Testes de consumo de oxigênio

Alíquotas de 1 mL das culturas (induzida e não induzida) foram pelletadas e ressuspendidas em meio YPG (20 g/L de peptona, 10 g/L de extrato de levedura, 3% glicerol). As amostras foram aeradas por inversão do tubo e transferidas para a câmara do oxígrafo, onde permaneceram sob agitação. Os padrões de consumo de oxigênio foram comparados entre as leveduras com a produção da proteína induzida e aquelas cuja expressão da oxidase alternativa não foi induzida. Nas condições avaliadas, as células foram submetidas à adição de antimicina A (inibidor da cadeia respiratória principal - 10 μM) ou sua combinação sequencial com o SHAM (inibidor da cadeia respiratória alternativa - 2,5 mM). Os consumos foram medidos polarograficamente utilizando-se um eletrodo do tipo Clark acoplado a um oxígrafo Hansatech. Os experimentos foram realizados em duplicata e os gráficos mostrados são representativos dos resultados observados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nos experimentos de consumo de oxigênio, inicialmente foram comparadas as taxas de respiração das leveduras induzidas e não induzidas após a adição de um inibidor da cadeia respiratória principal (Antimicina A, inibidor do complex III do transporte de elétrons). Os experimentos cujos resultados são mostrados na figura 1 fizeram parte do estágio de graduação dos alunos Christopher Koyama e Letícia Theodoro.

Figura 1 - Teste de atividade da oxidase alternativa de Pichia pastoris – A) Observa-se que a adição de

Antimicina A inibe o consumo de oxigênio das leveduras que não tiveram a expressão da oxidase alternativa induzida. B) As leveduras induzidas, por sua vez, revelaram a atividade da via respiratória alternativa. A expressão da oxidase alternativa permite que a levedura continue consumindo oxigênio mesmo após a adição do inibidor da cadeia principal. A adição subsequente de SHAM, inibidor da AOX, reprime significativamente a respiração. Os experimentos foram realizados em duplicata e os gráficos são representativos dos resultados observados.

O experimento revelou que a taxa de consumo de oxigênio da levedura que não teve a expressão da oxidase alternativa induzida é bastante afetada pela inibição da cadeia

respiratória principal com Antimicina A, em comparação com a condição controle (sem adição de antimicina A) (Figura 1A). Em contrapartida, as células que tiveram a expressão da via alternativa induzida mostraram-se pouco sensíveis à inibição da cadeia principal (Figura 1B). A inibição significativa do consumo de oxigênio foi alcançada apenas com a adição de SHAM, inibidor da oxidase alternativa, sequencialmente a adição da Antimicina A (Figura 1B).

Os resultados revelaram-se promissores e efetivos para avaliação da atividade da enzima oxidase alternativa. Assim esta plataforma de testes em P. pastoris está sendo utilizada para testes de novas moléculas potencialmente inibidoras da AOX. Em um projeto que conta com a colaboração dos pesquisadores Dr. Rafael Guido (Instituto de Física USP- São Carlos) e Dr. Silvana Rocco (LNBio), novas drogas que inibem a AOX vêm sendo testadas. Estes colaborados provêm contribuições valiosas na área de molecular docking e química sintética, respectivamente. Assim, essa frente de pesquisa compreendeu o molecular

docking baseado na estrutura da AOX de Trypanosoma brucei, que tem direcionado a síntese

de moléculas inibitórias. Os testes funcionais dessas moléculas bem como o desenvolvimento de estratégias para screenings em larga escala e automatizados de uma grande quantidade de compostos estão atualmente em desenvolvimento no laboratório.

Assim, esta levedura mostrou-se uma ferramenta extremamente útil para implementação de uma estratégia eficiente para screening de drogas com capacidade de inibir a enzima AOX. Estima-se que as moléculas com resultados mais promissores sejam testadas contra o micélio de M. perniciosa, em conjunto com estrobilurinas e tenham seu potencial inibitório confirmado. Espera-se, em longo prazo, que sejam encontradas moléculas com potencial fungicida, que permitam a implementação da estratégia de inibição cojunta das vias mitocondriais principal e alternativa de M. perniciosa. A identificação dessa molécula tem potencial de culminar no desenvolvimento de uma formulação que promova o controle efetivo da vassoura de bruxa e, potencialmente, de outras doenças fúngicas.

REFÊRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alberti, S., Gitler, A., & Lindquist, S. (2007). A suite of Gateway cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 24(10), 913–919.

Anders, S., Pyl, P. T., & Huber, W. (2015). HTSeq-A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics, 31(2), 166–169.

Anderson, J. B. (2005). Evolution of antifungal-drug resistance: mechanisms and pathogen fitness.

