9.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinate da capa proteica do RSPaV usando o pacote de ferramentas EXPASY
O resultado da análise da proteína capsidial recombinante do RSPaV utilizando o programa ProtParam, mostrou que ela é composta por 294 aminoácidos (com uma massa molecular de 29197.1 Da), possui um ponto isoelétrico predito de 8.4, um índice de instabilidade predito de 47.16, classificando-a como instável, um índice alifático de 69.25 epredomínio dos aminoácidos Alanina (10,2 %) e Glicina (8,9 %) como evidenciado nas figuras 12 e 13.
Figura 12. Sequência de aminoácidos da proteína da capa proteica recombinante do RSPaV clonada
emvetor pET28a. Os aminoácidos em vermelho e grifados correspondem à sequência do vetor pET28a que contém a cauda de histidina; em pretocorrespondem à sequência de aminoácidos codificadas pela ORF5(capa proteica) do RSPaV.
Figura 13. Quantidade e porcentagem de cada aminoácido presente na CP do RSPaV.
A predição da estrutura secundária baseada na sequencia primária de aminoácidos da capa proteica do RSPaV pelo método de McGUFFIN, BRYSON; JONES (2000), utilizando o programa PSIPRED, mostrou uma estrutura secundária contendo predomínio de α-hélice em relação a β-folha e random coil como mostrado na figura 14.
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSM A S Q V G K L P S E
S N E A YE A R LK A L E L A R A Q K A P E V S SQ P P T L G G I L A K R K
R V I E N A LS K T V D M R E V L R H E S V V L S P NV M D E G A I D E L V
R A F G E S G I AE N V Q F D V A I D I A R R C S D V G SS Q R S T L I G K S
P F C E L N R S E IA G I I R E V T T L R RF C M Y Y A K I V W N I H L E T G
I P P A N W A K K G FN E N E K F A A F D FF L G V T D E S A L E P K G G
V K R A P T K A E M V A N IA S F E V K V L R Q T M A E G K R S S NL G E I
S G G T A G A L I N N P F A N VT H E
Figura 14. Predição da estrutura secundária a partir da sequência de aminoácidos da capa proteica do
9.2) Expressão da proteína a 37 ºC
Em SDS-PAGE 10% (Figura 15) ficou evidenciada a expressão de uma proteína com cerca de 29 kDa (~26 kDa referentes à proteína da capa proteica do RSPaV + 3.7 kDa referentes à sequência que contém a cauda de histidina codificada pelo pET28a). A proteína capsidial do RSPaV purificada sob condições desnaturantes usando resina à basede Níquel também foi aplicada no mesmo gel. A partir de agora, a proteína recombinante de 29 kDa, será denominada CP-RSPaV.
9.3) Western blot
Foram feitos dois SDS-PAGE idênticos, um foi corado com comassie (figura 13) e outro para realização de western blot (figura 16) utilizando anticorpo monoclonal anti-histidina, que reagiu especificamente com uma proteína de 29 kDa. Dessa forma, conclui-se que a proteína detectada é a de interesse.
Figura 15. SDS-PAGE 10% evidenciando expressão em E. coli e purificação da proteína capsidial do
RSPaV usando resina à base de Níquel. (M) Marcador molecular (Fermentas). Testes de Expressão: (1) Antes da indução com IPTG, (2) 3 horas após indução com IPTG 0,4 mM (3) Capa protéica recombinante do RSPaV purificada sob condições desnaturantes.
Figura 16. "Western blot" utilizando gel idêntico ao da figura 13 evidenciando reação imunológica com
anti-soro monoclonal anti – histidina (M) Marcador molecular BenchMark pré-corado (Invitrogen) Testes de expressão: (1) Antes da indução com IPTG. (2) 4 horas após indução com IPTG 0,5 mM.(3) Capa proteica Recombinate do RSPaV purificada.
Após confirmação da expressão da CP-RSPaV 37 ºC foram feitos experimentos a fim de obter a proteína na fração solúvel após a etapa de lise celular. Após nova expressão a 37 ºC, oextrato celular da foi dividido em dois tubos e cada tubo foi sonicado com um tampão de lise diferente:
Tampão A:
(100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 % Triton X-100, 1
% Tween 20 pH 7,5).
