Seleção dos Testes Laboratoriais

Os testes de laboratório realizados para avaliar as aves suspeitas vivas devem estar de acordo com os seguintes critérios de seleção:

 Amostra de fácil obtenção;

 Independente da viremia (no caso dos testes relativos ao USUV);  Independente da espécie;

 Sensibilidade alta;

 Preço relativamente baixo.

Começando a seleção pelos métodos de diagnóstico do Usutu, na tabela 9 estão discriminados os pontos em que os diferentes testes usados na literatura respeitam ou não os critérios de seleção.

Tabela 9 – Os testes de diagnóstico de doença do Usutu quanto aos diferentes critérios de seleção.

Teste Amostra de fácil obtenção Independent e da viremia Independent e da espécie Sensibilidade alta Preço relativamente baixo Ensaio de Imunoabsorç ão Enzimática   -   Teste de Neutralização Viral     - Teste da Inibição da Hemoaglutina ção      Microarranjo de proteínas     - Imunofluores cência indireta   -  - Reação em cadeia da polimerase  -    Hibridização in situ - -   - Imunohistoqu ímica - -   -

93 Alguns dos testes laboratoriais não podem ser usados in vivo pois são necessárias amostras de tecidos ou células. Mesmo tendo em conta a possibilidade de serem realizadas citologias e/ou biópsias, estas são mais difíceis tecnicamente, principalmente considerando o tamanho das aves que vão ser monitorizadas, para além de serem métodos de recolha de amostras bastante invasivos. Assim, no presente projeto será recolhido sangue total de relativa facilidade de recolha que pode ser usado no diagnóstico da doença do Usutu e intoxicação por OF ou CM (Cavrini et al., 2011; Gupta, 2007).

Para diagnosticar uma infeção pelo vírus Usutu através de uma metodologia direta, pode realizar-se a Transcrição Reversa da Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) em amostras de animais vivos, como o soro, plasma ou líquido encefaloraquidiano, mas esta encontra-se dependente da fase de viremia do USUV (Ashraf et al., 2015; Cavrini et al., 2011; Gaibani et al., 2012). Como a viremia dos flavivírus é transiente e de títulos baixos (Solomon, 2004), em princípio nos casos de infeções por USUV será semelhante, e como não se pretende estar dependente da viremia os exames de deteção direta serão excluídos desta fase de diagnóstico.

A alternativa é a deteção dos anticorpos que é independente da fase de viremia e permite detetar infeções ou contato com o agente que ocorreram há algum tempo (Vazquez

et al., 2011). Em termos da escolha do método de diagnóstico ficam apenas os testes

serológicos.

Tendo em conta estes critérios de seleção e características dos diferentes testes utilizados na literatura para diagnosticar a doença do Usutu, o teste de eleição a ser realizado para monitorizar as aves que ingressam vivas é o Teste de Inibição da Hemaglutinação (TIH), que obedece a todos os critérios definidos. Este teste não depende da viremia pois realiza a deteção de anticorpos (Maclachlan et al., 2017c), é barato, não depende da espécie hospedeira, tem sensibilidade alta, e a amostra que necessita é o soro, que é de fácil obtenção (Fudge, 2000; Maclachlan et al., 2017c). O Teste de Inibição da Hemaglutinação (TIH) já viu a sua utilidade no diagnóstico da doença do Usutu comprovada por Buchebner et al. (2013) e Meister et al. (2008). Neste teste um título igual ou superior a 1:20 é considerado positivo (Buchebner et al., 2013; Meister et al., 2008).

Mas tratando-se isto de um projeto de epidemiovigilância é fundamental obter dados fidedignos. Assim os resultados do TIH positivos ou duvidosos, sempre que possível, serão posteriormente analisados através do Teste de Neutralização Viral (VNT), considerado o ‘gold standard’ serológico (Allering, 2016; Lim et al., 2017; Maclachlan et al., 2017c). A metodologia que é aconselhada a usar é o Teste de Neutralização por Redução de Placas (TNRP), sendo o título definido como a maior diluição de soro com uma redução de placas de pelo menos 90%. Um título igual ou superior a 1:20 é considerado positivo (Buchebner et al., 2013; Lelli

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et al., 2008; Meister et al., 2008; Straková et al., 2015). Com a utilização do TNRP apenas

nestes casos reduz-se os custos do programa pois este exame é mais caro.