Nature Reviews. Microbiology, 3(7), 547–556.

Argout, X., Salse, J., Aury, J.-M., Guiltinan, M. J., Droc, G., Gouzy, J., … Lanaud, C. (2011). The genome of Theobroma cacao. Nature Genetics, 43(2), 101–8. http://doi.org/10.1038/ng.736

Avila-Adame, C., & Köller, W. (2002). Disruption of the alternative oxidase gene in Magnaporthe

grisea and its impact on host infection. Molecular Plant-Microbe Interactions : MPMI, 15(5),

493–500.

Bartlett, D., Clough, J., & Godfrey, C. (2001). Understanding the strobilurin fungicides. Pesticide.

Outlook, 12, 143–148.

Bartlett, D. W., Clough, J. M., Godwin, J. R., Hall, A. a., Hamer, M., & Parr-Dobrzanski, B. (2002). The strobilurin fungicides. Pest Management Science, 58(7), 649–662.

Bastos, C. (1989). Avaliação de Fungicidas Sistêmicos no Controle da Vassoura-de-Bruxa do Cacaueiro. Agrotrópica 1: 128-132

Baum, D. A., Smith, S. D., Yen, A., Alverson, W. S., Nyffeler, R., Whitlock, B. A., & Oldham, R. L. (2004). Phylogenetic relationships of Malvatheca (Bombacoideae and Malvoideae; Malvaceae sensu lato) as inferred from plastid DNA sequences. American Journal of Botany, 91(11), 1863–1871. Chen, F., Everhart, S. E., Bryson, P. K., Luo, C., Song, X., Liu, X., & Schnabel, G. (2015). Fungicide-

induced transposon movement in Monilinia fructicola. Fungal Genetics and Biology, 85, 38–44. Collinge, D. B., Jørgensen, H. J. L., Lund, O. S., & Lyngkjaer, M. F. (2010). Engineering pathogen

resistance in crop plants: current trends and future prospects. Annual Review of

Phytopathology, 48, 269–291.

Cools, H. J., Fraaije, B. a., Bean, T. P., Antoniw, J., & Lucas, J. a. (2007). Transcriptome profiling of the response of Mycosphaerella graminicola isolates to an azole fungicide using cDNA microarrays.

Molecular Plant Pathology, 8(5), 639–651.

De Waard, M. a., Andrade, A. C., Hayashi, K., Schoonbeek, H. J., Stergiopoulos, I., & Zwiers, L. H. (2006). Impact of fungal drug transporters on fungicide sensitivity, multidrug resistance and virulence. Pest Management Science, 62(3), 195–207.

Dean, R., Van Kan, J. a L., Pretorius, Z. a., Hammond-Kosack, K. E., Di Pietro, A., Spanu, P. D., … Foster, G. D. (2012). The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant

Pathology, 13(4), 414–430.

Deising, H. B., Reimann, S., & Pascholati, S. F. (2008). Mechanisms and significance of fungicide resistance. Brazilian Journal of Microbiology, 39(2), 286–295.

Fernández-Ortuño, D., Torés, J. A., de Vicente, A., & Pérez-García, A. (2008). Mechanisms of resistance to QoI fungicides in phytopathogenic fungi. International Microbiology : The Official

Journal of the Spanish Society for Microbiology, 11(1), 1–9.

Fernie, A. R., Carrari, F., & Sweetlove, L. J. (2004). Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Current Opinion in Plant Biology, 7(3), 254–261.

Garcia, O., Macedo, J. A. N., Tibúrcio, R., Zaparoli, G., Rincones, J., Bittencourt, L. M. C., Cascardo, J. C. M. (2007). Characterization of necrosis and ethylene-inducing proteins (NEP) in the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches’ broom in Theobroma cacao. Mycological Research, 111(4), 443–455.

Gisi, U., Sierotzki, H., Cook, A., & McCaffery, A. (2002). Mechanisms influencing the evolution of resistance to Qo inhibitor fungicides. Pest Management Science, 58(9), 859–867.

Gurr, S. J., & Rushton, P. J. (2005). Engineering plants with increased disease resistance: What are we going to express? Trends in Biotechnology, 23(6), 275–282.

Hahn, M. (2014). The rising threat of fungicide resistance in plant pathogenic fungi: Botrytis as a case study. Journal of Chemical Biology, 7(4), 133–41.

Hendrix, J. W. (1970). Sterols in growth and reproduction of fungi james. Annual Review of

Phytopathology, 8(108), 111–130.

Hochberg, Y. (2016). Controlling the False Discovery Rate : a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society, 57(1), 289–300.

