6.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína VPg recombinate do SBMV usando o pacote de ferramentas expasy.
As análises foram feitas de acordo com o item 5.1.
6.2) Testes de expressãoda VPg
A expressão da proteína VPg foi realizada utlizando BL21-RIL de E. coli transformadas com o vetor pET28a contendo a sequência que codifica a VPg do SBMV. A indução das céluas crescidas em meio líquido seletivo (LB + canamicina e cloranfenicol 30 g/mL) foi realizada utlizando IPTG 0,3 mM e a 18º C, como já mencionado 5.11.
Para a realização dessa etapa, foi feito uso de FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) pelos métodos tradicionais de afinidade utilizando resina à base de níquel e cromatografia por exclusão molecular utilizando AKTA purifier. Os experimentos envolvendo espalhamento de luz foram também conduzidos de acordo com o item 5.20.
6.4) Ensaios de cristalização VPg
Os “screenings” iniciais das condições de cristalização foramrealizados pelo método de difusão de vapor por gota sentada utilizando o robô Honeybee 961 (Genomic Solutions Ltd). A temperatura de incubação foi 20 C.
Os kits utilizados foram JSCG+ (Qiagen), Pact Suite 2 (Qiagen), Morpheus (Molecular Dimensions) e para cada uma das 96 condições de cada Kit foram aplicadas solução de proteínas concentradas e soluções de precipitante na proporção 1:1 e 1,5: 1, totalizando 192 condições por Kit. Para cada Kit foram utilizadas proteínas concentradas nas seguintes condições:
a) VPg a 7 mg/mL em tampão Tris 10mM e 150 mM NaCl pH 7,0. b) VPg a 10 mg/mL em tampão Tris 10mM e 300 mM NaCl pH 7,0. c) VPg a 7 mg/mL em tampão Tris 10mM e 150 mM KCl pH 7,0. Totalizando 2592 condições.
6.5) Inserção do sítio de clivagem para TEV protease
As etapas de clonagem envolvendo a inserção do sítio de clivagem para a TEV protease foram também realizadas para as proteína VPg do SBMV, de acordo com o item 5.20. No caso da VPg, particularmente, foi usado síto para Xho I no primer antisenso.Os primers utilizados estão mencionados abaixo, com sítios para TEV protease em negrito e sítios para Bam HI e XhoI grifados.
Primer Senso:
GGATCCGGTGAAAATTTATATTTTCAAGGTATGAGCTATCGTTTCCTA Primer anti senso:
TGGACTTCAGCTCAGGAATGACTCGAG
6.5.1) Amplificação dos genes das proteínasVPg utilizando primers com sítio para TEV protease
Para amplificação do gene de interesse, foram realizados experimentos de acordo com o item 5.22. Particularmente, na reação de amplificação do gene da VPg utilizando o pET28a recombinante (pET28a contendo a sequência que codificara da VPg do SBMV) como template, o controle negativo da reação (pET28a sem inserto) apresentava amplificação defragmentos de tamanhos próximos à ORF codificadora da VPg (200 e 300 pb), impossibiltando a continuidade do experimento. Para superar este problema, parículas virais foram utilizadas como fonte de RNA. Utilizando primer reverse, foi feito novo cDNA, o qual foi utilizado como template da reação de PCR como descrito abaixo.
6.5.2)Purificação das partículas virais
Folhas de Feijoeiro Phaseolus vulgaris (L) ‘Jalo’ infectadas pelo SBMV-SP foram trituradas em liquidificador com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 7,2, contendo 0,5% 2-mercaptoetanol. A solução foi filtrada em gaze, clarificada com clorofórmio (0,5 ml/g de folha) e centrifugada 20 minutos a 16.000 g e 4°C. O vírus foi precipitado pela adição de polietilenoglicol (PEG 8000) a 10% e NaCl 1,0%, sob agitação por 2 h a 4°C, e então centrifugado por 10 min a 16000 g e 4°C. O sedimento foi ressuspendido em 1/10 do volume inicial de tampão fosfato 0,01 M pH 7,2 e submetido a um ciclo de baixa e alta rotação (16000
g/10 min e 100000g/90min). O “pellet” final foi ressuspendido em tampão fosfato e aplicado em gradiente de sacarose (10-50%) em tampão fosfato 0,01 M pH 7,2. por 1:30 h a 100000 g. A banda formada pelo vírus purificado foi coletada, diluída e ultracentrifugada por 1 h a 100000 g, dissolvendo-se o sedimento final em 1 ml de tampão fosfato0,01 M pH 7,0. O vírus purificado foi submetido à leitura em espectrofotômetro sob comprimento de onda de 260 e 280nm (luz ultravioleta) para determinação da concentração viral, utilizando o coeficiente de extinção do SBMV cujo valor é 6,0 em leitura a 260nm (SEHGAL, 1981).