Tampão B:
(100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 % Glicerol pH 7,5)
A fração solúvel de cadaexperimento foi utilizada no processo de purificação da proteína sob condição nativa (item 4.9.2) e antes da etapa de eluição com Imidazol 5µL da resina foram coletados e aplicados no gel. Como controle, a fração insolúvel foi utilizada no processo de purificação sob condição desnaturante.
Como evidenciado na figura 17, não foi possível obter a proteína de interesse na fração solúvel, e a fração insolúvel utilizada como controle confirmou a presença da expressão da CP- RSPaV.
Figura 17. SDS-PAGE 12 % evidenciando expressão em E. coli e purificação da proteína capsidial
doRSPaV a 37 ºC. (M) Marcador molecular (Invitrogen). Testes de Expressão: (1) Antes da indução com IPTG, (2)3 horas após indução com IPTG 0,5 mM (3) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição desnaturante.(4) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise A. (5) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise B.
9.4) Expressão a 17 ºC e 25 ºC
Muito tem sido feito no sentido de obter metodologias que possibilitem e otimizem a expressão de proteínas solúveis. Uma das estratégias mais conhecidas para produção de proteínas recombinantes solúveis é a expressão a baixas temperaturas (SCHEIN, 1989). Sabe-se que as interações hidrofóbicas que levam à formação dos agregados protéicos são altamente favorecidas pelas altas temperaturas (KIEFHABER et al, 1991). Além disso, baixas temperaturas inibem a produção de “heat shock” proteases e aumentam a produção de chaperonas (FERRER et al,
2004). Algumas proteínas podem ser solubilizadas com agente não desnaturante (por exemplo, L- arginina, N-Lauril Sarcosina, Sulfobetaína, Tampão Tris pH 12,5 com ou sem uréia 2M).
As figuras 18 e 19 mostram que mesmo utilizando baixas temperaturas a CP-RSPaV permaneceu em corpos de inclusão utilizandos os tampões de lise A e B e D.
Tampão A: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 %
Triton X-100, 1 % Tween 20 pH 7,5)
Tampão B: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 %
Glicerol pH 7,5)
Tampão C: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0,2 %N-Lauril
Sarcosina pH 7,5)
Tampão D: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0.5 MSulfobetaína pH
7,5)
No entanto, o tampão C contendo baixa concentração do detergente N-Lauril Sarcosina foi eficiente na solubilização da proteína de interesse.
Figura 18. SDS-PAGE 12 % evidenciando os ensaios de solubilizaçãoda proteína capsidial doRSPaV
expressa a 17 ºC(M) Marcador molecular (Invitrogen).(1)5µL da resina coletados antes da etapa de
eluição sob condição desnaturante utilizados como controle da expressão.(2) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise A. (3) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise B.(4) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise C.(5) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise D.
Figura 19. SDS-PAGE 12 % evidenciando os ensaios de solubilizaçãoda proteína capsidial doRSPaV
expressa a 25 ºC(M) Marcador molecular (Invitrogen) (1)5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição desnaturante utilizados como controle da expressão (2) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise A (3) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise B (4) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise C (5) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise D.
9.5) Expressão utilizando extresse osmótico e choque térmico e expressão utilizando omeio auto-indutivo
indutivo proposto por STUDIER (2005) e a utlização dométodo do estresse osmótico e choque térmico proposto por OGANESYAN et al. (2006) não foram eficientes na obtenção da proteína de interesse na fração solúvel quando as células foram lisadas comtampão contendo 100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 % Glicerol pH 7.5.
