A vassoura de bruxa é sempre associada a quadros socioeconômicos graves nas áreas nas quais ocorre. Diante desta situação, foram testadas algumas estratégias de controle do fungo. Na Bahia, por exemplo, dentre estas tentativas, apostou-se em uma das formas mais usuais de controle de fitopatógenos: a aplicação de fungicidas no campo. Diversos fungicidas foram testados, incluindo drogas da classe das estrobilurinas, no entanto, sem sucesso (Pereira, G. A. G.; comunicação pessoal).
As primeiras constatações de que, em condições de campo, o fungo resistia ao tratamento com estobilurinas, foram feitas na mesma época em que as primeiras sequências do genoma de M. perniciosa foram obtidas. Essa observação foi corroborada in vitro, no entanto, nenhuma mutação no gene do citocromo b (Mp-cytb) foi detectada, sugerindo que mecanismos adicionais figuravam no fenótipo de resistência do patógeno.
Ainda com dados de sequenciamento Sanger, foi identificada uma cópia única do gene codificante de uma oxidase alternativa (Mp-aox) no genoma de M. perniciosa. Essa proteína, como discutido anteriormente, é uma enzima chave da cadeia alternativa de transporte de elétrons mitocondrial (Figura 2). Experimentos realizados pelo grupo demonstraram que a inibição da via principal de transporte de elétrons pelas estobilurinas (que inibem o complexo III), resulta na indução da AOX (Thomazella et al., 2012). A AOX catalisa a transferência de elétrons da ubiquinona ao oxigênio molecular, transpassando o sítio inibido pela droga (complexo III) (Thomazella et al., 2012). Essa via, denominada via respiratória alternativa, limita a efetividade das estrobilurinas in planta (Fernández-Ortuño,
et al., 2008). Neste cenário, propôs-se que a enzima MpAOX tem papel importante na
resistência às estrobilurinas em M. perniciosa. Além disso, estudos adicionais (Thomazella et
al., 2012) demonstraram que essa enzima é um alvo promissor para o controle da doença
vassoura de bruxa (Figura 5).
Thomazella et al. verificaram que M. perniciosa apresenta-se resistente a estrobilurinas em ambas as fases miceliares (fase biotrófica e fase necrotrófica). Além disso, o micélio biotrófico mostrou-se bastante sensível a um inibidor da AOX, o SHAM (salicylhydroxamic acid), o que concorda com o fato de que o este estágio miceliar é muito dependente da respiração alternativa. Notavelmente, a inibição das duas vias respitatórias
(principal e alternativa) impediu o crescimento de ambas as fases miceliares do fungo, o que provê uma forte evidência do que pode ser uma promissora estratégia para o controle da vassoura de bruxa (Figura 5). Além disso, investigações do grupo de pesquisa do laboratório evidenciaram que essa estratégia é também promissora contra diversos outros fungos fitopatogênicos (Figura 6).
Figura 5 - Inibição do crescimento de M. perniciosa na presença de estrobilurina e um inibidor da AOX – Em
ambas as fases miceliares, o tratamento com estrobilurina (Azoxistrobina - 1mg/L) não impede o crescimento do micélio. A fase biotrófica, que apresenta maior nível de expressão do gene Mp-aox, é consideravelmente sensível ao inibidor da AOX, o SHAM, enquanto que a fase necrotrófica cresce sem efeitos maiores na presença desse inibidor. O uso combinado dos inibidores da via respiratória principal e alternativa inibe completamente o crescimento de ambas as fases miceliares do patógeno, evidenciando uma estratégia promissora para o controle da doença vassoura de bruxa do cacaueiro. Figura adaptada de Thomazella et al., 2012.
Figura 6 – Estratégia promissora para o controle de fitopatógenos – A combinação de estrobilurinas com um
inibidor da AOX, além de ser efetiva na inibição do crescimento de M. perniciosa, também se mostrou muito promissora no que se diz respeito a diversos outros fungos e oomicetos fitopatogênicos. Observa-se que a combinação de Azoxistrobina (Azo) em diversas concentrações com o SHAM (condições destacadas pelo quadro verde) impede o desenvolvimento dos microrganismos em questão, os quais não tem o crescimento inibido pela estrobilurina apenas. De cima para baixo: Colletotrichum gloeosporioides, patógeno da manga, mamão, maracujá e goiaba; Guignardia citricarpa, causador da “mancha negra” dos citrus; Phytophthora infestans¸que infecta batata e tomate; Sclerotinia sclerotiorum, o “mofo branco” da soja e Venturia pirina, infectante da pêra. Figura por Natália M. Costa e Paulo J.P.L. Teixeira.
Apesar do potencial tecnológico relacionado à combinação de inibidores da cadeia respiratória principal e alternativa, os atuais inibidores da AOX não são suficientemente estáveis para uma potencial utilização em campo. Assim, a identificação de novas drogas é fundamental para tornar esta estratégia viável. Em paralelo, outra iniciativa de fundamental importância é a produção de conhecimento sobre fatores adicionais associados à resistência a estrobilurinas, cuja proposição como alvos de inibição pode potencializar a utilização desses fungicidas bem como assistir o desenvolvimento de novas classes de moléculas antifúngicas. Neste cenário, no presente trabalho, foram conduzidas análises do transcriptoma do fungo tratado com fungicida, a fim de aprofundar o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na determinação de resistência a estrobilurinas em M.
OBJETIVOS
O projeto teve como objetivo geral a caracterização das bases moleculares, genes individuais e vias, envolvidos na resistência a estrobilurinas em M. perniciosa. O trabalho ramificou-se em duas frentes:
A principal frente compreendeu: Capítulo I
1. Análise dos efeitos do tratamento com fungicida no transcriptoma de M. perniciosa (isolado FA553) através da técnica de RNA-seq;
1.1 . Análise do remodelamento metabólico frente à inibição da cadeia respiratória mitocondrial.
1.2 . Identificação de genes tipicamente responsivos à presença de drogas (por exemplo, transportadores de droga e citicromos P50) e potenciais alvos de intervenção;
Em paralelo, a segunda frente incluiu: Capítulo II
1. Caracterização inicial de um isolado de M. perniciosa (NMC01) com fenótipo de resistência aumentada a estrobilurinas.
1.1. Avaliação preliminar do transcriptoma e do genoma deste isolado visando à identificação da base molecular responsável pela resistência a estrobilurinas
CAPÍTULO I – Investigação dos mecanismos moleculares associados à tolerância