6.5.3) Obtenção de RNA viral
O RNA foi obtido a partir de partículas purificadas do SBMV. A extração do RNA viral foi feita utilizando-se o “RNeasy Plant Mini Kit” conforme especificações do fabricante (QIAGEN). O extrato foi eluído em água DEPC e estocado a -20°C.
6.5.4) Produção de cDNA
Oligonucleotídeo antissenso baseado no modelo do item 4.2 e o RNA viral foram desnaturados por aquecimento a 94°C por 10 min, imediatamente resfriados em gelo, e, em seguida os demais componentes foram adicionados. A reação teve volume total de 20 µl, consistindo de: 50 mM Tris.HCl pH 8,3; 75 mM KCl; 10 mM DTT; 0,1 mM cada dCTP, dGTP, dATP, dTTP; 0,4 µM do oligonucleotídeo, 2 unidades de inibidor de RNAse; 1µg RNA viral e 40 unidades de Transcriptase Reversa “Superscript II” (Invitrogen). A reação permaneceu incubada por 2 h a 42°C. Este cDNA foi utilizado como template de acordo com o item 4.3.
6.6) Clonagem do vetor com sítio para TEV protease em vetor pET28a
Idem itens 5.22.2 e 5.23.
6.6.1) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressãopET28a
Idem item 5.23.
6.6.2) Ligação do DNA em vetor de expressãopET28a
Idem item 5.23.2.
6.6.3) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pMAL
Idem item 5.23.3.
6.6.4) Ligação do DNA em vetor de expressãopMAL
Idem item 5.23.2.
Idem item 5.26.
6.8) Purificação do plasmídeo recombinante
Idem item 5.25.
6.9). Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5)
Idem item 5.26.
6.10) Sequenciamento dos vetores contendo a sequência codificadora da VPg do SBMV após inserção do sítio de clivagem para TEV protease
Idem item 5.27.
6.11) Expressão e purificação da VPg clonadaem pMAL-c2x
A expressão das proteínas foi realizada utlizando BL21-RIL de E. coli como já descrito no item 5.28.1. A indução das céluas crescidas em meio líquido seletivo foi realizada utlizando IPTG 0,25 mM e a 18 ºC.
6.11.2) Purificação da VPg clonadaem pMAL-c2x
Idem item 5.30.2.
6.12) Digestão enzimática utilizando TEV protease
Idem item 5.29.
6.13) Purificação da proteína após digestão pelaTEV protease
Idem item 5.31.
6.14) Expressão e purificação daproteína VPg clonada em pET28a
6.14.1) Expressão da VPg clonada em pET28a
6.14.2) Purificação da VPg clonada em pET28a
A purificação foi realizada utilizando tampão de lise celular consistindo de 30 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 1 mM PMSF, e 100 mM de Arginina, pH 7,5. Após 30 minutos de
rotação a 17.000 g, adicionou-se polietilenamina atingindo-se a concentração final de 0,1% e a amostra foi submetida novamente a 17.000 x g por 30 min e 4 ºC. A remoção de contaminantes foi realizada utilizando tampão de lavagem contendo 50 mM NaH2PO4, 500 mM KCl, 1 mM
PMSF,40 mM de imidazolpH 7,5 e. A eluição foi realizada utilizando tampao 30 mM Tris, 200 mM KCl, 1 mM PMSF, 250 mM de Imidazol pH 7,5.
Dez mL de solução, contendo a proteína eluída, foram dialisados contra tampão de diálise contendo 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl por 16 h e posteriormente adicionou-se EDTA e DTT
alcançando as concentraçõesde 1 mM e 0,5 mM respectivamente.
A proteína foi concentrada utilizando-se Centricon-30 (Millipore) e posteriormente submetida à digetão enzimática utilizando TEV.
