemente das sequências referentes aos genes da CP do RSPaV e MP do SBMV, as sequências referentes ao gene da VPg, obtidas através da reação de Big Dye, apresentaram alinhamento desordenado, principalmente pela baixa qualidade das sequências obtidas quando utilizado o primer senso (Figura 48).
Figura 48. Alinhamento de uma única sequência obtida utilizando primer reverse comparada com a
sequência original do gene da VPg.
10.8.1) Refinamento do alinhamento utilizando BioEdit
Utilizando apenas as sequências obtidas utilizando primer reverse, foi possível fazer o alinhamento através do BioEdit, mostrando o sucesso na inserção do sítio da TEV protease. Figura 49.
Figura 49. Alinhamento das sequências referentes ao gene da proteína VPg do SBMV. A seta verde
indica a sequência de nucleotídeos referentes ao sítio da TEV protease.
10.9) Expressão e purificação da proteína do movimento
Testes iniciais de expressão e purificação da proteína do movimento utilizando pMAL- c2x não mostraram resultados satisfatórios e o estabelecimento de um protocolo ideal está em andamento.
10.9.1) Expressão e purificação da VPg utilizando pMAL-c2x
A proteína VPg fusionada à Maltose Binding Protein de 43 kDa foi expressa e purificada de acordo com os itens 6.1 e 6.2. Frações referentes às etapas de eluição foram aplicadas em
SDS-PAGE 12 % confirmando eficiência do processo de purificação como mostrado na figura 50.
Figura 50. SDS-PAGE 15 %evidenciando amostrasda VPg-MBPpurificada utilizando resina à base de
Amilose. (M) Marcador molecular; (1 a 7) Etapas da eluição utlizando tampão contendo 10 mM de maltose.
Esta proteína VPg-MBP foi concentrada e uma fração foi utilizada para ensaios cristalográficos como descrito no item 11. Outra fração foi utilizada para testes de digestão enzimática adicionando TEV protease como já descrito e pôde ser confirmado através de SDS- PAGE como mostrado na figura 51.
Figura 51. SDS-PAGE 15 % . (M) Marcador molecular; (1 e 2): amostras digeridas pela TEV protease
evidenciando bandas referentes à MBP (seta preta) e VPg (seta vermelha)
Após digestão enzimática, foi realizada uma nova purificação por troca iônica, utilizando colunas mono-Q acoplada ao AKTA purifier a fim de separar VPg, MBP e TEV protease. Esta etapa não foi eficiente, uma vez que a VPg se liga fortemente à coluna e sua eluição só é possível utilizando pH elevado a ponto de desnaturar a proteína. Para evitar a utilização da coluna mono- Q, a purificação foi realizada com sucesso utilizando expressão a partir do vetor pET28a como pode ser observado nos resultados item 10.8.2.
10.9.2) Expressão, purificação e concentração da VPg utilizando pET28a
A proteína VPg foi purificada primeiramente contendo a região polilynker e acauda de histidina. Posteriormente, a TEV protease foi utilizada para digestão proteica na proporção 1:50 e, em seguida, uma nova purificação foi realizada, removendo a protease e a tag. A pureza das amostras foi verificada em SDS-PAGE 15 % comomostra a figura 52. A digestão foi realizada na presença e na ausência de EDTA.
Figura 52. SDS-PAGE 15 % evidenciando digestão enzimática. (M) Marcador molecular; (A): VPg
fusionada à his-tag purificada; (B) VPg-his6 digerida com TEV protease. (seta preta = TEV protease; seta verde = VPg; seta vermelha = polylinker+his6);(C): VPg-his6 digerida com TEV protease na presença de EDTA; (D e E): VPg isolada.
