UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PAULA FAVORETTI VITAL DO PRADO
CARACTERIZAÇÃO DOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
A ESTROBILURINAS NO FUNGO Moniliophthora perniciosa,
AGENTE CAUSADOR DA VASSOURA DE BRUXA DO
CACAUEIRO
CAMPINAS 2016
CARACTERIZAÇÃO DOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA A
ESTROBILURINAS NO FUNGO Moniliophthora perniciosa, AGENTE
CAUSADOR DA VASSOURA DE BRUXA DO CACAUEIRO
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética de Micro-organismos.
Orientador: PROF. DR. GONÇALO AMARANTE GUIMARÃES PEREIRA Co-Orientadora: DRA. DANIELA PAULA DE TOLEDO THOMAZELLA
CAMPINAS 2016 ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA PAULA FAVORETTI VITAL DO PRADO E ORIENTADA PELO PROF. DR. GONÇALO AMARANTE GUIMARÃES PEREIRA.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira (Orientador) Prof. Dr. Celso Eduardo Benedetti
Prof. Dr. Antônio Vargas de Oliveira Figueira
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico esse trabalho à minha família, em memória de meu avô Antônio. Vocês são minha razão para seguir em frente.
“Modern science has been a voyage into the unknown, with a lesson in humility waiting at every stop.”
confiança depositada em mim desde a iniciação científica. Agradeço por ser uma inspiração a todos os seus alunos, e por mostrar que com muito trabalho e dedicação é possível transformar realidades.
À Dra. Daniela Thomazella (Dani) e ao Dr. Paulo Teixeira (Paulinho), pela orientação. Obrigada por todos os ensinamentos desde o início da iniciação científica em 2010. Agradeço muito a paciência, avaliações críticas e conselhos. Obrigada por sempre exigirem o melhor de mim, por todas as oportunidades únicas que me proporcionaram, e, principalmente, pela confiança em meu trabalho. Vocês são meus grandes modelos acadêmicos.
Ao Piotr Mieckowski, pela oportunidade de estágio em seu laboratório e por todo o aprendizado que me proporcionou. Agradeço também à toda a equipe do HTSF (UNC at Chapel Hill), pela disposição em ensinar e por todos os recursos aos quais tive acesso. Agradeço também Surge Biswas pelas análises de bioinformática imprescindíveis para continuação do trabalho.
Aos membros dos exames de qualificação e pré-banca, cujas sugestões foram valiosos. Também aos membros da banca de defesa, Prof. Dr. Antônio Figueira e Dr. Celso Benedetti, pela avaliação cítica do trabalho final e pelos aconselhamentos.
Ao grupo da Vassoura de bruxa, pela dedicação na manutenção dessa linha de pesquisa em nosso laboratório. Aos alunos Christopher e Letícia, pela oportunidade de orientação. Ao Patrick, por ter encarado a continuação do trabalho com a AOX. E em especial, ao Gabriel (Doug), obrigada por todo apoio, aconselhamentos, ajuda na bancada e pelas discussões (e pelas caronas também). Somos todos gratos pela sua prontidão e disponibilidade para ajudar.
À equipe de bioinformática do LGE, em especial Gustavo Lacerda e Juliana José.
À Eliane, pela paciência e por toda ajuda nos assuntos burocráticos. À Mari, Igor, Welbe e Ernestina. Obrigada por manter o laboratório em funcionamento e promover um ambiente de pesquisa sem muita das limitações que encontraríamos sem o trabalho de vocês.
À turma do T.O.C., em especial à Bia Temer, pela disposição em manter o laboratório organizado e facilitar muito o trabalho de todos.
A todos os colegas do LGE, responsáveis pelo ambiente acadêmico de alto nível propício ao aprendizado.
À FAPESP, pelo financiamento (processos 2013/05979-5 e 2014/00802-2). À UNICAMP e ao Instituto de Biologia, pela excelente infraestrutura disponibilizada.
Aos colegas do LNBio, com os quais aprendi muito durante a iniciação científica. Em especial, agradeço à Juliana Oliveira, Sandra Dias e André Ambrósio, que foram muito importantes em minha formação.
À Priscila e sua família. Por todo carinho e pelo acolhimento nos anos iniciais da vida em Campinas.
À Catherine, Allyssa e Scott, que fizeram me sentir em casa nos EUA.
Às amigas Juliana e Jéssica, obrigada pelo companheirismo, paciência para desabafos e pelo enorme apoio sempre. A amizade de vocês é muito especial. Também à Gabriella, Nathália e Larissa. Obrigada pela amizade de uma década (ou mais).
Aos meus queridos amigos de graduação (e família da Biologia). Ludimila (Ludi) e a Beatriz (Guaxu), colegas dentro e fora do laboratório, obrigada pela paciência, ensinamentos e momentos de descontração. À Junia (Foco), colega de quarto e cupido, obrigada por trazer alegria a minha vida. Ao Mateus (Anti), pela sensibilidade e todo apoio. Vocês são meu orgulho e meu modelo, sem vocês não seria possível, obrigada.
Ao meu namorado, André, pelo amor, carinho e companheirismo. Agradeço por me fazer acreditar no meu potencial e por todo apoio sempre. Além de tudo, você é meu maior modelo do que é ser entusiasmado pela Ciência. Também a toda sua família, por ter me acolhido com tanto afeto.
Aos meus avós, por serem as pessoas mais benevolentes, generosas e amorosas que habitam ou já passaram por esse mundo. A todos os meus tios e tias. Agradeço a todos pela torcida, apoio e orações.
Ao meu irmão, Fernando, pela ajuda com assuntos computacionais e por me deixar usar o videogame, mas acima de tudo pela preocupação, proteção e cuidados dedicados a mim. Você é meu maior orgulho.
Aos meus pais, Artur e Maria Luiza, os verdadeiros mestres. Obrigada pelo incentivo e apoio incondicionais. Agradeço infinitamente todo carinho e, principalmente, agradeço muito pela paciência e compreensão durante todo esse período. Saibam que minha maior motivação é um dia poder retornar a vocês toda a dedicação que tiveram comigo.
chocolate, é uma das culturas perenes mais importantes no mundo. No entanto, o cultivo do cacau é seriamente afetado por diversas doenças fúngicas. A doença vassoura de bruxa, causada pelo fungo Moniliophtora perniciosa, é um dos maiores problemas fitopatológicos que afligem as plantações de cacau nas Américas, e é associada com graves consequências sócioeconômicas nos países afetados. No Brasil, os danos causados pela vassoura de bruxa estimularam diversas tentativas de controle deste fitopatógeno, as quais incluíram a aplicação de estrobilurinas. As estrobilurinas constituem uma das classes de fungicidas mais utilizadas na agricultura mundial. Estas moléculas inibem a respiração mitocondrial e levam ao comprometimento da síntese de ATP e à geração de estresse oxidativo. Esta estratégia, no entanto, não se mostrou eficaz contra o patógeno, que se apresentou resistente. Até agora, os mecanismos moleculares relacionados à resistência de M. perniciosa a estrobilurinas foram pouco explorados. Neste contexto, o presente trabalho utilizou a técnica de RNA-seq para identificar genes diferencialmente expressos que potencialmente desempenham papel importante na resistência in vitro a essas drogas. Em resposta ao tratamento com Azoxistrobina (uma estrobilurina) o transcriptoma de M. perniciosa revelou o remodelamento do metabolismo energético, que possivelmente compensa a depleção de ATP e permite a sobrevivência do micélio. Isto inclui a indução de genes codificantes de enzimas da via de gliconeogênese, do ciclo do glioxilato, do catabolismo de lipídios e da degradação de aminoácidos. Em contrapartida, enzimas relacionadas ao ciclo celular (mitose), ao metabolismo de esteróis e à atividade dos ribossomos encontram-se reprimidas, o que indica que a taxa de crescimento do micélio está potencialmente comprometida. Além disso, o fungo expressa uma grande variedade de genes que mitigam os efeitos tóxicos da inibição da cadeia respiratória mitocondrial, o que compreende proteínas relacionadas à proteção contra estresse oxidativo (glutationa-S-transferases e peroxidases), à resistência ao estresse (por exemplo, heat shock proteins) e à detoxificação (por exemplo, citocromos P450). A análise de RNA-seq também revelou a indução de membros de diferentes famílias de transportadores, incluindo transportadores ABC
(ATP-binding cassette) e MFS (major facilitator superfamily), classicamente relacionados à
iniciada a caracterização de um mutante natural de M. perniciosa com fenótipo de resistência aumentada a estrobilurinas, recentemente identificado em nosso laboratório. Uma vez que as estrobilurinas constituem uma das classes de fungicidas mais utilizadas na agricultura mundial, a elucidação das bases de resistência a este composto é um passo fundamental para delinear estratégias de utilização mais eficientes. Em longo prazo, objetiva-se determinar um conjunto de potenciais novos alvos moleculares para a inibição, fornecendo possibilidades para o desenvolvimento de moléculas anti-fúngicas efetivas para o controle da vassoura de bruxa, as quais têm ainda o potencial de serem extrapoladas para o controle de outras doenças fúngicas que sejam baseadas em sistemas análogos de resistência a fungicidas.