Figura 20. SDS-PAGE 12 %(1)pellet bacteriano a partir de 30µL de cultura contendo células não
induzidas com IPTG. (2) pellet bacteriano a partir de 30µL de culturacrescida em meio auto-indutivo após 48h. (3) pellet bacteriano a partir de 30µL de cultura após 16h de indução com IPTG utilizando método do estresse osmótico e choque térmico. (4) pellet bacteriano a partir de 30µL de cultura após 3h de indução com IPTG 37ºCusado como controle. (M) Marcador molecular Invitrogen. (5) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando a fração solúvel do sonicado do extrato celular do meio auto-indutivo.(6) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando a fração solúvel do sonicado do extrato celular utilizando o método do estresse osmótico e choque térmico. (7) 30µLde cultura após 3h de indução com IPTG a 37 ºC.
9.6) Arctic Express
Embora baixa temperatura de cultivo seja uma estratégia para aumentar a expressão de proteína solúvel, as chaperoninas da E. coli, que facilitam oenovelamento adequado de proteínas,
perdem a atividade em temperaturas reduzidas. Alinhagem de céluas Arctic Express co-expressa Chaperoninas Cpn10 e Cpn60 adaptadas ao frio, a partir da bactéria psicrofílica, Oleispira antarctica. Estas chaperoninas têm alta atividade de enovelamentoa temperaturas 12 °C.
Os testes de expressão a 12 °C utilizando esta linhagem celular não foram eficientes na obtenção de proteínas na fração solúvel após a sonicação do extrato celular como mostra a figura 21.
O extrato celular induzido foi dividido em dois tubos e cada amostra foi sonicada com um tampão de lise diferente:
Tampão A:
(100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 % Triton X-100, 1
% Tween 20 pH 7,5). Tampão B:
(100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 % Glicerol pH 7,5)
A fração insolúvel foi utilizada no processo de purificação sob condição desnaturante como controle.
Figura 21. SDS-PAGE 12 %(M) Marcador molecular Invitrogen. (1) 5µL da resina coletados antes da
etapa de eluição da purificação da fração insolúvel, o corpo de inclusão, sob condição desnaturante. (2) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição da purificação da fração solúvel utilizando o tampão A. (3) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição da purificação da fração solúvel utilizando o tampão B.
9.7) Purificação e reenovelamento da proteína recombinante expressa a 37 ºC
Efetivamente, apenas 1 a 5 % das ORFs expressas em sistemas heterólogos tiveram suas estruturas resolvidas. Isso se deve, principalmente, à dificuldade de obtenção de proteínas solúveis (SHEN et al., 2005).Quando nenhuma das estratégias é eficiente e, as proteínas continuam presentes apenas nos corpos de inclusão, inevitavelmente, as metodologias envolvendo o uso de agentes desnaturantes passam a ser utilizadas. Os corpos de inclusão podem conter, além das proteínas, outros tipos de polipeptídeos, fosfolipídios e ácidos nucléicos, dependendo do sistema de expressão e condições de crescimento (VALAX; GEORGIOU, 1993). A presença desses contaminantes pode reduzir e prejudicar, significativamente, o processo de reenovelamento das proteínas de interesse (MAACHUPALLI-REDDYet al., 1997). Dessa forma, o corpo de inclusão foi lavado em etapas utilizando Triton X-100 a 1 %, deoxicolato a 2 % e
uréia 0,5 M. Esse procedimento adicional contribuiu significativamente para o sucesso nos experimentos de reenovelamento das proteínas. Após intensa lavagem do corpo de inclusão conforme mencionado no item 4.15 a pureza da proteína purificada conforme descrito no item 4.8 foi avaliada analisando gel de poliacrilamida 12 % (figura 22). Não existe um tampão universal para o reenovelamento, é necessário testar diferentes condições e limitar o que é mais eficiente para cada proteína (YASUDA et al., 1998). A melhor forma de reenovelamento, diálise ou diluição, não pode ser deduzida com base em propriedades moleculares das proteínas. O procedimento adequado deve ser determinado caso a caso (RUDOLPH; LILIE, 1996).
Na maioria dos tampões utilizados nos experimentos de reenovelamento houve precipitação total das proteínas, no entanto os tampões R3 e R8 a maior parte das proteínas permaneceram solúveis após 20.000 g 18 ºC por 60 min (Figura 23).