Como observado na figura 52, a partir da proteína recombinante de 112 aminoácidos, foi possível remover os 34 aminoácidos codificados pelo pET28a (polilynker + 6His), permitindo a purificação de uma proteína VPg contendo 78 aminoácidos, com sequência idêntica à da proteína codificada pelo vírus na natureza. Esta remoção de aminoácidos alterou muito pouco o ponto isoelétrico da proteína, passando de 5.7 para 4.5, permitindo assim utilizar as mesmas condições de tamponamento já utilizadas em experimentos anteriores. O tamanho da proteína foi reduzido em aproximadamente 3,5 kDa, passando de 12,5 kDa para 9 kDa, aumentando significantemente sua solubilidade, conforme pôde ser verificado no seguinte experimento:500 µL de proteínas com e sem a tag foram concentradas até 20 mg/mL, centrifugadas por 15.000 x g por 30 minutos a 10 ºC e, em seguida, o precipitado ressuspendido em 10 µL de tampão de amostra para aplicação em SDS-PAGE 15 % (Figura 53).
Figura 53. SDS-PAGE 15 % comparando o precipitado de amostras contendo Histag e amostras com a
Histag removida. (M): Marcador molecular; (VH6): VPg fusionada a Histag precipitada a partir de amostras centrifugadas;.(V): VPg com Histag removida precipitada após centrifugação.
Utilizando comprimento de onda 260 nm e 280 nm, e gel de agarose corado com brometo de etídio, foi verificada total remoção de material genético da amostra.
10.10) Ensaios de cristalização
Mesmo com grandes avanços nas últimas décadas no campo da cristalografia, a obtenção de cristais adequados para coleta de dados ainda representa o "bottleneck" na determinação de estruturas. Infelizmente, a cristalização de proteínas ainda é um método de tentativa e erro que pode consumir muito tempo, por isso foram iniciados os “screenings” a partir da obtenção de soluções de proteínas estáveis e apenas as melhores condições com relação à pureza e polidispersividade foram utilizadas. As placas contendo os “screenings” iniciais das condições de cristalização realizados pelo método de difusão de vapor por gota sentada utilizando o robô
Honeybee 961 (Genomic Solutions Ltd) são checadas semanalmente. Experimentos realizados com a capa proteica não apresentaram cristais.
10.11) Efeito do TFE na estrutura secundária da VPg do SBMVmonitorado atravé de dicroísmo circular
As propriedades estruturais da VPg purificada na ausência e na presença de TFE foram investigadas por espectroscopia UV-CD. O espectro de CD da VPg na ausência de TFE apresentavam características estruturais de uma proteína intrinsecamente desordenada sendo seu mínimo próximo de 205 nm e uma elipicidade negativa em 190 nm (Figura 54). A Figura 51 mostra que a adição de TFE na solução tampão induziu a formação de α-hélice, baseada na elipicidade positiva a 190 nm, uma pequena mudança de 205 a 209 nm, e aumento na na elipicidade negativa a 222 nm. A tabela 2 representaas porcentagens de estruturas secundárias de VPg realizadas com o programa CONTINLL. Os cálculos de estrutura secundária são consistentes com a discussão feita anteriormente, indicando a propensão de formação de α-hélice com incremento de TFE, a partir de 8 a 15 %. Como resultado da formação de α-hélice, a porcentagem de estrutura aleatória diminuiu de 37 para 31%. Outras estruturas secundárias apresentaram ligeiras flutuações ou diminui com a adição de TFE, o que sugere que estas estruturas constituem um núcleo estável de VPg.
Tabela 2
Porcentagens de estruturas secundárias da proteína VPg na ausência e presença de TFE
TFE (%) α-hélice (%) Folha-β (%) Voltas(%) aleatórios (%) 0 8 31 24 37 10 8 33 23 36 20 9 35 23 33 30 15 32 22 31
Figura 54. Espectros de UV-CD da VPg na ausência (linha preta), presença de TFE 10 % (linha
vermelha), 20 % (linha laranja) e 30 % (linha amarela).