of the most important perennial crops in the world. However, the chocolate tree is seriously affected by severe fungal diseases. The witches' broom disease (WBD) is well regarded as one of the major phytopathological problems that afflict cacao crops in Americas, with devastating consequences to the agro-economy of the affected countries. In Brazil, the damages caused by WBD have stimulated initiatives to control this phytopathogen, which included the application of strobilurin fungicides. Strobilurins are one of the most used classes of fungicides in the global agriculture, these molecules inhibit mitochondrial respiration, compromising ATP generation and leading to oxidative stress. This strategy, however, was not effective against this pathogen. Until now, the molecular mechanisms underpinning the M. perniciosa tolerance to the strobilurins have been little explored. In this context, the present work used the RNA-seq technique to identify differentially expressed genes that might play a role in drug resistance in vitro. In response to Azoxystrobin (a commercial strobilurin) treatment, M. perniciosa transcriptome reveals the induction of many enzymes of the gluconeogenesis pathway, glyoxylate cycle, fatty acid catabolism and amino acid degradation, suggesting an intense metabolism remodeling that probably compensates ATP depletion and allows M. perniciosa survival. On the other hand, enzymes related to cell cycle (mitosis), ribossome biogenesis and sterol metabolism are repressed, which is in agreement with the compromised mycelial growth rate. In addition, the fungus expresses a wide range of genes that mitigates the toxic effects of the inhibition of the main mitochondrial respiratory chain, comprising genes related to oxidative stress protection (e.g. glutathione s-transferases and fungal peroxidases), stress resistance (e.g. heat shock proteins) and detoxification (e.g. cythocromes P450). This RNA-seq analysis also revealed members from different families of transporters, including ABC transporters (ATP-binding
cassette) and MFS (major facilitator superfamily) transporters, classically related to
multidrug resistance events. Also, a set of “No Hit” proteins, which have extremely low similarity to any other known protein outside the Moniliophthora genus, were highly upregulated by the fungicide. In parallel experiments, a natural mutant of M. perniciosa with increased strobilurin tolerance phenotype was recently identified in our laboratory. This mutant represents an important tool for elucidating additional mechanisms that may lead to
of strobilurin resistance in this pathogen, which is a fundamental approach to achieve a higher efficiency in the use of this important class of drugs. At long term, we aim to determine a set of potential molecular targets for inhibition, providing valuable information for the development of effective anti-fungal molecules with the potential to be used as a strategy to control witches' broom disease and possibly other destructive fungal diseases around the world.
1.Impacto das doenças fúngicas na agricultura e uso de fungicidas no combate a doenças . 17
2.Uso de fungicidas da classe das estrobilurinas para o controle de fitopatógenos ... 19
3.Mecanismos de resistência a fungicidas ... 22
3.1. Mecanismos de resistência à estrobilurinas ... 22
4.A importância socioeconômica do cacaueiro e o impacto do fungo Moniliophtora perniciosa ... 24
5.Biologia do fungo Moniliophthora perniciosa ... 27
6.Resistência a estrobilurinas no fungo M. perniciosa – Identificação de uma oxidase alternativa ... 30
OBJETIVOS ... 33
CAPÍTULO I – Investigação dos mecanismos moleculares associados à tolerância a estrobilurinas no fungo Moniliophthora perniciosa ... 34
INTRODUÇÃO ... 34
MATERIAIS E MÉTODOS ... 35
1.Material biológico e condições de crescimento ... 35
2.Teste de crescimento de M. perniciosa em meio sólido com azoxistrobina ... 35
3.Avaliação da resposta do fungo a droga ao longo do tempo ... 35
4.Extração de RNA de M. perniciosa ... 37
5.Síntese de cDNA e Real Time PCR... 37
6.Preparação das bibliotecas de mRNA ... 37
7.Análises de bioinformática ... 38
7.1. Mapeamento dos reads e definição dos genes diferencialmente expressos ... 38
7.2. Classificação funcional dos genes ... 39
RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 40
1.M. perniciosa tolera elevadas concentrações de estrobilurinas ... 40
2.Visão geral das alterações transcricionais em M. perniciosa em resposta ao tratamento com azoxistrobina ... 42
2.1. Indução de componentes da cadeia respiratória celular em resposta à azoxistrobina ... 46
...51
2.4. Inibição da via respiratória principal induz genes necessários para a degradação de lipídios ... 54
2.5. Repressão do ciclo celular e do crescimento de M. perniciosa associada ao tratamento com azoxistrobina ... 58
2.6. Fermentação aeróbica ... 61
2.7. Rearranjo metabólico como estratégia de contraposição dos efeitos da droga ... 63
3.Os genes mais induzidos em resposta ao tratamento indicam potenciais proteínas de resistência relacionadas à detoxificação celular ... 64
3.1. M. perniciosa ativa mecanismos de resposta a estresse oxidativo diante do tratamento com azoxistrobina ... 66
3.2. Expressão de mecanismos citoprotetores em resposta ao tratamento com azoxistrobina ... 68
4.Classes de genes relevantes como potenciais alvos de intervenção ... 69
4.1. M. perniciosa induz um grande número de Citocromos P450 em resposta ao tratamento ... 69
4.2. Detecção da expressão de transportadores relacionados ao efluxo de drogas .... 71
4.3. Fatores de transcrição potencialmente envolvidos na regulação da resposta à estrobilurina ... 76
4.4. Genes com anotação “No hit” induzidos em resposta ao tratamento ... 78
5.Propostas para a validação funcional de potenciais mecanismos envolvidos na resistência ...80
6.Modelo das alterações do transcriptoma frente ao tratamento com azoxistrobina ... 81
CAPÍTULO II - Caracterização inicial de um isolado de Moniliophthora perniciosa com fenótipo de resistência aumentada a estrobilurinas ... 84
INTRODUÇÃO ... 84
MATERIAIS E MÉTODOS ... 88
1.Material biológico e condições de crescimento ... 88
2.Avaliação da resposta do fungo a droga ao longo do tempo ... 88
3.Extração de RNA de M. perniciosa ... 88
1.Avaliação dos mecanismos classicamente associados à resistência a estrobilurinas ... 90
2.A Análise de Componentes Principais – (PCA, Principal Component Analysis) ... 91
3.Comparações do transcriptoma entre os genótipos ... 93
4.Alterações do transcriptoma em resposta ao tratamento com azoxistrobina ... 96
CONCLUSÕES ... 100
APÊNDICE I – Validação experimental e output do sequenciamento... 102
RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 102
1.Avaliação da qualidade das amostras de RNA ... 102
2.Validação do tratamento com estrobilurinas por Real Time PCR ... 103
3.Output do sequenciamento de RNA ... 104
4.Métricas de mapeamento das bibliotecas de RNA-seq ... 105
APÊNDICE II - Delineamento experimental para validação funcional de genes utilizando Saccharomyces cerevisiae como plataforma de testes ... 108
CONTEXTUALIZAÇÃO ... 108
MATERIAIS E MÉTODOS ... 109
1.Material biológico e condições de crescimento ... 109
2.Síntese de cDNA e amplificação dos genes de interesse ... 109
3.Vetores e estratégia de clonagem ... 110
4.Transformação de S. cerevisiae ... 111
5.Padronização do crescimento de S. cerevisiae em meio mínimo com Azoxistrobina ... 111
RESULTADOS PRELIMINARES ... 112
1.Teste de crescimento de S. cerevisiae na presença de Azoxistrobina ... 112
2.Seleção de genes de interesse para testes funcionais ... 114
3.Testes funcionais preliminares ... 117
APÊNDICE III – Padronização da utilização da levedura Pichia pastoris como plataforma de teste de inibidores da enzima oxidase alternativa ... 122
2.Testes de consumo de oxigênio ... 123
RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 123
REFÊRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 126
ANEXOI - Autorização da Comissão Interna de Biossegurança (CIBio) ... 131
INTRODUÇÃO GERAL
1. Impacto das doenças fúngicas na agricultura e uso de fungicidas no combate a doenças
O desenvolvimento das grandes civilizações é altamente correlacionado com o domínio da agricultura, assim de certa maneira, as doenças de plantas vêm sendo uma preocupação da humanidade há milhares de anos. Relatos das civilizações grega e romana datadas de 500 anos A.C. já evidenciavam severas epidemias que ameaçaram plantações e consequentemente a população (Deising, Reimann, & Pascholati, 2008). Naturalmente, o desenvolvimento da agricultura foi acompanhado pelo interesse e necessidade de entender mais sobre os problemas que atingiam as plantas.
