Testes Serológicos

Os testes serológicos detetam a resposta imunitária humoral a um agente infecioso, sendo portanto uma deteção indireta do vírus. Estes podem detetar se um animal foi infetado por um agente, determinar se um agente patogénico se encontra associado com uma doença, e determinar se um animal respondeu devidamente à vacinação (Maclachlan et al., 2017c).

A maioria dos testes serológicos usa como amostra o soro, embora alguns testes também usem plasma. Os protocolos normalmente usam o soro refrigerado, o congelamento das amostras apenas é necessário se se passarem semanas entre a recolha da amostra e a análise (Maclachlan et al., 2017c).

3.5.1.1. Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA)

O Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA) deteta imunoglobulinas (Ig) em soro ou plasma, através de microplacas revestidas com antigénio específico para um agente patogénico. A amostra é diluída, e uma ou várias diluições são incubadas nos poços da placa de incubação. Os poços são lavados e incubados com um anticorpo; este é específico para o anticorpo da espécie a ser estudada e é conjugado com uma enzima. Depois desta segunda incubação, os poços são novamente lavados e é adicionado um substrato que desenvolve uma reação de cor que pode ser detetada visualmente ou por espectrofotometria. Em paralelo são realizados testes controlo de forma a verificar se a análise é válida ou se ocorreu algum problema aquando da análise (Fudge, 2000; Maclachlan et al., 2017c; Ritchie et al., 1994).

ELISA para a deteção de anticorpos anti-USUV é um teste serológico qualitativo e quantitativo, rápido e sensível (Fudge, 2000; Maclachlan et al., 2017c). Outro aspeto positivo é que não necessita da produção dos agentes patogénicos caso sejam usados antigénios recombinantes (Maclachlan et al., 2017c).

Uma grande desvantagem deste teste é que é específico para uma ou várias espécies, o que em aves selvagens constitui um sério problema (Fudge, 2000; Maclachlan et al., 2017c). A deteção serológica de USUV através de ELISA já foi realizada usando ELISA específico para WNV, contando com a existência de reações cruzadas dada a sua proximidade filogenética (Barbic et al., 2013; García-Bocanegra et al., 2016; Jurado-Tarifa et

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al., 2016; Lim et al., 2017; Llorente et al., 2013; Stiasny et al., 2013); e ELISA para humanos,

específico para o USUV (Allering, 2016; Gaibani et al., 2012).

3.5.1.2. Teste de Neutralização Viral (VNT)

O Teste de Neutralização Viral é considerado o ‘gold standard’ para a deteção e quantificação de anticorpos contra vírus específicos (Allering, 2016; Lim et al., 2017; Maclachlan et al., 2017c). A base do VNT é a ligação de anticorpos ao vírus infetante, prevenindo este de iniciar a infeção da célula (Maclachlan et al., 2017c).

As amostras usadas no VNT são o plasma e o soro, sendo este último o preferível (Fudge, 2000). O VNT pode ser realizado de duas formas: através do método de soro constante-vírus variável ou através do método vírus constante-soro variável. Embora o método soro constante-vírus variável seja mais sensível, este necessita de amostras de soro relativamente grandes, o que em aves é bastante difícil de obter (Maclachlan et al., 2017c). O vírus é misturado com uma ou várias diluições do soro. Estas misturas são incubadas em células apropriadas para o efeito. As células são então incubadas e monitorizadas (Fudge, 2000). A deteção do crescimento do vírus é feita pela sua capacidade de matar as células (efeitos citopáticos), ou pela capacidade de produzir antigénios que podem ser detetados através de imunofluorescência ou imunohistoquímica. A quantidade de anticorpos na amostra é determinada pela maior diluição que demonstra neutralização do vírus pelos anticorpos, sendo esta diluição que define o título (Maclachlan et al., 2017c).

O VNT é independente da espécie, podendo ser usado em qualquer espécie de ave, sendo especialmente útil em estudos de fauna selvagem. O VNT pode detetar tanto imunoglobulinas G (IgG) como imunoglobulinas M (IgM). Com uma seleção apropriada de concentração de vírus, este teste tem uma elevada sensibilidade, e se o ponto de ligação for selecionado cuidadosamente, tem ainda elevada especificidade (Fudge, 2000; Maclachlan et

al., 2017c).