Após remoção da sequência de aminoácidos codificados pelo pET28a a amostra proteica foi concentrada e diferentes concentrações foram utlizadas em testes de cristalização utilizando o método “hanging-drop”.
6.15) Efeito do TFE e dATP no raio hidrodinâmico das amostras proteicas.
Amostras contendo 10 mg/mL de VPg purificada, em tampão 10 mM tris e 50 mM de NaCl foram analisadas após a adição de diferentes concentrações de dATP, e TFE (2,2,2- trifluoroethanol). Foi realizado o cálculo do raio hidrodinâmico de amostras que ficaram 16 h na presença dos reagentes e também imediatamente após a adição dos reagentes.
6.16) Verificação do efeito do TFE na estrutura secundária da VPg através de dicroísmo circular.
Espectros UV foram registrados a temperatura ambiente em equipamento Jasco J-710 (Jasco, Tóquio, Japão), equipado com célulasde quartzo com caminho óptico de 0,5 milímetros. Os espectros foram registrados na faixa de 190 a 260 nm, utilizando varredura de 50 nm/min, tempo de resposta de 1,0 segundo, largura de banda espectral de 1,0 nm e resolução espectral de 0,1 nm. Para cada espectro foram realizados 7 acumulações. A concentração de 30 uM de VPg foi mantida constante durante todo o experimento. A adição de 2,2,2-trifluoroetanol (TFE, Sigma) foi realizada na faixa 0 – 30%, com incrementos de 10% (vol: vol). Todos os espectros foram corrigidos subtraindo dos respectivos espectros de tampão. Porcentagens de estrutura secundária, para cada condição testada, foram calculados com o software do pacote CONTINLL CDPro, usando o conjunto de referências de proteínas SMP56 (SREERAMA; WOODY, 2000).
6.17) Ligação da sonda de sulfonato de naftaleno-1-8-anilina (ANS)
As medidas de fluorescência de estado estacionário foram obtidas no espectrofluorímetro ISS PC1 (Champaign, IL, USA) equipado com cubeta de quartzo com caminho ótico de 10 mm.Ambas as larguras de banda, de excitação e de emissão, foram fixados em 8,0 nm. O comprimento de onda de excitação a 370 nm, foi escolhida uma vez que ela proporciona a excitação só de ANS. O espectro de emissão foi recolhido na faixa de 390-700 nm, com o incremento de 1 nm. Cada ponto no espectro de emissão é a média de 10 acumulações. A ligação da sonda ANS (250 uM) - VPg (100 uM) foi monitorada na ausência e na presença de 30 % de TFE (vol: vol). Como um espectro de referência, a emissão ANS também foi analisada em solução tampão na ausência e na presença de 30 % de TFE.
6.18) Análise da interação entre VPg e possíveis ligantes
A técnica de RMN que analisa a diferença de transferência de saturação, STD (Saturation Transfer Difference) (MAYER; MEYER, 1999) é uma das mais sensíveis para caracterizar interações não covalentes entre ligante e proteína. À medida que o ligante interage com a proteína, recebe desta uma transferência de magnetização e torna-se cada vez mais saturado de acordo com o tempo de saturação usado. A saturação de cada ligante é medida antes e após a transferência de magnetização, resultando na diminuição do sinal dos ligantes. Pela diferença entre os espectros com e sem polarização, somente o ligante que interagir com a proteína mostrará sinal no espectro STD. Possíveis interações entre VPg e ligantes foram análisadas através da técnica de ressonância magnética nuclear de hidrogênio por diferença de transferência de saturação (STD-RMN) foi utilizado para este fim. Os experimentos foram realizados em espectrómetro Bruker de 600 MHz, equipado com uma crio-sonda. A amostra foi preparada em 50 mM de tampão de fosfato deuterado. A concentração de proteínas foi ajustada para 15 uM, e cada possível ligante foi utilizado na concentração de 300 uM. A fim de obter a melhor saturação de proteína, a sequência de pulsos stddiffesgp.3 foi utilizada com 4.096 escaneamentos, on- ressonância de 0,5 ppm, off- ressonância em 40 ppm, filtro spin lockde 30 ms, o tempo de saturação de 2 segundos e o nível de potência de pulso de 35 dB. O experimento foi repetido na presença de 30 % de TFE para verificar se as alterações conformacionais poderiam prejudicar a ligação. Além disso, o experimento foi realizado sem a proteína, a fim de verificar a existência de possíveis artefatos.