Muito antes do conhecimento dos agentes causais das fitopatologias, diversas técnicas que permitiam o controle de doenças eram empregadas. Tradicionalmente, os produtores começaram a prover condições ótimas de crescimento e proteger as culturas de danos por pragas, como fungos e outro microrganismos patogênicos a fim de alcançar a produção de culturas com alta qualidade e ótimo rendimento (Hahn, 2014). Assim, os sistemas de manejo de culturas passaram a incluir o uso de fertilizantes, controle de pragas com pesticidas sintéticos e cultivares geneticamente modificados. Esses fatores tornaram-se parte integrante da agricultura moderna, além de figurarem com uma das principais razões de aumentos drásticos na produtividade (Popp & Hantos, 2011).
O uso de biotecnologia e melhoramento tradicional para o desenvolvimento de cultivares resistentes proveu casos de sucesso. Apesar disso, poucos cultivares novos tem sido introduzidos no mercado (Collinge, Jørgensen, Lund, & Lyngkjaer, 2010), uma vez que a identificação de genes que conferem resistência a doenças bem como as condições ideais de expressão desses genes ainda tem se mostrado um desafio (Gurr & Rushton, 2005). Outra ferramenta de manejo, o uso de pesticidas, pode proporcionar benefícios significativos, se feito de maneira correta e racional. Essa abordagem pode permitir o aumento da produção (e consequente otimização do uso do solo e água), além de permitir a produção de alimentos com preços acessíveis (Popp & Hantos, 2011). No entanto, o seu uso está relacionado ao risco de contaminação de solo e água, o que alerta para a necessidade de novas moléculas que sejam seguras ao ambiente e ao ser humano (Popp & Hantos, 2011). Neste cenário, discute-se que a manutenção dessa diversidade de ferramentas de manejo é crucial para prover possibilidades flexíveis para o controle de pragas (Popp & Hantos, 2011).
Estimativas globais já reportaram que cerca de 35% da produção é perdida devido a pragas pré-colheita, mas esse número pode chegar a 70% em alguns lugares do globo (Popp & Hantos, 2011). Além disso, cerca de 10% - 20% da produção é afetada pós-colheita (Russell, 2006). Um terço dessas porcentagens é atribuído às fitopatologias, inclusive doenças fúngicas (Russell, 2006). Neste cenário, o uso de fungicidas perfaz porcentagem significativa da utilização dos pesticidas citados anteriormente.
Os primeiros tratamentos com moléculas antifúngicas foram realizados com compostos inorgânicos, cujos agentes eram enxofre e cobre. A partir de 1940, compostos orgânicos com ação antifúngica com amplo espectro de atividade foram desenvolvidos, a maioria dos quais eram inibidores de múltiplos alvos (Hahn, 2014). Uma nova geração de fungicidas foi desenvolvida a partir da década de 60, a qual é constituída por inibidores mono-espefícicos (inibidores de alvo único). Exemplos dessas moléculas incluem os benzimidazóis, as fenilamidas e também as estrobilurinas (Deising et al., 2008).
Por possuírem um modo de ação altamente específico contra a proteína alvo, esses compostos mostraram alta eficácia e baixa fitotoxicidade (Hahn, 2014). No entanto, poucos anos depois da introdução de fungicidas sítio-específicos, a emergência de resistência e perda da atividade antifúngica foi constatada. Como um exemplo, após apenas dois anos de uso intensivo dos benzimidazóis, foram detectados isolados resistentes do fungo Botrytis
cinerea, causador da “podridão cinzenta”. Desde então, a preocupação com o problema da
resistência têm aumentado e tornou-se um os principais focos da pesquisa na área de agrodefensivos (Hahn, 2014).
Ainda assim, muitas doenças fúngicas tem sua contenção realizada com uso de controle químico. Em um trabalho recente, foram indicados os dez fungos de maior importância em termos econômicos e de desenvolvimento científico na área de fitopatógenos (Dean et al., 2012). Entre eles, estão os fungos Botrytis cinerea, Fusarium
graminearum e Mycosphaerella graminicola. O fungo Botrytis cinerea causa a “podridão
cinzenta” em mais de 240 espécies de plantas e é um dos patógenos que mais acometem a produção de frutas, vegetais e flores ornamentais (Hahn, 2014). A maneira tradicional de manejo desta doença é a aplicação de fungicidas específicos ao patógeno (“botrycides”), que representam 10% do mercado mundial, sendo principalmente comercializadas nos segmentos de uvas e vinho e movimentando um mercado de milhões ao redor do mundo (Dean et al., 2012). Outros patógenos destrutivos como Fusarium graminearum e
Mycosphaerella graminicola também são controlados com fungicidas. O primeiro, patógeno
de cereais, é controlado moderadamente com o uso de azóis. O segundo, causador de doenças no trigo, também tem seu controle efetuado com essa classe de fungicidas, em um cenário no qual o controle químico é importante devido à ausência de variedades resistentes de trigo (Cools, Fraaije, Bean, Antoniw, & Lucas, 2007). Os patógenos supracitados são exemplos pontuais de como o uso de estratégias baseadas em fungicidas tornaram-se ferramentas importantes na manutenção da agricultura em larga escala. No entanto, desde a introdução dos fungicidas sítio-específicos no mercado, o surgimento de cepas resistentes de importantes fitopatógenos tornou-se o maior alvo de problemas e preocupações no que diz respeito à proteção das áreas de cultivo. Um desses casos é ilustrado pelo histórico de uso de fungicidas da classe das estrobilurinas. O uso extensivo desta importante classe de drogas para controle dos mais importantes fungos patogênicos culminou na seleção de isolados resistentes em diversas espécies.
2. Uso de fungicidas da classe das estrobilurinas para o controle de fitopatógenos
O uso de estrobilurinas como estratégia de controle de fitopatógenos é relativamente recente (1996). Estas moléculas foram inicialmente isoladas como substâncias naturais produzidas por basidiomicetos do gênero Strobilurus (D. W. Bartlett et al., 2002). Após seu isolamento e caracterização, as estrobilurinas (Figura 1) foram melhoradas para uso comercial e rapidamente se tornaram uma das mais importantes classes de drogas antifúngicas utilizadas na agricultura, ocupando mais de 20% do mercado global de fungicidas nos dez primeiros anos de sua comercialização (Fernández-Ortuño, Torés, de Vicente, & Pérez-García, 2008). Um de seus derivados sintéticos, a azoxistrobina produzida pela empresa Syngenta (Figura 1), destaca-se como um dos fungicidas mais utilizados no mundo (Bartlett, Clough, & Godfrey, 2001).