Figura 22. SDS-PAGE 12 % corado com nitrato de prata.(M) Marcador molecular (Invitrogen). (1) (2)
Figura 23. SDS-PAGE 12 % evidenciando sobrenadante dos testes de reenovelamento após 20.000 x g
por 60min. (M) Marcador molecular Invitrogen. 1,2,3,4,5,6,7 e 8 correspondem ao sobrenadante dos testes de reenovelamento com os tampões R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7 e R8 respectivamente.
9.8) Dicroísmo Circular
Os espectros do dicroísmo circular foram obtidos utilizando aparelho Jasco, de 190 a 260 nm, para estimar o conteúdo de estrutura secundária e a qualidade da proteína. Tendo em vista que os resultados fornecidos pelos métodos utilizados pelos programas SELCON3, CDSSTR, e CONTINL são similares, os valores apresentados relativos às frações de estrutura secundária da proteína refletem as médias dos resultados obtidos com os três programas. A deconvolução do espectro mostrou que a estrutura secundária continha (80 %) α-hélice, (3 %) folha-β, (10 %) voltas e (7 %) desordenado (Figura 24).
200 210 220 230 240 250 260 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 deg cm 2 decagrame -1 ) (nm)
Figura 24. Espectro do dicroísmo circular da capa proteica do RSPaV. A conformação da proteína
consiste em (80 %) α-hélice, (3 %) folha-β, (10 %) voltas e (7 %) desordenado.
9.9) Ensaios de Cristalização
As proteínas obtidas a partir da expressão a 17 ºC lisadas com tampão contendo N-Lauril Sarcosina (item 5.4) e as proteínas renoveladas utilizando o tampao R3 foram concentradas até 4 mg/ mL, aplicadas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (figura 25) para verificação da pureza e então iniciaram-se os ensaios de cristalização com os Kits Cristal Screen 1 e 2, testando 96 condições diferentes. As placas foram incubadas em sala refrigerada a temperatura constante de 18 °C e pôde-se perceber a presença de precipitados cristalinos, alguns precipitados escuros, e a presença de pequenos cristais em forma de agulha, no entanto nenhuma condição apresentou cristal difratável quando analisado no Laboratório Nacional de Luz Sincrontron. Essas placas estão sob intensa observação e algumas condições de refinamento estão em andamento com o objetivo de se conseguir cristais difratáveis para os futuros estudos estruturais.
Figura 25. SDS-PAGE 12 % evidenciando a proteína CP-RSPaV purificada. (M) Marcador molecular
Invitrogen.(1) CP-RSPaV reenovelada. (2) CP-RSPaV purificada sob condição nativa utilizando tampào de lise com 0,2 % de N-Lauril Sarcosina.
9.10) Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
É ideal que a amostra a ser cristalizada seja homogênea. DLS é uma técnica que permite estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Proteínas com distribuição monomodal têm maior probabilidade de produção de algum tipo de cristal. Se existir agregação entre moléculas isso é reconhecido pelo aumento do RH. A maioria
das soluções proteicas, tanto amostras de VPg como de CP, mostraram agregados protéicos com raio hidrodinâmico maior que 100 nm. No caso da CP, agregados maiores que 500 nm eram formados quando a proteína concentrada (5 mg/mL) era estocada por aproximadamente 24h a 4ºC. Variando-se concentração proteica, valores de pH, concentração salina e concentração de aditivos foi possível reduzir o RH em até 10 vezes chegando próximo a 10 nm. Diferentes sais
foram utilizados nos tampoes das amostras de proteínas baseando-se na série de Hofmeister (Fig 24), que ordena os íons de acordo com suas propriedades cosmotrópicas/caotrópicas. Ânions cosmotrópicos e cátions caotrópicos estabilizam proteínas, enquanto ânions caotrópicos e cátions cosmotrópicos as desestabilizam (ZHAO, 2005; YANG 2009). Ânions e cátions cosmotrópicos são formadores da estrutura da água (“water structure-makers”), fortemente hidratados, possuem uma forte interação com as moléculas de água. Esses íons proporcionam uma camada de hidratação muito bem estruturada e coesa e levam ao efeito salting-out, ou seja, solubilizam proteínas. A posição de um íon na série de hofmeister é determinada essencialmente pelo seu grau de hidratação.