Este teste tem algumas desvantagens problemáticas: o laboratório onde se realizam estes testes tem que ter instalações com culturas de tecidos e as células têm que estar sempre disponíveis, o que resulta num custo maior do teste; e têm que produzir vírus infetante para o teste. Outro ponto negativo deste teste é o facto de demorar até sete dias a se obter o resultado (Fudge, 2000; Maclachlan et al., 2017c).

O VNT foi usado na deteção de USUV em diversos estudos, sendo usado na maioria como método de confirmação dos anticorpos contra o USUV (Allering, 2016; Barbic et al., 2013; García-Bocanegra et al., 2016; Jurado-Tarifa et al., 2016; Lim et al., 2017; Llorente et

al., 2013; Pierro et al., 2013). Uma metodologia de neutralização viral bastante usada foi o

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al., 2006, 2003; Lelli et al., 2008; Meister et al., 2008; Straková et al., 2015). O resultado deste

teste deve ser o título da maior diluição com uma redução de 90% do número de placas (Buchebner et al., 2013; CDC, 2013; Lelli et al., 2008; Meister et al., 2008; Straková et al., 2015).

Para realizar este teste é necessário um laboratório com biossegurança do nível 3 (CDC, 2013).

3.5.1.3. Teste da Inibição da Hemaglutinação (TIH)

O Teste da Inibição da Hemaglutinação toma partido do facto de alguns vírus se ligarem aos eritrócitos e causarem hemaglutinação. Este método de deteção e quantificação de anticorpos no soro é sensível, específico, simples, fidedigno e barato (Fudge, 2000; Maclachlan et al., 2017c; Ritchie et al., 1994).

Neste teste, o vírus é incubado no soro amostrado, de seguida são adicionados eritrócitos e a incubação é continuada. Se ocorrer a aglutinação das células significa que não há anticorpos específicos para o vírus; se não ocorrer, tem-se a confirmação da existência de anticorpos contra o vírus a ser testado no soro. O título é relativo à maior diluição de soro que inibe a aglutinação dos eritrócitos (Fudge, 2000; Maclachlan et al., 2017c).

O TIH tem a vantagem de ser rápido e de não depender de anticorpos secundários específicos, ou seja, não é dependente da espécie hospedeira (Fudge, 2000).

A principal desvantagem deste teste é que nem todos os vírus aglutinam os eritrócitos (Fudge, 2000).

O USUV aglutina os eritrócitos (McIntosh, 1984), assim, o TIH já foi utilizado na deteção de USUV em diferentes estudos, provando a sua utilidade na deteção serológica de animais infetados (Buchebner et al., 2013; Chvala et al., 2005; Meister et al., 2008).

3.5.1.4. Imunofluorescência Indireta

O teste de Imunofluorescência Indireta é usado para a deteção e quantificação de anticorpos. Este usa células infetadas por vírus como uma matriz para captar anticorpos desse vírus: são realizadas várias diluições do soro e são colocadas em diferentes poços do substrato de células; anticorpos específicos com um marcador fluorescente são adicionados como forma de marcar a ligação com o anticorpo. A deteção é feita por microscopia de fluorescência (Maclachlan et al., 2017c; Ritchie et al., 1994).

Este é um teste rápido mas é necessário ter os vírus infetantes ou umas instalações que permitam a manutenção de culturas celulares (Maclachlan et al., 2017c). Fluorescência inespecífica é um problema comum que dificulta o diagnóstico, sendo outra desvantagem a

43 necessidade de possuir um microscópio de fluorescência (Maclachlan et al., 2017c; Ritchie et

al., 1994).

Pierro et al. (2013) detetaram USUV com o auxílio desta técnica.

3.5.1.5. Microarranjo de Proteínas

O teste de Microarranjo de Proteínas permite detetar diferentes anticorpos em amostras de soro de acordo com os péptidos na matriz. Tem assim a grande vantagem de poder pesquisar diferentes vírus simultaneamente possuindo suficiente especificidade para os distinguir (Cleton et al., 2016; Maclachlan et al., 2017c).

Cleton et al. (2016) realizaram o teste de Microarranjo de Proteínas serológico de diferentes flavivírus, incluindo o vírus Usutu, em cavalos, e comprovaram que este método de diagnóstico pode ser útil na distinção entre os diferentes flavivírus em animais que apresentem sinais clínicos compatíveis com estes.