A família das estrobilurinas mostrou-se altamente efetiva contra uma ampla gama de fitopatógenos. Uma das principais razões para o sucesso na comercialização da azoxistrobina teve relação com a capacidade em controlar ascomicetos, basidiomicetos, e deuteromicetos. Assim, o uso deste fungicida foi capaz de controlar o alastramento de combinações desses patógenos, o que antes só era possível através da combinação de fungicidas (Bartlett, Clough, & Godfrey, 2001).
Figura 1 - Estrobilurina natural e sintética – Embora os produtos naturais isolados da fonte biológica
(representados pela Estrobilurina A) mostraram ter atividade anti-fúngica in vitro, os mesmos não se mostraram efetivos em plantas. Essa diferença na atividade desses compostos é explicada principalmente devido à instabilidade diante da exposição à luz e volatilidade, características que impedem sua utilização na agricultura. No entanto, a estrobilurina A representou um valioso ponto de partida para o desenvolvimento das estrobilurinas sintéticas, como a Azoxistrobina, cujas modificações estruturais conferiram características as quais possibilitaram o uso comercial. As estrobilurinas sintéticas começaram a ser comercializadas em 1996 e rapidamente se tornaram um dos fungicidas mais usados do mundo, devido a sua atividade de amplo espectro e capacidade de controlar isolados resistentes a outros fungicidas comerciais com modos de ação distintos (D. W. Bartlett et al., 2002).
A atividade antifúngica dessas moléculas é explicada pela capacidade de inibir a respiração mitocondrial através da ligação ao sítio Qo (outer quinol-oxidation site) do complexo enzimático que forma o citocromo bc1, o complexo III da cadeia transportadora de
elétrons (Figura 2). Essa inibição bloqueia o transporte de elétrons entre o citocromo b e o citocromo c1, o que culmina na deficiência de energia nas células do fungo devido à
interrupção da produção de ATP (Fernández-Ortuño, et al., 2008). Além disso, o tratamento com Azoxistrobina induz estresse oxidativo (Avila-Adame & Köller, 2002). Assim, a letalidade das estrobilurinas está associada com a deficiência na produção de ATP em combinação com a excessiva produção de espécies reativas de oxigênio (ROS – reactive oxygen species) que causa danos ao DNA, RNA e proteínas (Chen et al., 2015).
Figura 2 - Esquema representativo do transporte de elétrons na mitocôndria de fungos – Os complexos I, II,
III, e IV constituem a cadeia principal de transporte de elétrons (em verde). A inibição de qualquer um desses complexos pode paralisar o transporte de elétrons mitocondrial (e causar o escape de elétrons e consequente geração de ROS), prejudicando consideravelmente a célula. As estrobilurinas inibem a respiração mitocondrial através da ligação específica ao complexo III, como representado em vermelho. Alguns organismos apresentam vias de transporte de elétrons alternativas (em amarelo), representadas pela enzima AOX (oxidase alternativa) e pelas NADH desidrogenases alternativas. Essas vias podem atuar em situações de inibição da cadeia principal, e minimizar os efeitos prejudiciais à célula. (Figura adaptada de Joseph-Horne & Hollomon, 2000)
Fungicidas da classe das estrobilurinas têm sido efetivos na redução de perdas agrícolas por um longo período. No entanto, devido ao seu modo de ação altamente específico, o desenvolvimento de resistência a estes fungicidas é uma preocupação constante. De fato, pouco tempo depois da introdução comercial das estrobilurinas, isolados resistentes de vários fitopatógenos foram identificados em campo (Fernández-Ortuño et al., 2008). Assim, uma das eminentes vantagens das estrobilurinas (seu modo de ação altamente específico) provou ser também um importante ponto fraco, uma vez que um número significante de cepas resistentes de diversos patógenos foram selecionadas diante do uso prolongado desse composto. Diversos patógenos servem como exemplo: casos de resistência a essa classe de fungicidas foram detectados em Mycosphaerella graminicola, um dos principais patógenos que acometem a cultura de trigo (Walker, Auclair, Gredt, & Leroux, 2009); isolados resistentes também foram identificados em Botrytis cinerea (Leroux et al., 2002).
Notavelmente, o conhecimento dos mecanismos de resistência a essas drogas de interesse pode maximizar a utilidade das mesmas, além de auxiliar no desenvolvimento de novas drogas antifúngicas.
3. Mecanismos de resistência a fungicidas
O surgimento de resistência a agentes antimicrobianos usados no controle de patógenos na medicina e na agricultura é um problema bem documentado (Anderson, 2005). O termo “resistência” é usado para descrever a relativa insensibilidade de um microrganismo à determinada droga antimicrobiana testada in vitro, em comparação com outros isolados da mesma espécie (Loeffler & Stevens, 2003).
O surgimento de resistência é classicamente associado ao resultado de uma ou múltiplas mutações. Isolados resistentes a certo fungicida podem surgir devido a mutações genéticas que ocorrem naturalmente, em uma frequência muito baixa. Esses indivíduos mutantes serão menos afetados ou nem um pouco afetados pela ação fungicida. A aplicação do fungicida, no entanto, ainda será efetiva no controle dos isolados sensíveis, assim, com o passar do tempo, os isolados resistentes podem aumentar em número na população. Neste contexto, casos de falhas no controle da doença podem ocorrer (Ma & Michailides, 2005).
De modo geral, quando se trata de resistência a drogas, três mecanismos principais são normalmente considerados: (I) alterações da enzima alvo, as quais impedem a ligação da droga em seu sítio de ação. (II) alterações no metabolismo que minimizam o efeito tóxico da droga. (III) Aumento no sistema de efluxo, como a superexpressão de transportadores ABC (abreviação do termo em inglês de ATP-binding cassete) que transportam a droga para fora da célula. Ainda, a combinação desses mecanismos pode resultar em níveis aumentados de resistência (Anderson, 2005).
No caso específico da resistência às estrobilurinas, três principais mecanismos são apontados: (I) mutações no gene do citocromo b, (II) vias respiratórias alternativas e (III) indução de bombas de efluxo (Fernández-Ortuño, et al., 2008).
3.1. Mecanismos de resistência à estrobilurinas
A resistência às estrobilurinas é associada primariamente a mecanismos que envolvem mutações no gene codificante do citocromo b (Cytb). Estas mutações resultam em mudanças na sequência de peptídeos que impedem a ligação do fungicida à proteína. Mutações que afetam a sensibilidade a esta classe de drogas foram constatadas em duas regiões do gene Cytb, justamente nos trechos da sequência correspondentes aos aminoácidos que interagem com os ligantes na estrutura terciária (Fernández-Ortuño, et al.,
2008). Diversas mutações descritas na literatura foram associadas à resistência a estrobilurinas (Gisi, Sierotzki, Cook, & McCaffery, 2002), e foram detectadas no gene Cytb de vários fungos fitopatogênicos resistentes ao fungicida (Fernández-Ortuño, et al., 2008).
Quando a sequência de aminoácidos do citocromo b de Saccharomyces cerevisiae é comparada com a de fungos basidiomicetos produtores de estrobilurinas (ex. Strobilurus
tenacellus e Mycena galopoda), cinco diferenças significativas são detectadas, são elas as
substituições: T127I, A153S, S255Q, N262D e G143A. Essas variações são conhecidas por protegerem os fungos produtores de estrobilurinas de sofrerem o efeito de seus próprios metabólitos (Gisi et al., 2002). Assim, não é surpreendente que a principal mutação detectada em fungos fitopatogênicos que confere resistência seja uma dessas cinco substituições, neste caso a mutação G143A. A substituição G143A foi detectada em isolados resistentes de mais de vinte espécies de fitopatógenos, incluindo Mycosphaerella fijensis e
M. graminicola (Fernández-Ortuño, et al., 2008). Esta é a principal mutação associada à
resistência a estrobilurinas em campo e é normalmente associada às falhas de controle das doenças com fungicidas desta classe (Fernández-Ortuño, et al., 2008). Além das citadas, outras mutações, como a F129L, também foram associadas à resistência de importantes patógenos de plantas (Fernández-Ortuño, et al., 2008; Gisi, et al., 2002).