Aplicando os critérios de seleção (exceto o que se refere à viremia) para a escolha da metodologia de diagnóstico de intoxicação por OF ou CM selecionou-se a metodologia de Trudeau et al. (2007) onde se quantifica a atividade das colinesterases num pequeno volume de sangue total em papel de filtro. A quantificação da atividade das colinesterases é realizada através de uma metodologia regular mas o armazenamento é mais fácil e barato pois não necessita das temperaturas usuais de -80ºC usadas nas outras metodologias.

Os valores obtidos após a recolha de sangue devem ser comparados com os valores fisiológicos das espécies da ave analisada. A comparação deve ser realizada de forma a calcular a percentagem da inibição. Na tabela 10 encontram-se os valores fisiológicos da atividade da enzima acetilcolinesterase (EAC) obtidos no plasma das três espécies. Estes apenas servirão de valores indicativos pois a metodologia de Trudeau usa como amostra sangue total, sendo a atividade enzimática diferente, e quantifica a atividade das colinesterases totais.

Esta comparação mais lata será usada somente no início do projeto pois no decorrer do projeto obter-se-á um valor padrão da atividade das colinesterases através da metodologia de Trudeau et al.(2007) para cada espécie a monitorizar. Este valor padrão será obtido através de uma mensuração extra do valor da atividade das colinesterases no sangue total em todos os animais amostrados aquando da sua devolução ao seu habitat. Na altura da devolução, considerando que já passaram algumas semanas desde o ingresso do animal no CRAS, os valores da atividade das colinesterases estarão nos níveis fisiológicos. Esta mensuração poderá ser realizada em conjunto pelos diferentes CRAS, que com as suas amostragens combinadas obterão amostras de valores fisiológicos suficientes para servir de padrão mais rapidamente. As amostras com uma inibição superior a 50% serão considerados positivas (Ludke et al., 1975).

Tabela 10 – Valores fisiológicos da atividade da EAC no plasma de Melro-preto, Pardal-comum e Coruja-do-mato.

Espécie Atividade da EAC no plasma

Melro-preto 1,82 ± 0,11 µmol/min/mL de plasma (Westlake et al., 1983) Pardal-comum 1,57 ± 0,06 µmol/min/mL de

plasma (Westlake et al., 1983) Coruja-do-mato 2,53 ± 0,41 µmol/min/mL de

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8.1.1. Volume Necessário para os Diferentes Testes:

Principalmente em aves, que são animais de pequenas dimensões, é importante saber o volume de amostra necessário pois poderá ser incompatível com a quantidade de amostra passível de ser recolhida.

Para uma análise da atividade das colinesterases, usando a metodologia de Trudeau

et al. (2007) é necessário 44,7µL de sangue completo.

Para o diagnóstico da doença do Usutu, diferentes autores referem diferentes volumes usados, mas Buchebner et al. (2013) e Meister et al. (2008) realizaram a mesma metodologia aqui escolhida, TIH seguido de confirmação através do TNRP, e recolheram amostras de sangue entre 0,3 e 1 mL e entre 0,2 e 0,5 mL, respetivamente.

Considerando as espécies selecionadas, o Pardal-comum é a que possui um peso vivo inferior, entre 25-30 g (Coles et al., 2007a), o que significa que o intervalo de volume de sangue que se pode recolher desta espécie seria de 0,25 a 0,30 mL (1% do seu peso vivo (Campbell, 2015; Clark et al., 2009; Fudge, 2000)), o que se encontra dentro do volume necessário (0,2 – 1 mL).