Hynes, M. J., Szewczyk, E., Murray, S. L., Suzuki, Y., Davis, M. A., & Sealy-lewis, H. M. (2007). Transcriptional Control of Gluconeogenesis in Aspergillus nidulans.Genetics, 176, 139–150.

Jawallapersand, P., Mashele, S. S., Kovačič, L., Stojan, J., Komel, R., Pakala, S. B., … Syed, K. (2014). Cytochrome P450 Monooxygenase CYP53 Family in Fungi: Comparative Structural and Evolutionary Analysis and Its Role as a Common Alternative Anti-Fungal Drug Target. PLoS ONE,

9(9), e107209.

Jolliffe, I.T., (2002). Principal component analysis. 2nd edition. Springer series in statistics, New York. Joseph-Horne, T., & Hollomon, D. W. (2000). Functional diversity within the mitochondrial electron

transport chain of plant pathogenic fungi. Pest Management Science, 56(1), 24–30.

Joseph-Horne, T., Hollomon, D. W., & Wood, P. M. (2001). Fungal respiration: A fusion of standard and alternative components. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics, 1504(2-3), 179–195. Kaneko, I., & Ishii, H. (2009). Effect of azoxystrobin on activities of antioxidant enzymes and alternative oxidase in wheat head blight pathogens Fusarium graminearum and Microdochium

nivale. Journal of General Plant Pathology, 75(5), 388–398. 0178-9

Lehninger, Albert L., Nelson, David L.; Cox, Michael M.; Principles of biochemistry. 5th ed. New York, NY: W. H. Freeman, c2008. 1158 p., il. ISBN 071677108X (enc.).

Leroux, P., Fritz, R., Debieu, D., Albertini, C., Lanen, C., Bach, J., Chapeland, F. (2002). Mechanisms of resistance to fungicides in field strains of Botrytis cinerea. Pest Management Science, 58(9), 876–888.

Loeffler, J., & Stevens, D. A. (2003). Antifungal Drug Resistance, Clinical Infectious Diseases, 36(Suppl 1), 31–41

Ma, Z., & Michailides, T. J. (2005). Advances in understanding molecular mechanisms of fungicide resistance and molecular detection of resistant genotypes in phytopathogenic fungi. Crop

Protection, 24(10), 853–863.

Magnani, T., Soriani, F. M., Martins, V. D. P., Policarpo, A. C. D. F., Sorgi, C. A., Faccioli, L. H., … Uyemura, S. A. (2008). Silencing of mitochondrial alternative oxidase gene of Aspergillus

fumigatus enhances reactive oxygen species production and killing of the fungus by

macrophages. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 40(6), 631–636.

Marí, M., & Cederbaum, A. I. (2001). Induction of catalase, alpha, and microsomal glutathione S- transferase in CYP2E1 overexpressing HepG2 cells and protection against short-term oxidative stress. Hepatology, 33(3), 652–661.

Marzzoco, Anita; Torres, Bayardo Baptista. Bioquimica basica. 2. ed. Rio de Janeiro, RJ: Guanabara Koogan, c1999. 360p., il. ISBN 852770625 (broch.).

Meinhardt, L. W., Rincones, J., Bailey, B. A., Aime, M. C., Griffith, G. W., Zhang, D., & Pereira, G. A. G. (2008). Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches’ broom disease of cacao: What's new from this old foe? Molecular Plant Pathology, 9(5), 577–588.

Mondego, J. M. C., Carazzolle, M. F., Costa, G. G. L., Formighieri, E. F., Parizzi, L. P., Rincones, J., Pereira, G. a G. (2008). A genome survey of Moniliophthora perniciosa gives new insights into Witches’ Broom Disease of cacao. BMC Genomics, 9, 548.

Moore, A. L., Albury, M. S., Crichton, P. G., & Affourtit, C. (2002). Function of the alternative oxidase: Is it still a scavenger? Trends in Plant Science, 7(11), 478–481.

Ploetz, R. C. (2007). Cacao Diseases : Important Threats to Chocolate Production Worldwide Development of a Marker Assisted Selection Program for Cacao. Phytopathology, 1664–1669. Popp, J., & Hantos, K. (2011). The Impact of Crop Protection on Agricultural Production. Studies in

Agricultural Economics, (113), 47–66.

Price, C. L., Parker, J. E., Warrilow, A. G., Kelly, D. E., & Kelly, S. L. (2015). Azole fungicides - understanding resistance mechanisms in agricultural fungal pathogens. Pest Management

Science, 71: 1054–1058.

Purdy, L. H., & Schmidt, R. a. (1996). STATUS OF CACAO WITCHES’ BROOM: biology, epidemiology, and management. Annual Review of Phytopathology, 34, 573–594.