Outro mecanismo de resistência a estrobilurinas é mediado pela indução de uma via respiratória alternativa (Figura 2), cuja principal enzima é a oxidase alternativa (AOX). Perante a inibição dos complexos respiratórios da via principal (III ou IV), a AOX catalisa a transferência de elétrons da ubiquinona para o oxigênio molecular, contornando o sítio inibido pela droga (citocromo b do complexo III). A respiração pela via alternativa limita a efetividade das estrobilurinas in planta, principalmente se a infecção já estiver estabelecida (Fernández-Ortuño, et al., 2008). Ao atuar como um bypass de elétrons, a AOX reduz o acúmulo de espécies reativas de oxigênio geradas em decorrência da inibição da via principal, atenuando assim a toxicidade das estrobilurinas. Além disso, a AOX ainda permite a síntese de uma pequena quantidade de ATP (Joseph-Horne & Hollomon, 2000). Considerando que as estrobilurinas podem não ser letais para fungos que possuem a via respiratória alternativa, a presença da AOX pode prover um ambiente favorável à seleção de mutações pontuais no gene Cytb. (Fernández-Ortuño, et al., 2008).
O terceiro mecanismo de resistência, as bombas de efluxo (Fernández-Ortuño, et al., 2008), permite que os fungos sobrevivam à exposição a compostos tóxicos, impedindo que
os mesmos atinjam concentrações letais dentro da célula. Duas das famílias mais importantes de bombas de efluxo envolvidas na proteção de fungos contra a ação de agentes fungicidas são os transportadores ABC (ATP-binding cassete) e a superfamília MFS (major facilitator superfamily). As bombas de efluxo apresentam baixa especificidade ao substrato e promovem proteção contra uma grande variedade de compostos tóxicos, o que as caracteriza como mecanismos de resistência a múltiplas drogas (Fernández-Ortuño, et al., 2008). O envolvimento desse tipo de mecanismo na resistência a fungicidas foi determinado usando inibidores de bombas de efluxo em combinação com fungicidas, inclusive estrobilurinas (Reimann & Deising, 2005). Esta abordagem revelou que isolados resistentes tratados com o inibidor da bomba de efluxo tornaram-se sensíveis ao fungicida utilizado em conjunto (Reimann & Deising, 2005).
Coletivamente, a maneira que esses mecanismos de resistência surgem, seu impacto na aptidão do patógeno e interação dos mecanismos entre si são determinantes dos níveis de resistência em populações de fungos patogênicos (Anderson, 2005). Apesar de alguns mecanismos moleculares potencialmente associados à resistência a fungicidas serem relativamente bem compreendidos, um melhor entendimento da atuação conjunta destes mecanismos é necessário para a elaboração de estratégias eficientes e duradouras para controle dos fitopatógenos em campo.
4. A importância socioeconômica do cacaueiro e o impacto do fungo Moniliophtora perniciosa
O cacaueiro tem uma longa história como uma das mais importantes culturas tropicais. Sua principal importância está relacionada ao uso de suas amêndoas como matéria prima para a fabricação do chocolate, um produto muito apreciado mundialmente e responsável por impulsionar um mercado anual de bilhões de dólares (Ploetz, 2007).
Theobroma cacao, nome científico do cacaueiro, é um membro da família Malvaceae sensu lato (Baum et al., 2004). Originário da bacia Amazônica, o cacaueiro foi domesticado há pelo
menos 2600 anos pela civilização maia, na América Central (Argout et al., 2011; Ploetz, 2007; Purdy & Schmidt, 1996).
Após a chegada dos europeus nas Américas, a cultura do cacau disseminou-se globalmente. Até o século XIX, as Américas ainda detinham toda a produção mundial. No
entanto, por volta de 1900, aproximadamente 20% das sementes já eram produzidas fora das Américas e, no início do século XXI, o continente teve sua produção consideravelmente reduzida. Assim, em 2005, 86% da produção mundial era proveniente de países africanos e asiáticos. Uma das principais razões dessa drástica mudança nos centros primários de produção de cacau foram as doenças que se alastraram nas Américas, mas que não estão presentes na África e na Ásia (Ploetz, 2007). Dentre as principais doenças fúngicas que afetam a produção de cacau destacam-se a monilíase, cujo agente etiológico é a espécie
Moniliophthora roreri, e a vassoura de bruxa, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa
(Ploetz, 2007).
A vassoura de bruxa pode causar perdas significativas, sendo que a queda na produção de cacau na América do Sul é reflexo da sua severidade. Nesta área, foram reportadas perdas de 30 a 90% em muitos países, e os níveis de produção em muitas das regiões afetadas ainda não retornaram às quantidades produzidas antes da introdução da doença (Meinhardt et al., 2008). No Brasil, a vassoura de bruxa era restrita à região da Amazônia, e a principal região produtora de cacau do país (o sul da Bahia) permaneceu livre da doença até 1989 (Purdy & Schmidt, 1996). A vassoura de bruxa praticamente dizimou a produção de cacau brasileira, primeiro em Rondônia na década de 70 (50% de perdas em seis anos) e depois na Bahia, onde reduziu a produção em 60% em cinco anos. Depois da chegada de M. perniciosa ao sul da Bahia (Figura 3), o Brasil, que antes figurava como um dos líderes da produção mundial de cacau (com aproximadamente 15% da produção) tornou-se importador desta matéria prima (Ploetz, 2007) .
Figura 3 - Mercado brasileiro de cacau (1961-2011) – Até o fim da década de 80 a produção de amêndoas de
cacau aumentava constantemente, no entanto, a disseminação do fitopatógenos M. perniciosa (barra vermelha) afetou severamente as lavouras. Poucos anos depois do principal outbreak (em 1989) a produção brasileira não foi mais capaz de suprir o mercado interno e, neste cenário, o Brasil sofreu uma abrupta transição de exportador (linha verde) para importador (linha vermelha). Referência: FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations, http://faostat3.fao.org/home/E, acessado em novembro de 2014).
A vassoura de bruxa não só afeta o suprimento de cacau como também tem um grande impacto ambiental. O cacaueiro é tipicamente cultivado em uma condição que favorece a conservação de amplas regiões de floresta tropical, uma vez que a sombra do dossel é ideal para o crescimento do cacaueiro no sub-bosque (Meinhardt et al., 2008). No Brasil, com as perdas na produção associadas à vassoura de bruxa, os cacauicultores se viram forçados a utilizar seus terrenos para o plantio de outras culturas ou até mesmo a convertê-los em áreas para criação de animais, o que normalmente requer a destruição da cobertura de floresta (Meinhardt et al., 2008).
Fortuitamente para os apreciadores de chocolate, outras regiões do globo produtoras de cacau, como o oeste da África e o sudoeste da Ásia, não foram afetadas pela vassoura de bruxa, e assim vêm expandindo sua produção para atender à crescente demanda mundial (Meinhardt et al., 2008). Atualmente, a região oeste da África é responsável por cerca de 70% de toda produção de amêndoas de cacau do globo (Ploetz, 2007). Deste modo, a possibilidade da doença se alastrar para esses continentes, como por exemplo, através do aumento das transações e carregamentos internacionais desta
commodity, é uma questão que causa grandes preocupações para as indústrias chocolateiras
(Meinhardt et al., 2008). Além disso, dada a grande dependência da cultura cacaueira por parte de alguns países africanos (ex. Costa do Marfim, Gana, Camarões, Nigéria), a introdução da vassoura de bruxa nessas regiões teria resultados catastróficos associados a significativas perturbações econômicas, sociais e ambientais.