Figura 26. Serie de Hofmeister, as espécies à esquerda do ânion Cl- são chamadas de cosmotrópicos, enquanto as especies à direita são chamadas caotrópicos.
Ao contrário do cosmotrópico um ânion caotrópico como o SCN- possui baixa afinidade pela água e alta polarizabilidade, preferindo assim ligar-se à interface água-proteína, desestabilizando a estrutura proteíca (COLLINS; NEILSON; ENDERBY, 2007). Cátions possuem um efeito relativamente menos dominante que ânions com mesma densidade de carga, pois, os últimos são mais polarizáveis e mais fortemente hidratados (COMBARIZA; KESTNER; JORTNER, 1994, GROSSFIELD; REN; PONDER, 2003).
9.10.1) . Resultados DLS CP RSPaV.
Utilizando tampões Tris 10 mM e 150 mM KCl 1 mM DTT pH 7.0,Tris 10 mM e 150 mM NaCl 1 mM DTT pH 7.0 ou Tris 10 mM e 150 mM NaF 1 mM DTT pH 7.0, foram obtidos resultados semelhantes com relação ao raio hidrodinâmico (Figuras 27 e 28).
Figura 28. Plotagem de 10 aquisições de 10 segundos cada referentes à proteína da Capa Proteica do
RSPaV.
Estes resultados mostram que mesmo conseguindo diminuir o raio hidrodinamico das amostras proteicas ainda não foi obtida total desagregação. A tendência de agregação de proteínas de capsídios já foi, muitas vezes, relatada na literatura tanto para vírus humanos como vírus vegetais. Existem dúvidas sobre o processo termodinâmico da montagem do capsídio a partir das proteínas da capa proteica. (BANCROFT, 1967; ZANDI et al., 2004). De fato, para muitos vírus, incluindo Hepatitis B virus da (HBV), Human Papilloma virus (HPV), Cowpea Chlorotic Mottle virus, BromeMosaic virus, Broad BeanMottle virus, Sindbis virus, and Tobacco Mosaic virus (TMV), proteínas da capa proteica formam espontaneamente capsídios em determinadas concentrações, salinidade, pH e temperatura (CERES and ZLOTNICK, 2002; ZANDI and REGUERA, 2005; WINGFIELD et al., 1995). Sabe-se que altas concentrações de determinados sais evitam o self-assembly de proteínas formadoras de capisídio (BANCROFT et al., 1967) assim como a remoção de Ca 2+ (SPEIR et al., 1995). No entanto mesmo associando-se às condições de alta força iônica (>500mM NaCl) a agentes quelantes (por ex: EDTA, o qual quela o cálcio em pH maior que 7) não foi possível obter amostras com RH menores que 10 nm.
9.11) Amplificaçao usando primers com sítio para TEV protease
Os mesmos plasmídeos utilizados nestes experimentos de expressão e purificação foram incluídos nas reações de PCR utilizando os primers com sítio de clivagem para TEV protease. Inicialmente apresentaram-se alguns problemas relativos àdimerização dos primers que foram solucionados com adição de 5 % de DMSO na reação e possibilitando a amplificação de uma única banda como é evidenciado na figura 29.
Figura 29. Gel de agarose 1% evidenciando amplificação da sequência relativa a CP do RSPaV. (M)
Marcador Molecular Fermentas Middle Range. (A), (B) (C) e (D) produto amplificado.
9.12) Clonagem do fragmento da cp em vetor pMAL
A sequência codificadora da Capa Proteica do RSPaV foi amplificada utilizando primers com sítios para Bam HI e Hind III e em seguida clonada em vetor pMAL. Após clonagem uma
digestão utilizando as mesmas enzimas foi realizada para de investigar a presença do inserto liberado para confirmação do sucesso do experimento (figura 30).