Reimann, S., & Deising, H. B. (2005). Inhibition of efflux transporter-mediated fungicide resistance in Pyrenophora tritici-repentis by a derivative of 4-hydroxyflavone and enhancement of fungicide activity. Applied and Environmental Microbiology, 71(6), 3269–3275.

Rincones, J., Scarpari, L. M., Carazzolle, M. F., Mondego, J. M. C., Formighieri, E. F., Barau, J. G., Pereira, G. a G. (2008). Differential gene expression between the biotrophic-like and saprotrophic mycelia of the witches’ broom pathogen Moniliophthora perniciosa. Molecular

Ringner, M. (2008). What is principal component analysis? Nature Biotechnol, 26(3), 303–304. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., & Smyth, G. K. (2009). edgeR: A Bioconductor package for

differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics, 26(1), 139–140. Rudgard, S. A., & Butler, D. R. (1987). Witches’ broom disease on cocoa in Rondonia, Brazil: pod

infection in relation to pod susceptibility, wetness, inoculum, and phytosanitation. Plant

Pathology, 36, 515–522.

Russell, P. E. (2006). The development of commercial disease control. Plant Pathology, 55, 585–594. Scarpari, L. M., Meinhardt, L. W., Maizzafera, P., Pomella, a. W. V, Schiavinato, M. a., Cascardo, J. C.

M., & Pereira, G. a G. (2005). Biochemical changes during the development of witches’ broom: The most important disease of cocoa in Brazil caused by Crinipellis perniciosa. Journal of

Experimental Botany, 56(413), 865–877.

Siedow, J. N., & Umbach, A. L. (2000). The mitochondrial cyanide-resistant oxidase: Structural conservation amid regulatory diversity. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics, 1459(2- 3), 432–439.

Sierra-Campos, E., Velázquez, I., Matuz-Mares, D., Villavicencio-Queijeiro, a., & Pardo, J. P. (2009). Functional properties of the Ustilago maydis alternative oxidase under oxidative stress conditions. Mitochondrion, 9(2), 96–102.

Teixeira, P. J. P. L., Thomazella, D. P. D. T., Reis, O., do Prado, P. F. V., do Rio, M. C. S., Fiorin, G. L., … Pereira, G. A. G. (2014). High-Resolution Transcript Profiling of the Atypical Biotrophic Interaction between Theobroma cacao and the Fungal Pathogen Moniliophthora perniciosa. The

Plant Cell Online, 26(11),

Teixeira, P. J. P. L., Thomazella, D. P. T., Vidal, R. O., do Prado, P. F. V, Reis, O., Baroni, R. M., … Mondego, J. M. C. (2012). The Fungal Pathogen Moniliophthora perniciosa Has Genes Similar to Plant PR-1 That Are Highly Expressed during Its Interaction with Cacao. PLoS ONE, 7(9), 1–10. Thomazella, D. P. T., Teixeira, P. J. P. L., Oliveira, H. C., Saviani, E. E., Rincones, J., Toni, I. M., …

Pereira, G. A. G. (2012). The hemibiotrophic cacao pathogen Moniliophthora perniciosa depends on a mitochondrial alternative oxidase for biotrophic development. The New

Phytologist, 194(4), 1025–34.

Tyynismaa, H., Carroll, C. J., Raimundo, N., Ahola-Erkkila, S., Wenz, T., Ruhanen, H., Suomalainen, A. (2010). Mitochondrial myopathy induces a starvation-like response. Human Molecular Genetics,

19(20), 3948–3958.

Van Hellemond, J. J., & Tielens, A. G. . (1997). Inhibition of the respiratory chain results in a reversible metabolic arrest in Leishmania promastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology, 85(1), 135–138.

Veiga, A., Arrabaça, J. D., & Loureiro-Dias, M. C. (2000). Cyanide-resistant respiration is frequent, but confined to yeasts incapable of aerobic fermentation. FEMS Microbiology Letters, 190(1), 93– 97.

Wang, H., Wang, J., Chen, Q., Wang, M., Hsiang, T., Shang, S., & Yu, Z. (2015). Metabolic effects of azoxystrobin and kresoxim-methyl against Fusarium kyushuense examined using the Biolog FF MicroPlate. Pesticide Biochemistry and Physiology.

Wood, P. M., & Hollomon, D. W. (2003). A critical evaluation of the role of alternative oxidase in the performance of strobilurin and related fungicides acting at the Qo site of complex III. Pest

Management Science, 59(5), 499–511.

Zaparoli, G., Cabrera, O. G., Medrano, F. J., Tiburcio, R., Lacerda, G., & Pereira, G. G. (2009). Identification of a second family of genes in Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches’ broom disease in cacao, encoding necrosis-inducing proteins similar to cerato- platanins. Mycological Research, 113(1), 61–72.