5. Biologia do fungo Moniliophthora perniciosa
A biologia da interação entre M. perniciosa e o cacaueiro é complexa e se altera conforme o desenvolvimento do fungo e a progressão da doença. M. perniciosa exibe um ciclo de vida hemibiotrófico, ou seja, apresenta duas fases miceliares distintas (biotrófica e necrotrófica), as quais se desenvolvem em paralelo aos sintomas da planta infectada (Purdy & Schmidt, 1996). A doença vassoura de bruxa do cacaueiro se inicia com a produção de basidiósporos a partir de pequenos cogumelos (basidiomata) que se formam nos tecidos das plantas previamente infectadas (Meinhardt et al., 2008; Mondego et al., 2008).
A dispersão dos esporos ocorre principalmente pelo vento ou pela água durante o período noturno. Em condição de alta umidade, os basidiósporos infectam tecidos meristemáticos do cacaueiro, incluindo ramos, flores ou frutos em etapas iniciais de desenvolvimento. Nesse estágio da doença, a densidade de micélio na planta é muito baixa e o fungo encontra-se em sua fase biotrófica, que é reconhecida pela presença de hifas monocarióticas, sem grampos de conexão (Meinhardt, et al., 2008; Mondego, et al., 2008).
Após a penetração na planta, o micélio biotrófico cresce vagarosamente no apoplasto e causa drásticas alterações morfológicas no cacaueiro (Mondego, et al., 2008). Os sintomas incluem hipertrofia, hiperplasia, perda da dominância apical e proliferação de ramos laterais, o que resulta em uma estrutura semelhante a uma vassoura, e que dá o nome característico a esta fase da doença, a vassoura verde (Figura 4) (Meinhardt, et al., 2008; Mondego, et al., 2008). Além disso, os tecidos infectados apresentam alterações bioquímicas importantes como o aumento da peroxidação de lipídios e a produção de espécies reativas de oxigênio, como peróxido de hidrogênio, sugerindo uma condição de intenso estresse oxidativo neste primeiro estágio da doença (Scarpari et al., 2005).
Posteriormente ao primeiro período da infecção, ocorre a necrose e a morte dos tecidos infectados, caracterizando a fase de vassoura seca da doença. Durante este estágio,
o fungo prolifera vigorosamente e coloniza o tecido necrótico constituído basicamente de células mortas do hospedeiro. Este micélio, denominado necrotrófico, é morfologicamente distinto do micélio biotrófico, sendo caracterizado pela dicariotização das hifas e pela presença de grampos de conexão (Meinhardt, et al., 2008; Mondego, et al., 2008). Eventualmente, sobre o tecido já necrosado, ocorre a formação dos basidiomata, onde ocorre a meiose para a produção de basidiósporos, completando assim o ciclo de desenvolvimento do fungo (Figura 4) (Meinhardt et al., 2008).
Figura 4 - Ciclo de vida de M. perniciosa - O fungo exibe um ciclo de vida hemibiotrófico, apresentando duas
fases miceliares distintas (biotrófica e necrotrófica). Após a germinação dos esporos nos tecidos meristemáticos da planta, ocorre o desenvolvimento do micélio biotrófico. Esta primeira fase da doença é denominada “vassoura verde” e é caracterizada por importantes mudanças na fisiologia do cacaueiro (Scarpari, et al., 2005). Durante o segundo estágio, o tecido infectado torna-se necrótico, sendo denominado de “vassoura seca”. Paralelamente, o fungo exibe um micélio necrotrófico, que cresce vigorosamente nos tecidos mortos do cacaueiro. Eventualmente, este micélio produzirá os corpos de frutificação (basidiomata) que liberarão esporos, completando assim o ciclo da doença.
Assim como o cacaueiro, o fungo M. perniciosa é também originário da região da bacia amazônica. Nesse ambiente, o cacaueiro cresce disperso em meio à densa floresta tropical, as árvores crescem de maneira relativamente devagar e produzem flores e frutos de maneira dessincronizada. Já nas plantações, o crescimento vegetativo e o reprodutivo
ocorrem juntos, com um clima que favorece a esporulação de M. perniciosa e a infecção do hospedeiro (Purdy & Schmidt, 1996). Assim, a abundância de tecido susceptível no hospedeiro, as múltiplas fontes de inóculo e o clima adequado favorecem enormemente o alastramento do fungo, o que torna o controle da doença em campo um desafio (Purdy & Schmidt, 1996). No Brasil, as duas maneiras tradicionalmente mais utilizadas pelos produtores para tentar controlar a vassoura de bruxa são a poda fitossanitária (remoção das partes doentes da planta) e a aplicação de fungicidas (Bastos, 1989). Estas práticas, no entanto, não são efetivas. A realização da poda leva à ativação dos tecidos meristemáticos das gemas laterais da planta, favorecendo assim infecções subsequentes (Rudgard & Butler, 1987). Da mesma forma, a aplicação de fungicidas é ineficiente, possivelmente devido à atuação de mecanismos de resistência do patógeno.
Com o objetivo de entender esta complexa e devastadora doença, iniciou-se no ano 2000 o Projeto Genoma Vassoura de bruxa (http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura). Este projeto envolveu diversos laboratórios brasileiros e permitiu a obtenção de uma primeira montagem (draft) do genoma do fungo M. perniciosa (Mondego, et al., 2008). As análises genômicas têm sido fundamentais para o entendimento deste importante fitopatógeno, contribuindo inclusive para a elaboração de estratégias para combate à doença. Proteínas possivelmente relacionadas ao processo de infecção como também à resistência às defesas do hospedeiro tornaram-se alvos de grande interesse e têm sido exaustivamente estudadas por nosso grupo (Garcia et al., 2007; Rincones et al., 2008; Thomazella et al., 2012; Zaparoli
et al., 2009).
Estudos de genômica e transcriptômica conduzidos por nosso laboratório ao longo dos últimos 15 anos, têm permitido uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos nessa peculiar interação planta-patógeno. Embora inúmeros avanços tenham sido alcançados (Garcia et al., 2007; Rincones et al., 2008; Teixeira et al., 2012; Teixeira et
al., 2014; Thomazella et al., 2012; Zaparoli et al., 2009), o desenvolvimento de estratégias
efetivas para o controle da vassoura de bruxa ainda se faz necessário.
Assim, esforços vêm sendo direcionados para o entendimento dos mecanismos de patogenicidade e resistência apresentados por M. perniciosa, iniciativas que poderão prover ferramentas eficazes para controle da vassoura de bruxa.
6. Resistência a estrobilurinas no fungo M. perniciosa – Identificação de uma oxidase alternativa
A vassoura de bruxa é sempre associada a quadros socioeconômicos graves nas áreas nas quais ocorre. Diante desta situação, foram testadas algumas estratégias de controle do fungo. Na Bahia, por exemplo, dentre estas tentativas, apostou-se em uma das formas mais usuais de controle de fitopatógenos: a aplicação de fungicidas no campo. Diversos fungicidas foram testados, incluindo drogas da classe das estrobilurinas, no entanto, sem sucesso (Pereira, G. A. G.; comunicação pessoal).
As primeiras constatações de que, em condições de campo, o fungo resistia ao tratamento com estobilurinas, foram feitas na mesma época em que as primeiras sequências do genoma de M. perniciosa foram obtidas. Essa observação foi corroborada in vitro, no entanto, nenhuma mutação no gene do citocromo b (Mp-cytb) foi detectada, sugerindo que mecanismos adicionais figuravam no fenótipo de resistência do patógeno.
Ainda com dados de sequenciamento Sanger, foi identificada uma cópia única do gene codificante de uma oxidase alternativa (Mp-aox) no genoma de M. perniciosa. Essa proteína, como discutido anteriormente, é uma enzima chave da cadeia alternativa de transporte de elétrons mitocondrial (Figura 2). Experimentos realizados pelo grupo demonstraram que a inibição da via principal de transporte de elétrons pelas estobilurinas (que inibem o complexo III), resulta na indução da AOX (Thomazella et al., 2012). A AOX catalisa a transferência de elétrons da ubiquinona ao oxigênio molecular, transpassando o sítio inibido pela droga (complexo III) (Thomazella et al., 2012). Essa via, denominada via respiratória alternativa, limita a efetividade das estrobilurinas in planta (Fernández-Ortuño,
et al., 2008). Neste cenário, propôs-se que a enzima MpAOX tem papel importante na
resistência às estrobilurinas em M. perniciosa. Além disso, estudos adicionais (Thomazella et
al., 2012) demonstraram que essa enzima é um alvo promissor para o controle da doença
vassoura de bruxa (Figura 5).