10.12) Interação da sonda ANS
A ligação da sonda ANS na proteína VPg foi monitorada utilizando espectroscopia de fluorescência no estado estacionário. A ANS é uma sonda que pode ser utilizada para investigar as mudanças estruturais em proteínas. Esta sonda apresenta uma elevada afinidade para ambientes hidrofóbicos em proteínas, dando origem a um aumento da fluorescência, significativamente com um deslocamento para o azul, característica da sua emissão máxima. O espectro de fluorescência da ANS em tampão fosfato de sódio aumentou na presença de VPg (Figura 55). Esta mudança na emissão de fluorescência para o azul é característico da ligação da ANS àsregiões em que a proteína está desestruturada. A presença de TFE em solução tampão provavelmente induziu a estabilização das estruturas secundárias da VPg, uma vez que o TFE compete por ligações de hidrogénio com moléculas de água, permitindo desse modo, que a proteína faça ligações de hidrogênio em sí mesma.
Figura 55. Espectro da emissão da fluorescência da sonda ANSligada à VPgna ausência (linha vermelha)
epresença de TFE 30 % (linha amarela). Emissão de ANS em tampão fosfato na ausência (linha preta) e presença de TFE 30 % ( linha laranja)
10.13) Efeito do dATP e TFE no raio hidrodinâmico da VPg.
Utilizando dATP 1mM, dATP 1mM combinado com TFE e TFE 30 % foi possível diminuir o raio hidrodinâmico da amostra de VPg purificada, obtendo valores muito similares no tamanho do complexo proteico, como pode ser observado nas figuras 56 a 57. Estes resultados indicam que dATP 1 mM e TFE 30%, podem, independentemente, reduzir o tamanho do complexo proteico. Mostra ainda, que a presença do TFE 10%, não diminui o raio hidrodinâmico do complexo proteico.
Figura 57. Ilustração das
medidas de DLS da proteína da VPg do SBMV na
presença de tampão contendo
Figura 56. Ilustração das medidas de DLS
da proteína da VPg do SBMV na presença de tampão contendo 1 mM dATP e 30 % TFE.
Figura 58.Ilustração das
medidas de DLS da proteína da VPg do SBMV na presença de tampão contendo 1 mM d ATP.
Figura 59. Ilustração das medidas de
DLS da proteína da VPg do SBMV na presença de tampão contendo 30 % de TFE.
10.14) NMR
Ressonância magnética nuclear de hidrogênio por diferença de transferência de saturação (STD-RMN) foi utilizada para avaliar a interação entre VPg e dATP, dCTP, dGTP, dUTP e adenina. Quando o experimento foi repetido utilizando dATP na ausência de VPg nenhum sinal foi observado. O local de ligação para cada nucleotídeo esta mostrado com suas respectivas porcentagens de STD. Para dATP (Figura 60-a), o próton do H em C8 foi encontrado como o principal responsável pela ligação da VPg. Outros locais de ligação detectados são os prótons de H no C1 ', C2' e C3 'da ribose. Quando a adição de 30% de TFE, temos observado o mesmo padrão como na figura 58-a. Para dCTP (Figura 60-b), o próton do H em C5 da pirimidinae os prótons de H em C1 e C2 parecem ser igualmente importantes para o reconhecimento da VPg. Para dGTP (Figura 60-c), o próton do H em C8 parece ter pouca importância na ligação da VPg. Assim como no caso de dCTP, os prótons de H em C1 e C2 são os principais responsáveis pela interação observada entre dGTP e VPg.. Estes resultados indicam que tanto dCTP como dGTP utilizam a ribose como os principais epitopos de ligação. Já o dATP, usa o motivo purina como a principal ligação e os resultados sugerem um reconhecimento molecular mais específico para este nucleotídeo.
Figura 60. Espectro de RMN de 1H mapeando locais de interação entre VPg e os ligantes: (a) dATP; (b) dCTP; (c) dGTP; (d) dTTP.