Figura 30. Gel de agarose 1,5% evidenciando liberação do fragmento de aproximadamente 800 pb
referente à sequência codificadora da CP do RSPaV clonada em vetor de expressão pMAL. (M) Marcador molecular Fermentas Middle Range. (C) Plasmídeo Controle digerido apenas com enzima Bam HI. (P) Plasmídeo digerido com enzimas Bam HI e Hind III.
Para confirmar a inserção do sítio de clivagem para a TEV protease, as amostras foram sequenciadas e alinhadas utilizando o e o Multalin: (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html). Um refinamento das sequências obtidas com baixa qualidade foi realizado utilizando oBioEdit Sequence Alignment Editor.
9.13) Sequenciamento do gene da capa preteica do RSPaV, confirmando sucesso na inserção do sítio de clivagem para TEV protease
O gene daproteína capsidial do RSPaV que foi expressa, purificada e submetida a ensaios cristalográficos, foi sequenciado utilizando os mesmos primers usados na clonagem. O sequênciamento nos dois sentidos de leitura permitiu um alinhamento que confirmou a presença do sítio da TEV protease como mostrado na figura 31.
Figura 31. Alinhamento das sequências referentes ao gene da capa proteica do RSPaV. A seta verde no
9.14) Purificaçãoda TEV protease
Figura 32. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostrasda TEV purificada utilizando resina à base de Níquel.
(M) Marcador molecular; (1,2,3 e 4) Etapas da eluição da TEV protease.
9.15) Digestão enzimática das proteínas expressas clonadas em vetor pET28a (his-tag) e vetor pMAL (MBP) utilizando TEV protease
Após inserção do sítio de clivagem para TEV protease, as proteínas foram expressas e purificadas como já descrito, e então utlizadas para testes de clivagem, que envolveu proteínas codificadas pelas sequências inseridas no vetor pET28a e em vetor pMAL.
Figura 33. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostras proteicas após purificação e e digestão com TEV
protease.(A1) Amostra controle contendo proteína CP do RSPaV de 28 kDa fusionada à Maltose binding protein de 43 kDa, totalizando uma massa molecular de aproximadamente 71 kDa.; (A2) Amostra contendo proteína CP do RSPaV fusionada à MBP misturada com TEV protease por 16h a 4 ºC; (A3) Amostra contendo proteína CP do RSPaV fusionada à MBP misturada com TEV protease por 16h a 22 ºC; (M) Marcador Molecular GE protein mixture.; (B1) Amostra controle contendo proteína CP do RSPaV fusionada à His-tag. (B2) Amostra contendo proteína CP do RSPaV misturada com TEV protease por 16h a 4 ºC; (A3) Amostra contendo proteína CP do RSPaV fusionada à His-tag misturada com TEV protease por 16h 22 ºC.
Como observado na figura 34, a digestão foi eficiente apenasem experimentos envolvendo proteínas expressas utilizando vetor pMAL, a qual é fusionada à MBP. A digestão não foi eficiente nos experimentosenvolvendo a proteína contendo his-tag, provavelmentedevido à presença do detergente N-Lauril Sarcosina, o qual pode não ter sido totalmente removido durante as etapas de diálise, prejudicando a atividade da protease.
Após digestão utilizando a TEV protease aproteína de interesse foi isolada utilizando resina à base de Níquel e posteriormente resina à base de amilose.
Figura 34. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostras proteicas após purificação,e digestão com TEV
protease e posterior isolamento do fragmento de interesse (1) Maltose binding protein de 43 kDa; (M) Marcador Molecular GE protein mixture.; (2) Amostra contendo proteína CP do RSPaV fusionada à MBP antes da adição da TEV protease.; (3) Amostra contendo proteína CP do RSPaV fusionada à MBP 16 h após adição da TEV protease.;(4) Amostra contendo a Proteína CP do RSPaV isolada da Maltosee TEV protease.
9.17) Ensaios de cristalização após digestão utilizando TEV protease.
Após isolamento do fragmento de interesse, correspondente à proteína capisidial do