Thomazella et al. verificaram que M. perniciosa apresenta-se resistente a estrobilurinas em ambas as fases miceliares (fase biotrófica e fase necrotrófica). Além disso, o micélio biotrófico mostrou-se bastante sensível a um inibidor da AOX, o SHAM (salicylhydroxamic acid), o que concorda com o fato de que o este estágio miceliar é muito dependente da respiração alternativa. Notavelmente, a inibição das duas vias respitatórias
(principal e alternativa) impediu o crescimento de ambas as fases miceliares do fungo, o que provê uma forte evidência do que pode ser uma promissora estratégia para o controle da vassoura de bruxa (Figura 5). Além disso, investigações do grupo de pesquisa do laboratório evidenciaram que essa estratégia é também promissora contra diversos outros fungos fitopatogênicos (Figura 6).
Figura 5 - Inibição do crescimento de M. perniciosa na presença de estrobilurina e um inibidor da AOX – Em
ambas as fases miceliares, o tratamento com estrobilurina (Azoxistrobina - 1mg/L) não impede o crescimento do micélio. A fase biotrófica, que apresenta maior nível de expressão do gene Mp-aox, é consideravelmente sensível ao inibidor da AOX, o SHAM, enquanto que a fase necrotrófica cresce sem efeitos maiores na presença desse inibidor. O uso combinado dos inibidores da via respiratória principal e alternativa inibe completamente o crescimento de ambas as fases miceliares do patógeno, evidenciando uma estratégia promissora para o controle da doença vassoura de bruxa do cacaueiro. Figura adaptada de Thomazella et al., 2012.
Figura 6 – Estratégia promissora para o controle de fitopatógenos – A combinação de estrobilurinas com um
inibidor da AOX, além de ser efetiva na inibição do crescimento de M. perniciosa, também se mostrou muito promissora no que se diz respeito a diversos outros fungos e oomicetos fitopatogênicos. Observa-se que a combinação de Azoxistrobina (Azo) em diversas concentrações com o SHAM (condições destacadas pelo quadro verde) impede o desenvolvimento dos microrganismos em questão, os quais não tem o crescimento inibido pela estrobilurina apenas. De cima para baixo: Colletotrichum gloeosporioides, patógeno da manga, mamão, maracujá e goiaba; Guignardia citricarpa, causador da “mancha negra” dos citrus; Phytophthora infestans¸que infecta batata e tomate; Sclerotinia sclerotiorum, o “mofo branco” da soja e Venturia pirina, infectante da pêra. Figura por Natália M. Costa e Paulo J.P.L. Teixeira.
Apesar do potencial tecnológico relacionado à combinação de inibidores da cadeia respiratória principal e alternativa, os atuais inibidores da AOX não são suficientemente estáveis para uma potencial utilização em campo. Assim, a identificação de novas drogas é fundamental para tornar esta estratégia viável. Em paralelo, outra iniciativa de fundamental importância é a produção de conhecimento sobre fatores adicionais associados à resistência a estrobilurinas, cuja proposição como alvos de inibição pode potencializar a utilização desses fungicidas bem como assistir o desenvolvimento de novas classes de moléculas antifúngicas. Neste cenário, no presente trabalho, foram conduzidas análises do transcriptoma do fungo tratado com fungicida, a fim de aprofundar o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na determinação de resistência a estrobilurinas em M.
OBJETIVOS
O projeto teve como objetivo geral a caracterização das bases moleculares, genes individuais e vias, envolvidos na resistência a estrobilurinas em M. perniciosa. O trabalho ramificou-se em duas frentes:
A principal frente compreendeu: Capítulo I
1. Análise dos efeitos do tratamento com fungicida no transcriptoma de M. perniciosa (isolado FA553) através da técnica de RNA-seq;
1.1 . Análise do remodelamento metabólico frente à inibição da cadeia respiratória mitocondrial.
1.2 . Identificação de genes tipicamente responsivos à presença de drogas (por exemplo, transportadores de droga e citicromos P50) e potenciais alvos de intervenção;
Em paralelo, a segunda frente incluiu: Capítulo II
1. Caracterização inicial de um isolado de M. perniciosa (NMC01) com fenótipo de resistência aumentada a estrobilurinas.
1.1. Avaliação preliminar do transcriptoma e do genoma deste isolado visando à identificação da base molecular responsável pela resistência a estrobilurinas
CAPÍTULO I – Investigação dos mecanismos moleculares associados à tolerância a estrobilurinas no fungo Moniliophthora perniciosa
INTRODUÇÃO
Devido ao grande impacto negativo que o alastramento de M. perniciosa ocasionou nas Américas (Meinhardt et al., 2008; Ploetz, 2007) e diante do risco do alastramento da doença vassoura de bruxa para outros países produtores de cacau (Meinhardt et al., 2008), a necessidade de estratégias de controle deste patógeno torna-se evidente. No Brasil, dentre as estratégias de controle já testadas em campo está a aplicação de fungicidas da classe das estrobilurinas, uma das drogas mais utilizadas na agricultura mundial para controle de fitopatógenos. No entanto, este fungicida não se mostrou efetivo no controle da vassoura de bruxa (Pereira, G. A. G.; comunicação pessoal).
Uma vez que as estrobilurinas constituem uma das classes de fungicidas mais utilizadas na agricultura mundial (D. Bartlett et al., 2001), o entendimento das bases de resistência a este composto é um passo fundamental para obter-se uma alta eficiência no seu uso. No caso de M. perniciosa, apesar do potencial tecnológico relacionado à combinação de inibidores da cadeia respiratória principal e alternativa (Thomazella et al., 2012), os atuais inibidores da AOX não são suficientemente estáveis para uma potencial utilização em campo. Portanto, a viabilidade dessa estratégia demandaria a identificação de novos inibidores da MpAOX. Além do desenvolvimento e síntese de drogas inibidoras da MpAOX, seria de interesse a proposição de alvos alternativos para novas moléculas inibitórias que atuem em processos metabólicos distintos e que possam ter ação sinérgica à estratégia de inibição das vias respiratórias mitocondriais. A identificação de novos alvos celulares para inibição pode ainda desfavorecer a emergência e seleção de mutantes resistentes.
Neste contexto, realizou-se o estudo do transcriptoma de M. perniciosa tratado com Azoxistrobina, a fim de aprofundar a compreensão dos mecanismos (além da MpAOX) envolvidos na tolerância do patógeno a esta classe de drogas. Os objetivos incluíram a caracterização do metabolismo celular e identificação dos processos que possam permitir a sobrevivência do patógeno diante da exposição ao fungicida.
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Material biológico e condições de crescimento
O fungo M. perniciosa (isolado FA553) foi mantido em meio sólido MYEA (malt,
yeast extract, agar) composto por 17g/L extrato de malte, 5g/L extrato de levedura e 20 g/L
ágar. O crescimento em meio líquido foi feito em meio com baixo teor de carboidratos contendo 2g/L extrato de malte, 5 g/L extrato de levedura e 50 mL/L glicerol. Em ambos os casos, o micélio foi mantido a 28 oC e as culturas em meio líquido foram mantidas sob agitação constante (150 rpm).
2. Teste de crescimento de M. perniciosa em meio sólido com azoxistrobina
As características do crescimento do fungo em placa foram avaliadas a partir do acompanhamento do inóculo em meio sólido na presença de concentrações crescentes de droga em comparação ao crescimento na condição controle (sem droga). A massa de Amistar foi dispersa em água estéril e adicionada ao meio sólido. Exceto na condição controle, o meio sólido MYEA foi complementado com as seguintes concentrações de Azoxistrobina: 1 mg/L, 10 mg/L, 20 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L e 500 mg/L. A Azoxistrobina utilizada é componente do fungicida Amistar (Zeneca/Syngenta), o qual é composto por 50% m/m do composto ativo e 50% m/m de componentes inertes. Portanto, as concentrações de Amistar correspondem ao dobro daquelas calculadas para a Azoxistrobina.
Um setor com micélio de M. perniciosa de uma placa com 30 dias foi isolado e transferido para as placas com Azoxistrobina e para a placa controle. Para cada condição, foram mantidas no mínimo três placas como réplicas experimentais. O crescimento do fungo foi acompanhado durante um mês. Foram realizadas medições do diâmetro de duas placas depois de 7, 14, 21 e 28 dias de crescimento. Nestes mesmos intervalos, foi feito o registro fotográfico de uma placa representativa.
3. Avaliação da resposta do fungo a droga ao longo do tempo
Com intuito de avaliar a resposta imediata do fungo ao tratamento com estrobilurina, foi planejado um experimento do tipo “time course” incluindo cinco pontos de tempo (0
hora, 30 minutos, 2 horas, 4 horas e 8 horas) e duas condições de tratamento (controle e tratamento com azoxistrobina). Para cada condição, três amostras de M. perniciosa (a, b e c) foram selecionadas como réplicas biológicas.
O micélio foi cultivado em placas de meio MYEA e, após 28 dias, transferido para crescimento em meio líquido. As culturas foram mantidas sob agitação de 150 rpm a 28 oC. Após sete dias de cultivo em meio liquido, 2g de micélio foram transferidas para 20 ml de meio líquido contendo 50 mg/L de azoxistrobina ou para o mesmo volume sem fungicida (controle), os tubos foram mantidos sob agitação de 150 rpm a 28 oC até o momento da coleta.
Imediatamente após o termino da transferência do micélio entre as condições experimentais foi feita a coleta do primeiro ponto do time course, denominado ponto de “0 horas”. A partir deste momento, as demais amostras foram coletadas após 30 minutos, 2 horas, 4 horas e 8 horas. O micélio coletado foi congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 oC. A Figura 1 sumariza o esquema experimental.
Figura 1 - Representação esquemática do experimento de time course - Três réplicas biológicas foram
inoculados em meio líquido. As amostras de RNA para sequenciamento foram coletadas em cinco pontos de tempo após o tratamento com a azoxistrobina, em conjunto com as respectivas amostras controle (sem adição de fungicida).
4. Extração de RNA de M. perniciosa
O isolamento do RNA foi realizado usando o kit RNeasy Plant (Qiagen), conforme as recomendações do fabricante. A concentração e a qualidade das amostras foram avaliados com um espectofotômetro NanoDrop ND-1000 (Wilmington, EUA). A integridade de RNA foi avaliada em gel de agarose-formaldeído 1%. Antes da preparação das bibliotecas para sequenciamento, como controle de qualidade adicional, foi realizado um ensaio utilizando
LabChip RNA high sensitivity assay (Caliper), um sistema de eletroforese capilar. Os
resultados referentes ao controle de qualidade do RNA encontram-se detalhados no Apêndice I.
5. Síntese de cDNA e Real Time PCR
Antes do preparo de bibliotecas de RNA-seq, o tratamento com azoxistrobina teve seu efeito avaliado através da análise da expressão do gene Mp-aox (MP01927), cuja perfl foi avaliado em experimentos prévios e mostrou-se aumentada em resposta ao tratamento com estrobilurinas.
A enzima Super ScriptII Reverse Transcriptase (Invitrogen) foi usada nas reações de síntese de cDNA, de acordo com as recomendações do fabricante. As reações foram feita a partir de 1 µg de RNA tratado com a RQ1 RNase-Free DNase (Promega). As reações de qPCR foram calculadas para volume final de 16 µL (8 µL de SYBR Green PCR master mix, 0,8 µL de cada estoque de primer a 5 µM, 1 µL de cDNA e 5,4 µL de água). Os primers utilizados para a amplificação específica do gene Mp-aox foram: AOXRT_F (5’-GACGTGCCTTTCGGATAGAG-3’) e AOXRT_R (5’-CTTGCCAGGAGGAATGGTT-3’). Como controle endógeno, o gene constitutivo da β-actina (MP12536) foi amplificado com os primers: ACTRT_F (5’-CCCTTCTATCGTCGGTCGT-3’) e ACTRT_R (5’-AGGATACCACGCTTGGATTG-3’). Os resultados da avaliação da expressão gênica encontram-se detalhados no Apêndice I.
6. Preparação das bibliotecas de mRNA
A preparação das bibliotecas e o sequenciamento foram realizados em colaboração com o Prof. Dr. Piotr Mieckowski, no High-throughput Sequencing Facility University of North
Carolina at Chapel Hill (USA), durante um período de estágio no exterior (processo Fapesp
TruSeq mRNA Stranded Sample Prep Kit (Illumina), usando 1 µg de RNA total para cada
amostra. O preparo foi feito no robô Sciclone G3 Automated Liquid Handling Workstation (PerkinElmer). A qualidade e a concentração das bibliotecas foram realizadas por eletroforese capilar, com o uso do equipamento LabChip RNA high sensitivity assay (Caliper). Foram sequenciadas 9 lanes na plataforma Illumina HiSeq2500, resultando em uma média de 14 milhões de reads single-end de 50 bp por biblioteca.
7. Análises de bioinformática
7.1. Mapeamento dos reads e definição dos genes diferencialmente expressos
As análises de bioinformática foram realizadas em colaboração com Surojit Biswas e o Dr. Paulo J. P. L. Teixeira, com base na metodologia descrita em Teixeira et al. 2014. A qualidade e o número de reads brutos foram inicialmente acessados através do software FASTX. Os reads foram alinhados contra o genoma de M. perniciosa (obtidos do projeto genoma da vassoura de bruxa - www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura) usando o software TopHAT . O software HTSeq (Anders, Pyl, & Huber, 2015) foi utilizado no processo de read
counting, que se trata quantificação do número de reads distribuídos ao longo da sequência
de cada gene.
A análise de expressão diferencial foi realizada no pacote edgeR (Robinson, McCarthy, & Smyth, 2009), usando o método do False Discovery Rate (FDR) (Hochberg, 2016) para correção da significância obtida em testes mútiplos. As comparações foram realizadas entre amostras tratadas e controles dentro de cada ponto do tempo. Genes com FDR menor ou igual a 0,01 foram considerados diferencialmente expressos. A Figura 2 sumariza as etapas iniciais das análises de bioinformática. Os resultados de output do sequenciamento e do alinhamento contra o genoma são detalhados no Apêndice I.
Figura 2 – Sequência dos procedimentos de bioinformática – A figura sumariza as etapas de tratamento dos
dados brutos de RNA-Seq, associando as ferramentas de bioinformática aos respectivos resultados.
7.2. Classificação funcional dos genes
A versão atual do genoma de referência do fungo M. perniciosa contém 17.012 genes preditos. As anotações funcionais baseadas em Gene Ontology (GO), termos InterPro (IPR) e TCDB (transporter classification database) foram previamente definidas para cada gene durante a realização do projeto “Atlas transcriptômico da Vassoura de Bruxa” (Teixeira et al., 2014).
Os clusters hierárquicos foram construídos no software GenePattern
(http://www.broadinstitute.org/cancer/software/genepattern/) a partir dos valores de fold
change. Os diagramas de Venn foram construídos no pacote gplots do software R. Os genes
foram clusterizadas através da correlação de Pearson. Os dados foram visualizados usando a ferramenta Gene-E (http://www.broadinstitute.org/cancer/software/GENE-E/).
As análises de enriquecimento de termos InterPro e GO foram conduzidas utilizando-se o aplicativo BiNGO do software Cytoscape. Essa ferramenta indica quais termos dessas categorias se encontram diferencialmente representados no conjunto de dados. O valor de FDR menor ou igual a 0,05 foi utilizado para definir termos enriquecidos.
